蜚蠊抗肝纖維化活性提取物的制備及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蜚蠊提取物的制備方法及檢測方法，制備方法包括：將蜚蠊成蟲殺死干燥后粉碎；將所得粉末加入醇溶劑進行提取并過濾；將所得濾液減壓濃縮至浸膏無醇味；在油水分離裝置中加入所得浸膏和熱水，進行攪拌，靜置后放出水層，收集濾液并過濾；將蜚蠊脫脂提取物經(jīng)過大孔吸附樹脂柱吸附，再用水及不同濃度的醇洗脫；將所得洗脫液過濾、減壓濃縮、干燥后粉碎，即得抗肝纖維化的活性提取物；分別測定提取物活性成分中總肽、粘多糖、多元醇及游離氨基酸的含量，當前對于蜚蠊提取物多用于燙傷、燒傷、組織修、口腔護理及心血管疾病方面的應用，本發(fā)明使蜚蠊的藥用價值得到進一步的提升。
【專利說明】蜚蠊抗肝纖維化活性提取物的制備及檢測方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術領域】，具體而言，本發(fā)明涉及一種蜚蠊抗肝纖維化活性提取物的制備方法和活性組分的檢測方法。

【背景技術】
[0002]蜚蠊(Blattodea)屬昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱蟑螂。它在地球上已經(jīng)生存了 4億年，是世界上生命力最強、最古老、至今繁衍最成功的昆蟲類群之一。蜚蠊一直被人類視為害蟲，但它面對人類的各種殺滅手段卻能頑強繁衍至今，其體內(nèi)無疑具有最優(yōu)秀的生物活性物質(zhì)和特殊生理機制。
[0003]近年來，隨著我國對傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源研究開發(fā)的重視，科學工作者對這一資源豐富的昆蟲進行了應用方面的研究開發(fā)，取得了可喜的成就，并以蜚蠊藥材為原料，先后研發(fā)的新藥有:“康復新液”、“肝隆膠囊”、“心脈隆注射液”，其中“肝隆膠囊”和“心脈隆注射液”為國家級二類新藥(中藥)。“康復新液”用于治療口腔潰瘍、十二指腸潰瘍、燒傷、燙傷、褥瘡、肺結核輔助治療等，為國家中藥保護品種、國家醫(yī)保乙類藥物；“肝隆膠囊”用于治療慢性乙型肝炎，肝硬化及乙肝病毒攜帶等肝臟疾??；“心脈隆注射液”主治慢性充血性心力衰竭，慢性肺原性心臟病，對繼發(fā)性肺心病、心肌病的心衰治療效果特別明顯。郝芳芳等研究了美洲大蠊(periplaneta americana,為蜚蠊的一種)乙醇提取物對免疫性肝纖維化大鼠肝功能的影響[文獻:郝芳芳，李春艷，賴泳，等.美洲大蠊對免疫性肝纖維化大鼠肝功能的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40 (18):9717.]，結果表明美洲大蠊乙醇提取物對免疫性肝纖維化具有一定的防治作用，能明顯改善肝功能；甘平等的研究結果顯示美洲大蠊乙醇提物具有抗CC14和ConA所致肝損傷的作用[文獻:甘平，張旭強，何旭，等.美洲大蠊提物對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26(2): 123-128.]。
[0004]為了明確蜚蠊藥材中具有抗肝纖維化作用的活性部位，進一步弄清其中起主要作用的物質(zhì)基礎，并從分子藥理學基礎上闡明蜚蠊抗肝纖維化的作用機制，發(fā)明人對其展開了詳細的藥學工藝研究。
【發(fā)明者】采用不同濃度的醇提，提取方法采用工業(yè)生產(chǎn)常用的冷浸或熱提兩種方法，精制過程選用價格較低、易于反復再生利用的大孔樹脂對蜚蠊提取物進行研究，并結合體內(nèi)外實驗進行活性追蹤，得到具有抗肝纖維化作用較強的活性部位。
[0005]本發(fā)明首先選用不同濃度的乙醇對蜚蠊進行提取，得到粗提物，并采用大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)對粗提取物進行活性篩選，篩選出活性最強的粗提取物，然后選用多種大孔樹脂為分離材料，對活性粗提取物進行分離純化，同時采用健康清潔級SD大鼠建立肝纖維化模型，對分離純化得到的蜚蠊提取物進行抗肝纖維化藥理活性實驗，通過數(shù)理統(tǒng)計分析，篩選得到抗肝纖維化活性最強的活性提取物。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)勢在于:①蜚蠊資源豐富，目前已完全實現(xiàn)人工飼養(yǎng)，全國每年產(chǎn)量達600多噸以上本發(fā)明得到的蜚蠊提取物具有安全、有效，質(zhì)量可控、無毒副作用的優(yōu)勢；③本發(fā)明工藝所用到的提取、分離、純化材料為環(huán)保、安全、可反復再生利用的材料，如醇、大孔樹脂；④蜚蠊系列藥品的研發(fā)是云南省重點培育的五大系列“云藥”特色產(chǎn)品之一，該項研究成果得到的天然產(chǎn)物，將為研發(fā)安全、有效、資源豐富、具有較強抗肝纖維化作用的新藥奠定基礎，使這一資源豐富的藥用昆蟲更好地為人類服務。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要目的在于提供一種乙醇提取、大孔吸附樹脂純化，制備蜚蠊抗肝纖維化作用的提取物的制備及檢測方法。
[0008]本發(fā)明中蜚蠊具有抗肝纖維化的有效部位提取物的制備方法如下:
[0009]原料處理:將蜚蠊養(yǎng)殖時間在5個月以上的成蟲用50°C?60°C的熱水燙死后，經(jīng)60?70°C溫度下干燥后粉碎。
[0010]提取:將所得粉末置于提取罐中，加入醇溶劑進行提取制得濾液；
[0011]其中醇溶劑為甲醇、乙醇、乙二醇中的一種或幾種與水的混合物,提取2?3次，每次用3?7倍量的溶劑，溶劑濃度為60%?95%，提取方法采用冷浸提取法或回流提取法。冷浸提取法為將蜚蠊干燥成蟲粉碎至10?30目，置浸泡罐中，加3?7倍量體積分數(shù)為60?95%的提取溶劑，攪勻，每次浸泡72小時以上，其間每間隔3?6小時攪拌一次，然后將提取液用孔徑為200?500目的濾布過濾，收集濾液；所述回流提取法為將蜚蠊干燥成蟲粉碎至10?30目，置提取罐中，加3?7倍量體積分數(shù)為60?95%的提取溶劑，攪勻，在70?80°C下回流提取2?5小時，提取3次，然后將提取液用孔徑為200?500目的濾布過濾，收集濾液；所述過濾可先用全棉濾布、棉綸濾布、滌綸濾布、丙綸濾布或尼龍濾布中的一種。
[0012]濃縮:將所得濾液減壓濃縮至浸膏無醇味，即得蜚蠊提取物；
[0013]脫脂:在油水分離裝置中加入所得浸膏和熱水，進行攪拌，靜置后放出水層，收集濾液并過濾，即得蜚蠊脫脂提取物；
[0014]其中采用在油水分離裝置中加入浸膏和浸膏體積量的2?5倍量60?75°C的熱水，順著同一方向緩慢攪拌，并加熱至65?75°C，保溫0.5小時，靜置冷卻6?12小時，待油脂分離后放出水層，過濾，收集濾液
[0015]吸附、洗脫:將蜚蠊脫脂提取物經(jīng)過大孔吸附樹脂柱吸附，再用水及不同濃度的醇洗脫，收集洗60?95%的洗脫液；
[0016]大孔吸附樹脂為顆粒狀，不同濃度的醇溶液是指50?95%的乙醇，大孔吸附樹脂的用量為脫脂提取液的I?5倍量體積，脫脂液上柱吸附6?12小時后用50?95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾。
[0017]制成品:將所得洗脫液過濾、減壓濃縮、干燥后粉碎，即得提取物的活性成分；減壓濃縮時溫度不得超過75°C。
[0018]測定:①提取物中總肽的測定:采用Folin-酚法，本品含多肽以小牛血清白蛋白計，不得少于400.0mg/g。②提取物中粘多糖的測定:采用苯酚-硫酸法，本品含多肽以葡萄糖計，不得少于100.0mg/g。③提取物中多元醇的測定:采用高碘酸鉀-Nash法，本品含多元醇以甘露醇計，不得少于70.0mg/g。④提取物中游離氨基酸的測定:采用茚三酮法，本品含游離氨基酸以絡氨酸計，不得少于200.0mg/g。
[0019]本發(fā)明的有益效果在于:提供一種用乙醇提取、大孔吸附樹脂純化，制備蜚蠊抗肝纖維化作用的提取物的制備及檢測方法，解決了當前對于蜚蠊提取物多用于口腔護理及心血管疾病方面的應用，使蜚蠊的藥用價值得到進一步的提升。

【具體實施方式】
[0020]下文將詳細描述本發(fā)明的實施例。應當注意的是，下述實施例中描述的技術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被相互組合和相互結合從而達到更好的技術效果。具體的提取物制備步驟如下:
[0021]原料處理:將蜚蠊養(yǎng)殖時間在5個月以上的成蟲用50°C?60°C的熱水燙死后，經(jīng)60?70°C溫度下干燥后粉碎。
[0022]提取:將所得粉末置于提取罐中，加入醇溶劑進行提取制得濾液；
[0023]其中醇溶劑為甲醇、乙醇、乙二醇中的一種或幾種與水的混合物,提取2?3次，每次用3?7倍量的溶劑，溶劑濃度為60%?95%，提取方法采用冷浸提取法或回流提取法。冷浸提取法為將蜚蠊干燥成蟲粉碎至10?30目，置浸泡罐中，加3?7倍量體積分數(shù)為60?95%的提取溶劑，攪勻，每次浸泡72小時以上，其間每間隔3?6小時攪拌一次，然后將提取液用孔徑為200?500目的濾布過濾，收集濾液；所述回流提取法為將蜚蠊干燥成蟲粉碎至10?30目，置提取罐中，加3?7倍量體積分數(shù)為60?95%的提取溶劑，攪勻，在70?80°C下回流提取2?5小時，提取3次，然后將提取液用孔徑為200?500目的濾布過濾，收集濾液；所述過濾可先用全棉濾布、棉綸濾布、滌綸濾布、丙綸濾布或尼龍濾布中的一種。
[0024]濃縮:將所得濾液減壓濃縮至浸膏無醇味，即得蜚蠊提取物；
[0025]脫脂:在油水分離裝置中加入所得浸膏和熱水，進行攪拌，靜置后放出水層，收集濾液并過濾，即得蜚蠊脫脂提取物；
[0026]其中采用在油水分離裝置中加入浸膏和浸膏體積量的2?5倍量60?75°C的熱水，順著同一方向緩慢攪拌，并加熱至65?75°C，保溫0.5小時，靜置冷卻6?12小時，待油脂分離后放出水層，過濾，收集濾液
[0027]吸附、洗脫:將蜚蠊脫脂提取物經(jīng)過大孔吸附樹脂柱吸附，再用水及不同濃度的醇洗脫，收集洗60?95%的洗脫液；
[0028]大孔吸附樹脂為顆粒狀，不同濃度的醇溶液是指50?95%的乙醇，大孔吸附樹脂的用量為脫脂提取液的I?5倍量體積，脫脂液上柱吸附6?12小時后用50?95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾。
[0029]制成品:將所得洗脫液過濾、減壓濃縮、干燥后粉碎，即得提取物的活性成分；減壓濃縮時溫度不得超過75°C。
[0030]測定:①提取物中總肽的測定:采用Folin-酚法，本品含多肽以小牛血清白蛋白計，不得少于400.0mg/g。②提取物中粘多糖的測定:采用苯酚-硫酸法，本品含多肽以葡萄糖計，不得少于100.0mg/g。③提取物中多元醇的測定:采用高碘酸鉀-Nash法，本品含多元醇以甘露醇計，不得少于70.0mg/g。④提取物中游離氨基酸的測定:采用茚三酮法，本品含游離氨基酸以絡氨酸計，不得少于200.0mg/g。
[0031]實施例1
[0032]蜚蠊醇提取物經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后的抗肝纖維化活性提取物的制備及主要活性成分的測定
[0033]1、將蜚蠊養(yǎng)殖時間在5個月以上的干燥藥材經(jīng)60?70°C干燥后粉碎，置提取罐中，加3?5倍量濃度為60?90%的乙醇溶劑，可采用回流提取或冷浸提取?；亓魈崛?提取三次，第一次3?5小時，第二、三次2?4小時，回流溫度控制在75?80°C，用孔徑為200?500目的濾布過濾，合并濾液。冷浸提取:提取三次，每次浸泡72小時以上，其間每間隔6?12小時攪拌一次，用孔徑為200?500目的濾布過濾,合并濾液。
[0034]2、將上述濾液減壓濃縮，溫度為50?70°C，濃縮至浸膏無醇味，此時相對密度為1.05?1.20，即得蜚蠊醇提物。
[0035]3、在油水分離裝置中加入流浸膏和浸膏體積量的3倍量60?75°C的熱水，順著一個方向緩慢攪拌，攪拌速度為30?50轉(zhuǎn)/分鐘，同時加熱至65?75°C，保溫I小時，靜置冷卻12小時，待油脂分離后放出水層，用200?500目濾布過濾，收集濾液，濾液減壓濃縮，溫度為55?65°C，濃縮至相對密度為1.1?1.3，即得蜚蠊脫脂提取物。
[0036]4、AB-8大孔吸附樹脂分段精制:將蜚蠊50?95%的乙醇提取物經(jīng)脫脂后上大孔吸附樹脂柱，并吸附2?3小時，用水洗至洗脫液無色，用不同濃度的乙醇洗脫，收集60?95 %的乙醇洗脫，過濾，濾液減壓濃縮，溫度為60°C，冷凍干燥或噴霧干燥，粉碎，即得本發(fā)明的活性提取物。
[0037]大孔吸附樹脂為顆粒狀，大孔吸附樹脂的用量為脫脂提取液的3?5倍量體積。
[0038]5、測定
[0039]5.1采用Folin-酚法測定蜚蠊提取物中的總肽含量，本品含多肽以小牛血清白蛋白計，不得少于400.0mg/g ο
[0040]5.1.1小牛血清白蛋白對照品0.2g，精密稱定，置10ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取10ml，置于10ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每Iml含小牛血清白蛋白200 μ g)。
[0041]5.1.2 精密量取對照品溶液 0.00,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80、1.0Om 于 1ml 量瓶中，加蒸餾水補齊至1.00ml。每管各加堿性銅試劑(含0.5mol/l NaOHUO% Na2C03,0.1% NaKC4H406和0.05% CuS04) 1.0ml，混勻。35°C加熱反應lOmin，冷卻;再依次快速加AFolin-酚試劑4.0ml，混勻，55°C加熱反應15min，冷卻，加水定容，以對照品溶液0.00濃度為空白，照紫外-可見分光光度法在760nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。
[0042]5.1.3取本品1.0g，精密稱定，加適量蒸餾水超聲溶解，用水定容至100ml，提供試品溶液。精密移取供試品溶液1.0ml，照標準曲線的制備項下的方法制備，依法測定吸光度，并用標準曲線計算出供試品溶液中總肽的含量。
[0043]5.2采用苯酹-硫酸法，本品含多肽以葡萄糖計，不得少于100.0mg/g ο
[0044]5.2.1精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品lOOmg，置10ml容量瓶中，加水溶解，定容、搖勻，即得1.0mg/ml的對照品儲備液。精密移取儲備液適量，用蒸餾水稀釋成0.1mg/ml的對照品測試液。
[0045]5.2.2精密稱取蜚蠊提取物ML-D凍干粉約50mg于10ml圓底燒瓶中，加6mol/L鹽酸50ml，密封，置90°C恒溫干燥箱中水解lh，冷卻，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
[0046]5.2.3精密移取水解后的供試品溶液10ml，加濃硫酸20ml，5%苯酚2ml，在沸水浴中加熱顯色1min在490nm處測定吸光度,計算供試品中粘多糖的含量。
[0047]5.3采用高碘酸鉀-Nash法，本品含多元醇以甘露醇計，不得少于70.0mg/g。
[0048]5.3.1精密稱取干燥至恒重的甘露醇對照品10mg，置1ml量瓶中，加水溶解，定容、搖勻，即得1.0mg/ml的對照品儲備液。精密移取對照品儲備液4ml于10ml量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，即得40 μ g/ml的對照品測試液。
[0049]5.3.2精密稱取蜚蠊提取物ML-D凍干粉約30mg于10ml量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，即得0.3mg/ml的供試液。
[0050]5.3.3供試品溶液和蒸餾水各5ml于25ml量瓶中，分別加入Iml0.015mol/L高碘酸鉀溶液，室溫靜置15min，分別加入2ml0.1% L-鼠李糖，再加入4mlNash試液，50°C保溫15min，冷卻，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。用紫外-可見分光光度計413nm處測定吸光度，計算供試品中多元醇的含量。
[0051]5.4采用茚三酮法，本品含游離氨基酸以絡氨酸計，不得少于200.0mg/g ο
[0052]5.4.1精密稱取干燥至恒重的絡氨酸對照品10.0mg置10ml容量瓶中，加0.02mol/L的氫氧化鈉溶液10ml，水浴加熱至完全溶解，用蒸餾水定容至刻度，混勻，即得濃度為0.lmg/ml的對照品溶液。
[0053]5.4.2精密稱取ML-D 25mg置10ml量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度，混勻，SP得濃度為0.25mg/ml的供試品溶液。
[0054]5.4.3精密移取Iml供試品溶液和Iml蒸餾水分別置1ml量瓶中，分別加Imll.0 %的茚三酮溶液和Iml檸檬酸緩沖液(pH = 6.0)，混勻，沸水浴加熱顯色30min，冷卻，分別加3ml60%乙醇，用蒸餾水定容至刻度，混勻，于570nm處測定吸光度值，計算游離氨基酸的含量。
[0055]實施例2
[0056]蜚蠊醇提取物經(jīng)D-1Ol大孔吸附樹脂純化后的抗肝纖維化活性提取物的制備及主要活性成分的測定
[0057]I蜚蠊活性提取物的制備:提取、濃縮、脫脂工藝同實施例一的I?3。
[0058]2D-101大孔吸附樹脂分段精制:將上一步得到的蜚蠊取物加適量水溶解后上D-1Ol大孔吸附樹脂柱，吸附過夜，用水洗至洗脫液無色，然后用不同濃度的醇洗脫，收集60?95%的乙醇洗脫液，過濾，濾液減壓濃縮，溫度為60°C，冷凍干燥或噴霧干燥，粉碎，即得本發(fā)明的活性提取物。
[0059]大孔吸附樹脂為顆粒狀，大孔吸附樹脂的用量為脫脂提取液的3倍量體積。
[0060]3測定:①提取物中總肽的測定:采用Folin-酚法，本品含多肽以小牛血清白蛋白計，測量值為461.0mg/g。②提取物中粘多糖的測定:采用苯酚-硫酸法，本品含多肽以葡萄糖計，測量值為137.0mg/g。③提取物中多元醇的測定:采用高碘酸鉀-Nash法，本品含多元醇以甘露醇計，測量值為78.5mg/g。④提取物中游離氨基酸的測定:采用茚三酮法，本品含游離氨基酸以絡氨酸計，測量值為237.5mg/g。
[0061]實施例3
[0062]蜚蠊醇提取物經(jīng)D-201大孔吸附樹脂純化后的抗肝纖維化活性提取物的制備及主要活性成分的測定
[0063]I蜚蠊活性提取物的制備:提取、濃縮、脫脂工藝同實施例一的I?3。
[0064]2D-201大孔吸附樹脂分段精制:將上一步得到的蜚蠊取物加適量水溶解后上D-201大孔吸附樹脂柱，吸附過夜，用水洗至洗脫液無色，然后用不同濃度的醇洗脫，收集60?95%的乙醇洗脫液，過濾，濾液減壓濃縮，溫度為60°C，冷凍干燥或噴霧干燥，粉碎，即得本發(fā)明的活性提取物。
[0065]大孔吸附樹脂為顆粒狀，大孔吸附樹脂的用量為脫脂提取液的3倍量體積。
[0066]3測定:①提取物中總肽的測定:采用Folin-酚法，本品含多肽以小牛血清白蛋白計，測量值為462.lmg/g。②提取物中粘多糖的測定:采用苯酚-硫酸法，本品含多肽以葡萄糖計，測量值為127.2mg/g。③提取物中多元醇的測定:采用高碘酸鉀-Nash法，本品含多元醇以甘露醇計，測量值為88.6mg/g。④提取物中游離氨基酸的測定:采用茚三酮法，本品含游離氨基酸以絡氨酸計，測量值為231.6mg/g。
[0067]實施例4
[0068]蜚蠊醇提取物經(jīng)HPD-100大孔吸附樹脂純化后的抗肝纖維化活性提取物的制備及主要活性成分的測定
[0069]I蜚蠊活性提取物的制備:提取、濃縮、脫脂工藝同實施例一的I?3。
[0070]2HPD-100大孔吸附樹脂分段精制:將上一步得到的蜚蠊取物加適量水溶解后上D-201大孔吸附樹脂柱，吸附過夜，用水洗至洗脫液無色，然后用不同濃度的醇洗脫，收集60?95%的乙醇洗脫液，過濾，濾液減壓濃縮，溫度為60°C，冷凍干燥或噴霧干燥，粉碎，即得本發(fā)明的活性提取物。
[0071]大孔吸附樹脂為顆粒狀，大孔吸附樹脂的用量為脫脂提取液的3?5倍量體積。
[0072]3測定:①提取物中總肽的測定:采用Folin-酚法，本品含多肽以小牛血清白蛋白計，測量值為450.3mg/g。②提取物中粘多糖的測定:采用苯酚-硫酸法，本品含多肽以葡萄糖計，測量值為130.5mg/g。③提取物中多元醇的測定:采用高碘酸鉀-Nash法，本品含多元醇以甘露醇計，測量值為82.lmg/g。④提取物中游離氨基酸的測定:采用茚三酮法，本品含游離氨基酸以絡氨酸計，測量值為223.8mg/g。
[0073]本發(fā)明提供的一種蜚蠊成蟲提取物的制備及檢測方法，能有效提取出蜚蠊體內(nèi)可用于抗肝纖維化作用的活性成分，通過Folin-酚法、苯酚-硫酸法、高碘酸鉀-Nash法及茚三酮法對活性成分進行檢測。
[0074]本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的一些實施例，但是本領域的技術人員應當理解，在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對本文的實施例進行改變。上述實施例只是示例性的，不應以本文的實施例作為本發(fā)明權利范圍的限定。
【權利要求】
1.一種蜚蠊成蟲提取物的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 原料處理:將蜚蠊養(yǎng)殖時間在5個月以上的成蟲殺死干燥后粉碎； 提取:將所得粉末置于提取罐中，加入醇溶劑進行提取制得濾液； 濃縮:將所得濾液減壓濃縮至浸膏無醇味，即得蜚蠊提取物； 脫脂:在油水分離裝置中加入所得浸膏和熱水，進行攪拌，靜置后放出水層，收集濾液并過濾，即得蜚蠊脫脂提取物； 吸附、洗脫:將蜚蠊脫脂提取物經(jīng)過大孔吸附樹脂柱吸附，再用水及不同濃度的醇洗脫，收集洗60?95%的洗脫液； 制成品:將所得洗脫液過濾、減壓濃縮、干燥后粉碎，即得提取物的活性成分； 檢測:分別測定提取物的活性成分中總肽、粘多糖、多元醇及游離氨基酸的含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的蜚蠊成蟲提取物的制備方法，其特征在于:所述原料處理是用50°C?60°C的熱水燙死后，在60°C?70°C下烘干。
3.根據(jù)權利要求1所述的蜚蠊成蟲提取物的制備方法，其特征在于:所述提取步驟中醇溶劑為甲醇、乙醇、乙二醇中的一種或幾種與水的混合物，提取2?3次，每次用3?7倍量的溶劑，溶劑濃度為60%?95%，提取方法采用冷浸提取法或回流提取法。
4.根據(jù)權利要求3所述的蜚蠊成蟲提取物的制備方法，其特征在于:所述冷浸提取法為將蜚蠊干燥成蟲粉碎至10?30目，置浸泡罐中，加3?7倍量體積分數(shù)為60?95 %的提取溶劑，攪勻，每次浸泡72小時以上，其間每間隔3?6小時攪拌一次，然后將提取液用孔徑為200?500目的濾布過濾，收集濾液；所述回流提取法為將蜚蠊干燥成蟲粉碎至10?30目，置提取罐中，加3?7倍量體積分數(shù)為60?95%的提取溶劑，攪勻，在70?80°C下回流提取2?5小時，提取3次，然后將提取液用孔徑為200?500目的濾布過濾，收集濾液；所述過濾可先用全棉濾布、棉綸濾布、滌綸濾布、丙綸濾布或尼龍濾布中的一種。
5.根據(jù)權利要求1所述的蜚蠊成蟲提取物的制備方法，其特征在于:所述脫脂采用在油水分離裝置中加入浸膏和浸膏體積量的2?5倍量60?75°C的熱水，順著同一方向緩慢攪拌，并加熱至65?75°C，保溫0.5小時，靜置冷卻6?12小時，待油脂分離后放出水層，過濾，收集濾液。
6.根據(jù)權利要求1所述的蜚蠊成蟲提取物的制備方法，其特征在于:所述吸附、洗脫步驟大孔吸附樹脂為顆粒狀，不同濃度的醇溶液是指50?95%的乙醇，大孔吸附樹脂的用量為脫脂提取液的I?5倍量體積，脫脂液上柱吸附6?12小時后用50?95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾。
7.根據(jù)權利要求1所述的蜚蠊成蟲提取物的制備方法，其特征在于:所述減壓濃縮時溫度不得超過75°C。
8.一種蜚蠊成蟲提取物的檢測方法，其特征在于:所述檢測方法指采用Folin-酚法測定提取物中的總肽含量，采用苯酚-硫酸法測定提取物中粘多糖的含量，采用高碘酸鉀-Nash法測定提取物中多元醇的含量，采用茚三酮法測定提取物中游離氨基酸的含量。
【文檔編號】A61P1/16GK104352529SQ201410623930
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權日:2014年11月7日
【發(fā)明者】肖培云, 楊永壽, 施貴榮, 李夸巧, 楊敏, 趙昱 申請人:大理學院