雷公藤甲素和雷公藤紅素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物制備【技術(shù)領(lǐng)域】，公開(kāi)了雷公藤甲素和雷公藤紅素聯(lián)合用藥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。雷公藤甲素和雷公藤紅素聯(lián)合用藥，在本發(fā)明的用量比例范圍內(nèi)，兩者具有明顯的協(xié)同作用，有效提高療效，相對(duì)于單一組分或兩組分簡(jiǎn)單療效疊加更顯著，提高了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性；有效降低彼此的用藥量，從而減少毒副作用；兩者聯(lián)合使用也可節(jié)約成本，減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)了，為腫瘤的防治提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
【專(zhuān)利說(shuō)明】雷公藤甲素和雷公藤紅素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物制備【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及雷公藤甲素和雷公藤紅素聯(lián)合用 藥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是世界上嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，目前治療腫瘤的主要方 法有手術(shù)治療、化學(xué)療法和放射療法?；熥鳛槟[瘤治療的三大傳統(tǒng)手段之一，在腫瘤治療 中占據(jù)著重要地位。然而，目前臨床上使用的化療藥物大多對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的選擇性不強(qiáng)， 且毒副作用大，并多具有免疫抑制作用。因此，從天然藥物中研究開(kāi)發(fā)高效低毒的新型抗腫 瘤藥物一直是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。聯(lián)合用藥是近年來(lái)腫瘤化療領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，大量 的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明，聯(lián)合藥物療法在腫瘤的防治和康復(fù)方面有特效。其與傳統(tǒng)的單藥 治療相比具有多種優(yōu)點(diǎn)，如可以同時(shí)靶向多種重要信號(hào)通路、克服腫瘤耐藥、降低毒副作用 等。
[0003] 雷公藤甲素（Triptolide，Trip)是雷公藤屬雷公藤、昆明山海棠等植物中的主要 有效成分，雷公藤紅素（南蛇藤素，CelastroLCela)是雷公藤屬雷公藤和南蛇藤屬南蛇藤 等植物中的主要有效成分。現(xiàn)有研究表明雷公藤甲素和雷公藤紅素對(duì)實(shí)體瘤均有良好的抗 腫瘤活性，但明顯的毒副作用限制了其臨床應(yīng)用。聯(lián)合用藥的目的是獲得協(xié)同作用，從而提 高療效，降低毒副作用，減緩耐藥性的發(fā)生。目前，尚沒(méi)有雷公藤甲素和雷公藤紅素聯(lián)合使 用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明在體內(nèi)外都研究了雷公藤甲素和雷公藤紅素聯(lián)合用藥的抗腫瘤 活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供雷公藤甲素和 雷公藤紅素聯(lián)合用藥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 雷公藤甲素（Triptolide)和雷公藤紅素（Celastrol)聯(lián)合用藥在制備抗腫瘤藥 物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述的雷公藤甲素與雷公藤紅素的用量摩爾比為0. 001:1?1:1。
[0008] 本發(fā)明所述的雷公藤甲素和雷公藤紅素的聯(lián)合用藥可顯著的引起腫瘤細(xì)胞周期 阻滯作用，使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，主要用于但不局限于制備 治療肺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、肝癌及結(jié)腸癌的藥物。
[0009] 所述的聯(lián)合用藥可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)雷公藤甲素和雷公藤紅素相互的敏感性，引起 腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS含量劇增，并可有效地提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，能極大促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 凋亡的發(fā)生。
[0010] 所述的雷公藤甲素的有效劑量為〇. 4mg/kg，雷公藤紅素的有效劑量為2mg/kg。
[0011] 所述的藥物含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
[0012] 本發(fā)明所述雷公藤甲素和雷公藤紅素聯(lián)合用藥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，指可 通過(guò)抑制H1299、H157、H460、H1650、H1944、0VCAR3、SK0V3、SIHA、HELA、BGC823、BEL7402 和 SW480等不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以達(dá)到治療腫瘤的作用；可以引起H1299和H157細(xì)胞 周期阻滯，使細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖；可以引起H1299和H157細(xì)胞發(fā) 生凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖；可通過(guò)引起H1299和H157細(xì)胞內(nèi)活性氧含量劇增，從而 誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖；也可通過(guò)抑制熱休克家族蛋白HSP90、HSP70、 HSP27以及HSP90客戶蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本發(fā)明所述雷公藤甲素和雷公藤 紅素聯(lián)合用藥可以抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。
[0013] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0014] 1、雷公藤甲素和雷公藤紅素聯(lián)合用藥，在本發(fā)明的用量比例范圍內(nèi)，兩者具有明 顯的協(xié)同作用，有效提高療效，相對(duì)于單一組分或兩組分簡(jiǎn)單療效疊加更顯著，提高了對(duì)腫 瘤細(xì)胞的殺傷性。
[0015] 2、在保證同樣治療效果的情況下，雷公藤甲素和雷公藤紅素的聯(lián)合使用可以降低 彼此的用藥量，從而減少毒副作用。
[0016] 3、雷公藤甲素和雷公藤紅素的聯(lián)合使用也可節(jié)約成本，減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)了， 本發(fā)明為腫瘤的防治提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為利用MTT方法檢測(cè)不同腫瘤細(xì)胞在雷公藤甲素或雷公藤紅素單獨(dú)處理后的 存活率。
[0018] 圖2為用MTT方法檢測(cè)肺癌細(xì)胞H1299、H157、H460、H1650經(jīng)雷公藤甲素和雷公 藤紅素單獨(dú)處理及聯(lián)合處理后細(xì)胞的存活率。
[0019] 圖3為用MTT方法檢測(cè)肺癌細(xì)胞H1944、卵巢癌細(xì)胞0VCAR3和SK0V3、宮頸癌細(xì)胞 SIHA和HELA、胃癌細(xì)胞BGC823、肝癌細(xì)胞BEL7402和結(jié)腸癌細(xì)胞SW480經(jīng)雷公藤甲素和雷 公藤紅素單獨(dú)處理及聯(lián)合處理后細(xì)胞的存活率。
[0020] 圖4為利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)經(jīng)雷公藤甲素和雷公藤紅素分別單獨(dú)處理及聯(lián)合處理 后肺癌細(xì)胞H1299和H157的細(xì)胞周期分布。
[0021] 圖5為利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)經(jīng)雷公藤甲素和雷公藤紅素分別單獨(dú)處理及聯(lián)合處理 后肺癌細(xì)胞H1299和H157的細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果。
[0022] 圖6為利用熒光顯微鏡檢測(cè)對(duì)經(jīng)雷公藤甲素和雷公藤紅素分別單獨(dú)處理及聯(lián)合 處理后肺癌細(xì)胞H1299和H157胞內(nèi)活性氧水平（ROS)。
[0023] 圖7為利用WesternBlot法評(píng)價(jià)經(jīng)雷公藤甲素和雷公藤紅素分別單獨(dú)處理及聯(lián)合 處理后肺癌細(xì)胞H1299和H157胞內(nèi)熱休克蛋白家族及其他相關(guān)蛋白的影響。
[0024] 圖8為在裸鼠動(dòng)物中，雷公藤甲素和雷公藤紅素單獨(dú)給藥及聯(lián)合給藥后小鼠移植 瘤體積的生長(zhǎng)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0026] 本發(fā)明實(shí)施例使用的所有細(xì)胞株均來(lái)源于ATCC，本發(fā)明使用的雷公藤甲素和雷公 藤紅素購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司
[0027]實(shí)施例1:檢測(cè)不同腫瘤細(xì)胞對(duì)雷公藤甲素或雷公藤紅素的敏感性
[0028] 用MTT法檢測(cè)不同腫瘤細(xì)胞對(duì)雷公藤甲素或雷公藤紅素的敏感性。將人肺癌細(xì)胞 H1299、H157、H460、H1650 和H1944、卵巢癌細(xì)胞 0VCAR3 和SK0V3、宮頸癌細(xì)胞SIHA和HELA、 胃癌細(xì)胞BGC823、肝癌細(xì)胞BEL7402和結(jié)腸癌細(xì)胞SW480以每孔3000?5000個(gè)細(xì)胞的數(shù) 量接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的雷公藤甲素或雷公藤紅素的PBS溶 液。培養(yǎng)68h后，每孔加入10μL濃度為5mg/ml的MTT再培養(yǎng)4h，然后棄培養(yǎng)液每孔加入 100μL的DMS0,用酶標(biāo)儀在490nm讀取每孔的吸光值。用Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度值 (IC5tl)15具體結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。
[0029] 從表1可以看出，雷公藤甲素和雷公藤紅素對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞的IC5tl值都處在一 個(gè)比較小的范圍內(nèi)，其中雷公藤甲素對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞的IC5tl值在0. 007?0. 124μM范圍 內(nèi)，而雷公藤紅素對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞的IC5tl值在1. 53?6. 44μM范圍內(nèi)。表明雷公藤甲素 和雷公藤紅素對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞都具有較好的抑制增殖作用。
[0030] 實(shí)施例2 :檢測(cè)雷公藤甲素或雷公藤紅素單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對(duì)不同腫瘤細(xì)胞 存活率的影響
[0031]將人肺癌細(xì)胞Η1299、Η157、Η460、Η1650 和Η1944、卵巢癌細(xì)胞 0VCAR3 和SK0V3、 宮頸癌細(xì)胞SIHA和HELA、胃癌細(xì)胞BGC823、肝癌細(xì)胞BEL7402和結(jié)腸癌細(xì)胞SW480以每孔 3000?5000個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同的雷公藤甲素和雷公藤 紅素的配比的PBS溶液。培養(yǎng)68h后，每孔加入10μL濃度為5mg/ml的MTT再培養(yǎng)4h，然 后棄培養(yǎng)液每孔加入100μL的DMS0,用酶標(biāo)儀在490nm讀取每孔的吸光值。用CompuSyn 軟件進(jìn)行協(xié)同作用綜合因子（Combinationindex,Cl)分析。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和表1。
[0032] CI值表示藥物聯(lián)合作用時(shí)的一個(gè)復(fù)合指數(shù)，CI值小于、等于和大于1分別表示藥 物具有協(xié)同作用、增效作用和拮抗作用。從表1可以看出，雷公藤甲素和雷公藤紅素對(duì)不同 的腫瘤細(xì)胞聯(lián)合使用時(shí)，其CI值基本都在小于1的范圍內(nèi)，表示雷公藤甲素和雷公藤紅素 在本發(fā)明的用量范圍內(nèi)聯(lián)合使用具有很好的協(xié)同作用。
[0033] 表1雷公藤甲素或雷公藤紅素單獨(dú)使用的不同腫瘤細(xì)胞的IC5tl值及聯(lián)合使用時(shí)的 CI值
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 雷公藤甲素和雷公藤紅素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷公藤甲素和雷公藤紅素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特 征在于：所述的雷公藤甲素與雷公藤紅素的用量摩爾比為0.001:1?1:1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷公藤甲素和雷公藤紅素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特 征在于：所述的腫瘤包括肺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、肝癌及結(jié)腸癌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷公藤甲素和雷公藤紅素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其 特征在于：所述的雷公藤甲素的有效劑量為0. 4mg/kg，所述雷公藤紅素的有效劑量為2mg/ kg。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷公藤甲素和雷公藤紅素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特 征在于：所述的藥物含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
【文檔編號(hào)】A61K31/585GK104398526SQ201410609274
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】石智, 蔣起韋, 程科軍, 魏星, 呂敏, 張旭 申請(qǐng)人:暨南大學(xué), 麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 麗水市納麗斯生物科技有限公司, 浙江中醫(yī)藥大學(xué), 南京中醫(yī)藥大學(xué)