表達(dá)雞il2重組新城疫病毒及其在疫苗中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞新城疫病毒毒株及其在制備雞新城疫病疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的雞新城疫病毒毒株，其制備方法包括如下步驟：將重組質(zhì)粒pBrClone30-chIL2、pBL-N質(zhì)粒、pBL-P質(zhì)粒和pBL-L質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)，得到所述雞新城疫病毒毒株；所述重組質(zhì)粒pBrClone30-chIL2為具有序列表的序列1所示的DNA分子的質(zhì)粒。序列表的序列3自5ˊ末端2703-18414位核苷酸即為rClone30-chIL2病毒的基因組DNA。本發(fā)明通過在現(xiàn)有新城疫活疫苗基因組中引入分子佐劑chIL2，可以有效提高免疫效果，提高免疫保護(hù)率。本發(fā)明對于新城疫病的防治具有重大價值。
【專利說明】表達(dá)雞IL2重組新城疫病毒及其在疫苗中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種表達(dá)雞IL2重組新城疫病毒及其在制備雞新城疫病疫苗中的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV)是危害養(yǎng)禽界的烈性傳染病之一， 已被國際獸疫局（The Office International des Epizooties, 0IE)列定為A類傳染疾病。 如今，雖然沒有發(fā)生世界性的大流行，但局部地區(qū)的疫情時有發(fā)生，給養(yǎng)禽界帶來巨大經(jīng)濟(jì) 損失，我國每年用于防治新城疫病（Newcastle Disease, ND)的疫苗達(dá)到上億元。目前，滅 活疫苗和弱毒疫苗在ND免疫預(yù)防中最為常用。
[0003] 白細(xì)胞介素2 (Interleukin 2, IL2)主要是由T淋己細(xì)胞或T淋己細(xì)胞系產(chǎn)生的 一類重要的淋己因子，在抗腫瘤、抗毒素、免疫調(diào)節(jié)及感染性疾病的治療中具有重要作用。
[0004] 對哺乳動物的IL2在B、T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞、單核細(xì)胞殺傷活性等 功能中發(fā)揮著重要的作用，甚至可對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。雞的IL2作為第一個克 隆的非哺乳動物的IL2,又與哺乳動物的IL2分子有明顯的不同。
[000引除了 T細(xì)胞外，IL2對免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞都有直接或間接的影響。在間接的方 面，IL2分別刺激IFNa、粒細(xì)胞巨瞻細(xì)胞集落刺激因子和B細(xì)胞生長因子（即調(diào)節(jié)巨瞻細(xì) 胞及B細(xì)胞活性的細(xì)胞因子）的產(chǎn)生，所W r化L2的產(chǎn)生為我們研究禽免疫學(xué)提供了一個 有用的工具，同樣也可作為一種潛在疫苗增強(qiáng)劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)雞IL2重組新城疫病毒及其在制備雞新城疫病疫 苗中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的雞新城疫病毒毒株(命名為rClone30-chIL2病毒)，其制備方法包括 如下步驟；將重組質(zhì)粒地rClone30-chIL2、P化-N質(zhì)粒、P化-P質(zhì)粒和地心1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺 乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)，得到所述雞新城疫病毒毒株；所述重組質(zhì)粒地rClone30-chIL2為具有 序列表的序列1所示的DNA分子的質(zhì)粒。序列表的序列3即為rClone30-chIL2病毒的基 因組DNA。
[0008] 所述重組質(zhì)粒rClone30-chIL2具體可為序列表的序列3所示的質(zhì)粒。
[0009] 所述哺乳動物細(xì)胞具體可為BHK-21細(xì)胞。
[0010] rClone30-chIL2病毒的制備方法具體如下： (1) 將所述重組質(zhì)粒地rClone3〇-chIL2、P化-N質(zhì)粒、P化-P質(zhì)粒和地心!^質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 BHK-21細(xì)胞(每1 X 106個細(xì)胞轉(zhuǎn)染1 y g重組質(zhì)粒地rClone30-chIL2、0. 5 y g P化-N質(zhì)粒、 0. 25 y甜化-P質(zhì)粒和0. 1 y甜化-L質(zhì)粒），置于5% C02、37°C環(huán)境中靜置培養(yǎng)72h ; (2) 取步驟（1)得到的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，離也收取細(xì)胞上清液，然后接種于9-11 日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37C環(huán)境中培養(yǎng)72h，收集雞胚尿囊液； (3) 取步驟（2)得到的雞胚尿囊液，接種于新的9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37°C 環(huán)境中培養(yǎng)72h，收集雞胚尿囊液； (4) 取步驟（3)得到的雞胚尿囊液，接種于新的9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37C 環(huán)境中培養(yǎng)72h，收集雞胚尿囊液； (5) 將步驟（2)得到的雞胚尿囊液、步驟（3)得到的雞胚尿囊液和步驟（4)得到的雞胚 尿囊液混合，得到混合液，即為rClone30-chIL2病毒液。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)一種雞新城疫病毒毒株(命名為rClone30-chIL2病毒)，其基因組 DNA如序列表的序列3所示。
[0012] 本發(fā)明還保護(hù)W上任一所述的雞新城疫病毒毒株在制備雞新城疫病疫苗中的應(yīng) 用。
[0013] 本發(fā)明還保護(hù)一種雞新城疫病疫苗，包括W上任一所述的雞新城疫病毒毒株。
[0014] 本發(fā)明提供一種新的雞新城疫病毒毒株，命名為rClone30-chIL2,因此簡稱毒株 rClone30-chIL2。毒株rClone30-chIL2是將chIL2多膚的編碼基因插入到雞新城疫病毒 毒株Clone30 (簡稱毒株Clone30,弱毒株，為現(xiàn)有的新城疫病活疫苗)的基因組的F基因和 HN基因之間得到的重組病毒株。毒株rClone30-chIL2免疫雞群后，7 d后攻毒，重組病毒 具有較好的保護(hù)效果，為進(jìn)一步提高NDV重組新城疫疫苗的早期免疫效果提供了新思路。
[0015] 本發(fā)明構(gòu)建的重組新城疫病毒可視為基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制備為任 何常規(guī)制劑，如凍干粉針制劑、液體疫苗制劑等。
[0016] 本發(fā)明通過在現(xiàn)有新城疫活疫苗基因組中引入分子佐劑chIL2,能夠在疫苗免疫 早期刺激雞體內(nèi)產(chǎn)生NDV抗體并增強(qiáng)體液免疫水平，提高免疫保護(hù)效率。本發(fā)明對于新城 疫病的防治具有重大價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為重組質(zhì)粒地rClone30-chIL2的元件示意圖。
[001引圖2為混合液的HA和HI效價結(jié)果。
[0019] 圖3為PCR鑒定電泳圖。
[0020] 圖4為實施例2的結(jié)果。
[0021] 圖5為實施例3的結(jié)果。
[0022] 圖6為實施例4的結(jié)果。
[0023] 圖7為實施例5的結(jié)果； 圖8為實施例6的結(jié)果。

【具體實施方式】
[0024] W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設(shè)置H次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。
[00巧]提及"地rClone30 質(zhì)粒"的文獻(xiàn)；"E；nhancement of anti-tumor activity of Newcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase", Zheng LV,Asian Pac J Cancer Ptev.。
[0026] 提及"p化-N質(zhì)粒V'P化-P質(zhì)粒"和"p化-L質(zhì)粒"的文獻(xiàn)：Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drug candidate for cancer immunotherapy, Fuliang Bai, Immunology letters.。
[0027] pBrClone30質(zhì)粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和 L基因，其中Sac II和MluI酶切識別位點位于F基因和HN基因么間。將pBrClone30質(zhì)粒、 P化-N質(zhì)粒、P化-P質(zhì)粒和地心1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)（P化-N質(zhì)粒、P化-P質(zhì)粒 和PBkL質(zhì)粒起輔助作用，P化Clone30質(zhì)粒提供病毒的全基因組），得到毒株Clone30。
[0028] 提及"NDV強(qiáng)毒BJ株"的文獻(xiàn)；"雞新城疫病毒強(qiáng)毒株的分離鑒定及其遺傳變異分 析"，校海霞，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩±學(xué)位論文。
[0029] BHK-21 細(xì)胞；ATCC 編號為 C化-13001。
[0030] DF-I 細(xì)胞；ATCC 編號為 C化-12203。
[003。 SPF級白色來航雞：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中也。
[0032] chIL2多膚的全稱為雞白細(xì)胞介素2,如序列表的序列2所示，其編碼基因的開放 閱讀框如序列表的序列1自5'末端第15至446位核巧酸所示。
[0033] 完全DMEM培養(yǎng)基即為含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
[0034] 雞血紅細(xì)胞凝集（HA)試驗的具體方法如下；（1)在血凝板第一排的1-12孔各加入 25 y L生理鹽水；似在第1孔中加入25 y L待測病毒液，混勻后吸25 y L到第2孔，如此倍 比稀釋直到第10孔，第10孔混勻后棄除25 y L ; (3)在1-12孔中各加入25 y L 1%雞血紅 細(xì)胞；（4)震蕩后室溫靜置20-30min，觀察結(jié)果。
[00巧]雞血紅細(xì)胞凝集抑制（HI)試驗的具體方法如下；（1)在血凝板的1-12孔各加 入25 UL生理鹽水；（2)第1孔加入待檢血清25 UL混勻后吸25 UL至第2孔，倍比稀釋 直至第10孔，第10孔混勻后棄除25 y L ; (3)在1-12孔中各加入25 y L實施例1制備的 rClone30病毒液（4個血凝單位)，室溫靜置30min ; (4)在1-12孔中各加入25 y L 1%雞血 紅細(xì)胞；（5)震蕩后室溫靜置30-40min，觀察結(jié)果。
[0036] 實施例1、rClone30-chIL2病毒液的制備 一、重組質(zhì)粒的合成 1、合成序列表的序列1所示的chIL2基因序列。
[0037] 合成序列表的序列1中，自5 '末端第1至6位核巧酸為限制性內(nèi)切酶Sac II的識 別序列，第9-14位核巧酸為Kozac序列，第15至446位核巧酸為chIL2多膚的編碼基因， 第447至452位核巧酸為限制性內(nèi)切酶MluI的識別序列。
[003引 2、用限制性內(nèi)切酶SacII和MluI雙酶切步驟1得到的雙鏈DNA分子，回收酶切產(chǎn) 物。
[0039] 3、用限制性內(nèi)切酶SacII和MluI雙酶切地rClone30質(zhì)粒，回收約160(K)bp的載 體骨架。
[0040] 4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒地rClone30-chIL2。重組質(zhì)粒地rClone30- chIL2的核巧酸序列如序列表的序列3所示。重組質(zhì)粒 地rClone3〇-chIL2的元件示意圖見圖1。
[0041] 二、重組病毒的制備 I、將重組質(zhì)粒地rClone30-chIL2、p化-N質(zhì)粒、P化-P質(zhì)粒和地心1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞(每IXlO6個細(xì)胞約轉(zhuǎn)染Iy g重組質(zhì)粒地rClone30-chIL2、0. 5y g P化-N質(zhì)粒、 0. 25 y g P化-P質(zhì)粒和0. 1 y甜化-L質(zhì)粒），置于5% C02、37°C環(huán)境中靜置培養(yǎng)72h。
[0042] 2、取步驟1得到的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，離也收取細(xì)胞上清液，然后接種于 9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37C環(huán)境中培養(yǎng)72h，收集雞胚尿囊液(該雞胚尿囊液的HA 效價為4096, HI效價為256)。
[0043] 3、取步驟2得到的雞胚尿囊液，接種于新的9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37C 環(huán)境中培養(yǎng)72h，收集雞胚尿囊液(該雞胚尿囊液的HA效價為2048, HI效價為1024)。
[0044] 4、取步驟3得到的雞胚尿囊液，接種于新的9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37C 環(huán)境中培養(yǎng)72h，收集雞胚尿囊液(該雞胚尿囊液的HA效價為1024, HI效價為512)。
[0045] 5、將步驟2得到的雞胚尿囊液、步驟3得到的雞胚尿囊液和步驟4得到的雞胚尿 囊液混合，得到混合液(該混合液的HA效價為2048, HI效價為512,見圖2)。
[0046] 6、取步驟5得到的混合液，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Fl和Rl組成的引物 對進(jìn)行 PCR 鑒定（Fl ;5 ' -CCGCGGACGCCACCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTG-3 ' ;R1 ;5 ' -ACG CGTTTATTTTTGCAGATATCTCACAAAG-3 ')，結(jié)果見圖3。PCR擴(kuò)增片段大小約為43化P，與預(yù)期 相符。
[0047] 結(jié)果表明，成功制備了具備感染性的表達(dá)chIL2多膚的NDV病毒，將步驟5得到的 混合液命名為rClone30-chIL2病毒液。
[0048] H、對照病毒的制備 用地rClone30質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒地rClone30-chIL2進(jìn)行步驟二的1至5,得到的混合 液命名為rClone30病毒液。
[0049] 實施例2、檢測病毒液中chIL2的表達(dá)量 l、W〇. 1 MOI重組新城疫病毒rClone30-chIL2感染化pG2細(xì)胞。感染72 h后，收獲 細(xì)胞上清，W含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基作為調(diào)零對照，Mock對照組為不加任何試劑或者 病毒的DF-I細(xì)胞。
[0050] 2、用實施例1制備的rClone30病毒液代替rClone30-chIL2病毒液，其它同步驟 Io
[0051] 3、利用重組NDV rClone30-chIL2感染的DF-I細(xì)胞上清為抗原，采用雙抗夾也方 法，并按照試劑盒說明書進(jìn)行化ISA檢測。
[0052] 結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，rClone30-chIL2感染細(xì)胞后，chIL2的蛋白表達(dá)量明顯高 于rClone30,差異極顯著（p<0. 01)。
[0053] 實施例3、rClone30-chIL2病毒與rClone30病毒在宿主細(xì)胞中的動力生長曲線 1、將對數(shù)生長期的DF-I細(xì)胞接種于六孔板，W 0. IMOI的劑量將實施例1制備的 rClone30-chIL2病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全DMEM培養(yǎng)基稀稀釋）接種于細(xì)胞 單層，采用含Iy g/血膜蛋白酶的完全DMEM培養(yǎng)基，置于5% C02、37°C環(huán)境中靜置培養(yǎng)96h， 每隔2化取上清液并測定TCIDw。
[0054] 2、用實施例1制備的rClone30病毒液代替rClone30-chIL2病毒液，其它同步驟 Io
[00巧]結(jié)果見圖5。rClone30-chIL2病毒與rClone30病毒保持著一致的繁殖滴度。結(jié) 果表明，chIL2的編碼基因的插入并不影響rClone30病毒的增殖能力。
[0056] 實施例4、rClone30-chIL2病毒或rClone30病毒免疫雞后的HI抗體效價 參照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，青年雞的抗體效價>51og2時判為合格。特別是在30日齡前后抗體 水平低于此標(biāo)準(zhǔn)，如果在此期間有強(qiáng)毒侵入，就有可能暴發(fā)新城疫。如果雞群能在此期間達(dá) 到此標(biāo)準(zhǔn)，將不受新城疫病毒的威脅。
[0057] 取30日齡的SPF級白色來航雞，隨機(jī)分為3組，每組10只。分別處理如下(均為 單次免疫）； 第一組：每只通過滴鼻點眼的方式免疫200 y L實施例1制備的rClone30-chIL2 病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全DMEM培養(yǎng)基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為 lO^IDso/O. ImD ； 第二組：每只通過滴鼻點眼的方式免疫200 y L實施例1制備的rClone30病毒液 (rClone30病毒液用完全DMEM培養(yǎng)基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為IO5TCIDwA). Iml); 第H組；每只通過滴鼻點眼方式免疫200 y L 0. 9%生理鹽水。
[0058] 分別于免疫后7d、14 d、21d翅靜脈采血分離血清，檢測HI效價。
[0059] 結(jié)果見圖6。免疫后7d，第一組血清的HI效價為4.51og2,第二組的效價 為2. 81og2,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析呈差異顯著（p<0. 05)，且該兩組均與對照組呈差異極顯著 (p<0. 01);在免疫14 d和21 d后，rClone30-chIL2組HI抗體平均效價均達(dá)到51og2W上， 略高于rClone30組，但差異不顯著（p〉0. 05)，而該兩組組HI抗體效價仍與對照組呈差異 極顯著（p<〇. 01)。
[0060] 實施例5重組病毒rClone30-chIL2或rClone30免疫含母源抗體的雞后的HI抗 體效價(母源抗體高的情況） 在養(yǎng)雞生產(chǎn)中，一個雞群的母源抗體水平往往參差不齊，其中一些母源抗體水平較低 的維雞在其幼齡階段易感染野毒和帶毒，當(dāng)其它維雞母源抗體水平下降時，它們亦依次受 感染，使野毒在雞群中的傳播連綿不斷，遺留很大的潛在威脅。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，蛋雞出維 后在不同日齡測定其新城疫母源抗體水平，結(jié)果顯示；1日齡母源抗體為6. 61og2; 7日齡時 抗體水平下降為4. 71og2 ;到10日齡時抗體水平降到41og2 W下，如果W抗體效價41og2為 臨界保護(hù)值，1日齡維雞母源抗體保護(hù)率為95%，7日齡母源抗體保護(hù)率為80%，到10日齡時 母源抗體保護(hù)率只有50%。
[0061] 取1日齡的含母源抗體的白色來航雞，隨機(jī)分為3組，每組10只。分別處理如下 (均為單次免疫）； 第一組：組內(nèi)每只雞采用滴鼻點眼的方式免疫200 y L實施例1制備的 rClone30-chIL2病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全培養(yǎng)基稀釋，用于免疫的病毒液的 濃度為 1〇5TCIDs〇/0. Iml); 第二組：組內(nèi)每只雞采用滴鼻點眼的方式免疫200 y L實施例1制備的rClone30病毒 液（rClone30病毒液用完全培養(yǎng)基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為1〇5tCIDw/〇. Iml); 第H組：組內(nèi)每只雞采用滴鼻點眼的方式免疫200 y L生理鹽水。
[0062] 分別于免疫后OcU 6d翅靜脈采血分離血清，檢測HI效價。
[0063] 結(jié)果見圖7。免疫后7d，第一組血清的HI效價為6. 51og2高于51og2,第二組 的效價為4. 751og2,即在母源抗體高的情況下rClone30-chIL2病毒液將可W實現(xiàn)早期 有效保護(hù)效果，使雞免受新城疫病毒的威脅，而rClone30病毒液的保護(hù)效果明顯低于 rClone3〇-chIL2 病毒液。
[0064] 實施例6重組病毒rClone30-chIL2或rClone30免疫含母源抗體的雞后的HI抗 體效價(母源抗體低的情況） 在養(yǎng)雞生產(chǎn)中，一個雞群的母源抗體水平往往參差不齊，其中一些母源抗體水平較低 的維雞在其幼齡階段易感染野毒和帶毒，當(dāng)其它維雞母源抗體水平下降時，它們亦依次受 感染，使野毒在雞群中的傳播連綿不斷，遺留很大的潛在威脅。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，蛋雞出維 后在不同日齡測定其新城疫母源抗體水平，結(jié)果顯示；1日齡母源抗體為6. 61og2; 7日齡時 抗體水平下降為4. 71og2 ;到10日齡時抗體水平降到41og2 W下，如果W抗體效價41og2為 臨界保護(hù)值，1日齡維雞母源抗體保護(hù)率為95%，7日齡母源抗體保護(hù)率為80%，到10日齡時 母源抗體保護(hù)率只有50%。
[0065] 取1日齡的含母源抗體的白色來航雞，隨機(jī)分為3組，每組10只。分別處理如下 (均為單次免疫）； 第一組：組內(nèi)每只雞采用滴鼻點眼的方式免疫200 y L實施例1制備的 rClone30-chIL2病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全培養(yǎng)基稀釋，用于免疫的病毒液的 濃度為 1〇5TCIDs〇/0. Iml); 第二組：組內(nèi)每只雞采用滴鼻點眼的方式免疫200 y L實施例1制備的rClone30病毒 液（rClone30病毒液用完全培養(yǎng)基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為1〇5tCIDw/〇. Iml); 第H組：組內(nèi)每只雞采用滴鼻點眼的方式免疫200 y L生理鹽水。
[0066] 分別于免疫后OcU 6d翅靜脈采血分離血清，檢測HI效價。
[0067] 結(jié)果見圖8。免疫后7d，第一組血清的HI效價為5. 91og2,第二組的效價為 6. 31og2,即在母源抗體低的情況下，rClone30-chIL2病毒液早期有效保護(hù)效果更好，使雞 免受新城疫病毒的威脅。
[0068] 實施例7、攻毒試驗 將30日齡SPF級白色來航雞隨機(jī)分為3組，每組30只。分別處理如下(均為單次免 疫）； 第一組：實驗第1天，每只通過滴鼻點眼方式免疫200 UL實施例1制備的 rClone30-chIL2病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全DMEM培養(yǎng)基稀釋，用于免疫的病毒 液的濃度為 IO5TCIDwA). Iml); 第二組；實驗第1天，每只通過滴鼻電眼方式免疫200化實施例1制備的rClone30 病毒液（rClone30病毒液用完全DMEM培養(yǎng)基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為 lO^IDso/O. ImD ； 第H組；實驗第1天，每只通過滴鼻點眼方式免疫200 y L 0. 9%生理鹽水。
[0069] 實驗第8天，采用NDV強(qiáng)毒BJ株進(jìn)行攻毒(每只雞采用IO4 ELDw的劑量經(jīng)肌肉注 射途徑攻毒，攻毒體積為0. 1ml)，實驗第18天，統(tǒng)計各組的發(fā)病與死亡情況。結(jié)果見表1。
[0070] 表1各紐的發(fā)病與死t情況統(tǒng)計（H次試齡的平拘值）

【權(quán)利要求】
1. 一種雞新城疫病毒毒株，其制備方法包括如下步驟：將重組質(zhì)粒PBrClone30-chIL2、pBL-N質(zhì)粒、pBL-P質(zhì)粒和pBL-L質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)，得 到所述雞新城疫病毒毒株；所述重組質(zhì)粒pBrCl〇ne30-ChIL2為具有序列表的序列1所示的 DNA分子的質(zhì)粒。
2. 如權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒毒株，其特征在于：所述重組質(zhì)粒 pBrClone3〇-chIL2為序列表的序列3所示的質(zhì)粒。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的雞新城疫病毒毒株，其特征在于：所述哺乳動物細(xì)胞為 BHK-21 細(xì)胞。
4. 一種雞新城疫病毒毒株，其基因組DNA如序列表的序列3自5末端第所示。
5. 權(quán)利要求1至4中任一所述的雞新城疫病毒毒株在制備雞新城疫病疫苗中的應(yīng)用。
6. -種雞新城疫病疫苗，包括權(quán)利要求1至4中任一所述的雞新城疫病毒毒株。
【文檔編號】A61P31/14GK104357409SQ201410619456
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月7日
【發(fā)明者】馮明芳, 李德山, 張?zhí)煸? 王卉, 何金嬌 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)