鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法，所述制備方法包括以下步驟：1）提取鹿茸多肽；2）配制膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液；3）將上述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液混勻后，加入步驟1）提取的鹿茸多肽，進(jìn)行真空冷凍干燥；4）將步驟3）凍干后的混合物用戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)后再次真空冷凍干燥得到厚度為0.8mm~1.2mm的、多孔的鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖復(fù)合材料。本發(fā)明采用生物活性物質(zhì)鹿茸多肽與膠原蛋白-殼聚糖復(fù)合，選擇膠原蛋白作為緩釋釋放載體，為克服膠原蛋白自身的不足，將其與殼聚糖復(fù)合形成改性膠原材料，克服了多肽類藥物不易通過生物屏障，在傷口及創(chuàng)面易被水解酶破壞等問題。
【專利說明】鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]骨折愈合是一個復(fù)雜的生理過程，包括細(xì)胞的遷移、血管的生成和骨痂的改建等，也包括生長因子對細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控、骨誘導(dǎo)、分子信號傳導(dǎo)作用等多序列的修復(fù)過程。組織工程學(xué)的問世為人體組織器官缺損的再造和修復(fù)開辟了新的途徑，目前將生物活性成分加載至骨組織工程支架材料上以促進(jìn)骨修復(fù)成為研究新型骨修復(fù)材料的趨勢，能使生物活性因子與納米材料穩(wěn)定充分復(fù)合，使材料具備了載藥和控釋功能，延長生物活性成分降解半衰期，提高生物利用度，又可以起到持續(xù)促進(jìn)成骨的功能，獲得更好的骨修復(fù)效果O
[0003]鹿茸為我國傳統(tǒng)名貴中藥，鹿茸多肽是其中主要活性成分之一，有加速骨組織再生、周圍神經(jīng)組織再生及創(chuàng)面愈合、促進(jìn)骨折愈合的作用。鹿茸多肽能夠通過促進(jìn)骨、軟骨細(xì)胞增殖及促進(jìn)骨痂內(nèi)膠原的積累和鈣鹽沉淀而加速骨折愈合，縮短骨折愈合時間，改善骨折部位的生物力學(xué)性能，對骨痂內(nèi)骨膠原的合成和鈣鹽沉積具有促進(jìn)作用。
[0004]鹿茸在臨床上具有悠久的應(yīng)用歷史，但對其蛋白及多肽的化學(xué)及理學(xué)方面的研究并不深入，沒有更好的適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品，但是目前的研究主要集中在細(xì)胞水平，同時作為多肽類物質(zhì)，雖然其具有生物活性大、生理作用強(qiáng)的特點，但是卻具有穩(wěn)定性差，容易發(fā)生水解、氧化、變性等作用導(dǎo)致完全失去作用，同時體內(nèi)的半衰期短，經(jīng)脈注射后很快就被清除或者降解。因此，運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)從鹿茸中分離出多肽與蛋白并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出具有高活性的梅花鹿茸生物制劑，進(jìn)而利用生物工程技術(shù)將其工業(yè)化生產(chǎn)具有深遠(yuǎn)的意義。
[0005]目前還未有將鹿茸多肽用于治療骨折愈合方面的臨床報道。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何克服鹿茸多肽藥物不易通過生物屏障，在傷口及創(chuàng)面易被水解酶破壞，以及如何持續(xù)、穩(wěn)定、高效地控制鹿茸多肽藥物的釋放速度，延長半衰期，實現(xiàn)藥物的靶向釋放，大幅度提高藥物的生物利用度。
[0008]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
1)提取鹿茸多肽；
2)配制膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液；
3)將上述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液混勻后，加入步驟I)提取的鹿茸多肽，進(jìn)行真空冷凍干燥；
4)將步驟3)凍干后的混合物用戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)后再次真空冷凍干燥得到厚度為0.8mnTl.2mm的、多孔的鹿茸多肽-膠原蛋白_殼聚糖復(fù)合材料。
[0009]優(yōu)選的，所述交聯(lián)反應(yīng)為將步驟3)的混合物加入戊二醛溶液在4°C混合24h。
[0010]優(yōu)選的，所述鹿茸多肽的提取為采用微波提取后，加入95%乙醇4°C沉淀方法提取鹿茸多肽。
[0011]優(yōu)選的，所述戊二醛溶液的濃度為0.25%。
[0012]優(yōu)選的，所述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液采用濃度為0.05mol/L的乙酸溶液配制，得到的膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液濃度為0.5%。
[0013]優(yōu)選的，步驟3)中膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液采用體積比為9:1的比例混合均勻。
[0014]采用上述方法即制得鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料。所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料用于骨折愈合治療。
[0015]本發(fā)明有益效果為:本發(fā)明采用生物活性物質(zhì)鹿茸多肽與膠原蛋白-殼聚糖復(fù)合，選擇膠原蛋白作為緩釋釋放載體，為克服膠原蛋白自身的不足，將其與殼聚糖復(fù)合形成改性膠原材料，不僅能夠克服多肽類藥物不易通過生物屏障，在傷口及創(chuàng)面易被水解酶破壞等問題，而且可以持續(xù)、穩(wěn)定、高效地控制鹿茸多肽藥物的釋放速度，延長半衰期，實現(xiàn)藥物的靶向釋放，大幅度提高藥物的生物利用度，從而達(dá)到修復(fù)骨缺損與藥物治療的雙重效果，促進(jìn)鹿茸多肽在骨修復(fù)新型材料中的應(yīng)用。
[0016]

【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為本發(fā)明鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的電鏡掃描示意圖。
[0017]

【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，下面實施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。
[0019](I)鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備
A、鹿茸多肽提取:取新鮮梅花鹿茸，切成小塊，4°C蒸餾水沖洗，粉碎，加預(yù)冷冰醋酸溶液勻漿。勻漿液用100W微波處理lOmin，離心，取上清，加入95%乙醇4°C冷沉，離心，取上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、凍干得鹿茸多肽粗提物。
[0020]B、鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備:用0.05mol/L乙酸配制0.5%的膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液，按9:1的比例將膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液混勻，加入鹿茸多肽至終濃度分別為0.25,0.5、1、2.0Pg/mL，傾入預(yù)冷的24孔板中，_20°C冷凍12h后凍干24h，再用0.25%戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)，真空冷凍干燥，密封于無菌塑料袋中，最后制成厚約Imm的多孔支架，即得到鹿茸多肽含量不同的鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料。
[0021]C、鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料超微結(jié)構(gòu)的觀察:將試樣切成小塊并進(jìn)行雙重固定，清洗，叔丁醇脫水，冷凍干燥脫水和噴金導(dǎo)電處理后，制成切片，電鏡下觀察支架材料表面及內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，如圖1所示，鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料表面光滑，孔徑小且分布均勻，是生物材料理想的微觀結(jié)構(gòu)形式。
[0022](2)鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料對骨折愈合的促進(jìn)作用
MTT法檢測細(xì)胞增殖實驗:取對數(shù)生長期的成骨細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞濃度為5 X 104個/mL，于96孔板每孔加入200 μ L，使細(xì)胞生長同步化，實驗分2組，培養(yǎng)液對照組，含鹿茸多肽復(fù)合材料培養(yǎng)液組。分別于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)l、2、3、4、5d，每孔加入20 μ? ΜΤΤ，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液，每孔加入150 μ L DMS0，振蕩lOmin，應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長570nm處測吸光度值，選擇促增殖效果最佳的材料進(jìn)行后續(xù)實驗。結(jié)果表明，在培養(yǎng)Id內(nèi)，各組HFOB細(xì)胞生長無明顯差異。培養(yǎng)第2d，含鹿茸多肽的復(fù)合材料組明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，優(yōu)于其余兩組。繼續(xù)培養(yǎng)較長時間(3、4、5d)，交聯(lián)復(fù)合材料組對細(xì)胞的增殖逐漸增強(qiáng)，顯著優(yōu)于和對照組，且隨著鹿茸多肽濃度(0.25、0.5、1和2 Pg/mL)的升高呈劑量依賴性。結(jié)果顯示，交聯(lián)法制備的材料可在較長時間內(nèi)持續(xù)促進(jìn)人成骨細(xì)胞的增殖。
[0023]堿性磷酸酶活性測定:取對數(shù)生長期的成骨細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞，以IX 104個/孔加入6孔板，培養(yǎng)12h，各孔加入不同濃度鹿茸多肽交聯(lián)材料的培養(yǎng)液，同時設(shè)培養(yǎng)液對照組，每組均設(shè)5復(fù)孔。培養(yǎng)7d后收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞取上清液用全自動生化分析儀測定ALP活性。結(jié)果表明，含鹿茸多肽的各組復(fù)合材料均能使HFOB細(xì)胞ALP活性明顯增高(P〈0.05)，且隨著鹿茸多肽濃度的增加ALP活性隨之增加。
[0024]鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖對兔骨折愈合的影響:取健康新西蘭白兔45只，麻醉動物，將兔仰臥固定在支架上，頭偏右側(cè)，脫毛，常規(guī)消毒鋪巾，暴露下領(lǐng)骨。沖洗降溫條件下，在下領(lǐng)骨中后1/3交界處用金剛砂片垂直于下領(lǐng)骨下緣在下領(lǐng)骨外側(cè)面和下緣做線形溝槽，深度為骨皮質(zhì)全，再用骨鑿深入溝槽內(nèi)將之撬斷，造成線形骨折。在骨折線兩側(cè)、距骨折線的對稱位置各鉆2個孔，鋼絲交叉結(jié)扎固定兩骨折斷端。充分止血后，放置鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋釋放材料(實驗組)、膠原蛋白-殼聚糖緩釋釋放材料(對照組)、對照組(4組)不放置任何試劑和載體，關(guān)閉傷口。
[0025]Micro-CT檢查:分別于術(shù)后4、8、12周時，將實驗各組下頜骨缺損處組織標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT掃描，觀察組織缺損部位及其周圍骨質(zhì)的部分重建，根據(jù)形態(tài)學(xué)的變化進(jìn)行定性分析。
[0026]組織學(xué)檢測:骨缺損部位取材，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察植入物與周圍骨組織的結(jié)合、新生骨基質(zhì)的生成、血管和纖維組織、材料的降解等情況。
[0027]結(jié)果:術(shù)后4周，鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組的材料周圍組織可見明顯放射顯影，呈骨小梁形態(tài)；膠原蛋白-殼聚糖緩釋組可見部分骨小梁生成，但數(shù)量較少；空白對照組未見骨小梁生成。術(shù)后8周，鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組的成骨量明顯增多，空白對照組僅在缺損邊緣處偶見骨小梁出現(xiàn)。
[0028]術(shù)后4周各組骨缺損處的病理學(xué)改變:鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中骨缺損部位由纖維骨痂填充，材料部分降解，周圍有新骨生成，成骨細(xì)胞聚集在骨基質(zhì)周圍，可見少量編織骨成分和血管組織，骨缺損周邊處可見新生骨小梁從邊緣向中央網(wǎng)孔內(nèi)生長；膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中骨缺損大部分被纖維組織填充，在骨缺損邊緣部位有新骨形成?？瞻讓φ战M骨缺損處主要為纖維組織填充，可見大量成纖維細(xì)胞。
[0029]術(shù)后8周各組骨缺損處的病理學(xué)改變:鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中的骨缺損部位骨小梁明顯增多，材料降解吸收明顯，可見較為成熟的新生骨組織與編織骨共存，小血管增生明顯，缺損區(qū)內(nèi)出現(xiàn)骨髓組織；膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中，骨缺損中心大部分為纖維組織填充，材料進(jìn)一步降解，但骨缺損周邊部位的新骨較4周時有所增加空白對照組的骨缺損仍為大量纖維組織填充，與術(shù)后4周時相比變化不明顯。
[0030]術(shù)后12周各組骨缺損處的病理學(xué)改變:鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中骨缺損部位新生骨小梁改建成為更致密的板層骨，大量成骨細(xì)胞位于骨陷窩中，可見哈佛管系統(tǒng)，髓腔再通，在缺損周邊可見板層骨與原骨組織緊密結(jié)合；膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中的骨缺損處，可見成熟的成骨細(xì)胞，為編織骨修復(fù)，無板層骨和骨髓腔形成，缺損中心仍為纖維組織填充，材料基本降解，僅見少量殘留；空白對照組在缺損周邊部位可見骨島生成，數(shù)量極少，材料少量殘留，中心部位仍由纖維組織填充。
[0031]在以上的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是以上描述僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，因此本發(fā)明不受上面公開的具體實施的限制。同時任何熟悉本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: 1)提取鹿茸多肽； 2)配制膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液； 3)將上述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液混勻后，加入步驟I)提取的鹿茸多肽，進(jìn)行真空冷凍干燥； 4)將步驟3)凍干后的混合物用戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)后再次真空冷凍干燥得到厚度為0.8mnTl.2mm的、多孔的鹿茸多肽-膠原蛋白_殼聚糖復(fù)合材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)反應(yīng)為將步驟3)的混合物加入戊二醛溶液在4°C混合24h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述鹿茸多肽的提取為采用微波提取后，加入95%乙醇4°C沉淀方法提取鹿茸多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述戊二醛溶液的濃度為0.25%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液采用濃度為0.05mol/L的乙酸溶液配制，得到的膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液濃度為0.5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，步驟3)中膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液采用體積比為9:1的比例混合均勻。
7.一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料，其特征在于，所述緩釋材料為采用如權(quán)利要求f 6任一項所述方法制得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的應(yīng)用，其特征在于，所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料用于骨折愈合治療。
【文檔編號】A61L27/54GK104436311SQ201410638713
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】呂士杰, 朱文赫, 徐俊杰, 沈楠, 李亞巍, 鐘秀宏, 楊丹 申請人:吉林醫(yī)藥學(xué)院