識(shí)別、捕獲和抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的功能納米材料載藥系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于納米材料包被技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞識(shí)別、捕獲和活性調(diào)控的應(yīng)用領(lǐng)域，尤其針對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移的預(yù)警和預(yù)防方面，特別是涉及一種特異性識(shí)別、捕獲和抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的功能納米材料載藥系統(tǒng)。該功能納米材料載藥系統(tǒng)由中心納米材料載體、表面靶向抗體或適配體、抗癌或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組成。該功能納米材料載藥系統(tǒng)可用于體外對(duì)模擬和臨床病人血液樣本微量循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別和捕獲研究，且可用于對(duì)所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)行調(diào)控，從而在腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)警和預(yù)防方面開拓應(yīng)用前景。
【專利說明】識(shí)別、捕獲和抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的功能納米材料載藥系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米材料包被技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞識(shí)別、捕獲和活性調(diào)控的應(yīng)用領(lǐng) 域，尤其針對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移的預(yù)警和預(yù)防方面，特別是涉及一種特異性識(shí)別、捕獲和抑制循環(huán)腫 瘤細(xì)胞的功能納米材料載藥系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 50多年來，多種重大疾?。ㄈ缧呐K病）的死亡率已下降了> 60%，但癌癥死亡率僅 減少約5%，其中絕大多數(shù)死于手術(shù)后腫瘤的再轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的"抗癌藥"主要針對(duì)那些惡性 增殖的腫瘤細(xì)胞而非處于休眠狀態(tài)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，故不僅不能選擇性地殺死循環(huán)腫瘤細(xì) 胞，而且也擊垮了人體的免疫系統(tǒng)，使"疾病-人體自身抗病力"之間的平衡朝著不利方面 傾斜，甚至引起致突變、致癌。因此，抗癌藥物的研發(fā)走的是一條"癌癥轉(zhuǎn)移后再抗癌"的遲 愚路線，收效甚微。當(dāng)前納米技術(shù)在癌癥方面的應(yīng)用途徑也主要側(cè)重于將術(shù)后轉(zhuǎn)移的化學(xué) 藥物與單抗體包被的納米材料結(jié)合在一起，而這種方式由于其毒性和非特異性問題，并不 能有效地干預(yù)由循環(huán)腫瘤細(xì)胞引起的癌癥轉(zhuǎn)移過程。故研發(fā)能特異性識(shí)別和捕獲血中微量 循環(huán)腫瘤細(xì)胞并下調(diào)其活性的功能化納米材料載藥系統(tǒng)，可有效預(yù)防因循環(huán)腫瘤細(xì)胞激活 后誘發(fā)的腫瘤轉(zhuǎn)移，進(jìn)而消除手術(shù)后腫瘤再轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的隱患。
[0003] 發(fā)明目的 本發(fā)明的目的在于避免了傳統(tǒng)納米技術(shù)檢測(cè)和捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的非特異性問題，進(jìn) 而提供了一種特異性識(shí)別、捕獲和抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的功能納米材料載藥系統(tǒng)，該類納米 材料載藥系統(tǒng)因可特異性地捕獲并抑制所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，有望應(yīng)用于癌癥轉(zhuǎn)移的預(yù) 警和預(yù)防方面。
[0004] 本發(fā)明的一種功能納米材料載藥系統(tǒng)，所述功能納米材料載藥系統(tǒng)由中心納米材 料載體、表面靶向抗體或適配體、抗癌或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組成。
[0005] 所述的中心納米材料載體為PAMAM dendrimers、金納米顆粒AuNPs、娃納米顆粒 SiNPs、磁性納米顆粒MNPs或氧化石墨烯graphene oxide。
[0006] 所述的表面靶向靶向抗體或適配體由兩種或兩種以上能特異性識(shí)別和結(jié)合循 環(huán)腫瘤細(xì)胞表面生物標(biāo)記物的靶向抗體或適配體組成，所述生物標(biāo)記物為EpCAM、Sialyl Lewis X、HER2、EGFR、ALDHl 或 CD44。
[0007] 所述的抗癌或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的藥物包括熊果酸及其衍生物、米非司酮及其衍生 物、卡托普利及其衍生物、大黃素及其衍生物。
[0008] 所述的中心納米材料載體與表面靶向抗體或適配體采用共價(jià)連接方式進(jìn)行，所述 共價(jià)連接方式為1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽/ N-羥基丁二酰亞胺法、 親和素/生物素法或N-羥基丁二酰亞胺/順丁烯二酰亞胺化學(xué)法。
[0009] 所述的功能納米材料載藥系統(tǒng)通過將所述抗癌或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的藥物與中心納 米材料載體進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)、靜電吸附、物理包埋的方式來制備。
[0010] 所述的中心納米材料載體表面具有反應(yīng)官能團(tuán)，所述反應(yīng)官能團(tuán) 為-OH、-NH2、-COOH 或-SH。 toon] 所述的中心納米材料載體與表面靶向抗體或適配體采用中間連接體進(jìn)行連接， 所述中間連接體為羧基化的聚乙二醇、巰基化的聚乙二醇、hydrazide-polyethylene glycol-dithiol 或 0PSS-PEG-NHS 。
[0012] 本發(fā)明的一種特異性識(shí)別、捕獲和抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的功能納米材料載藥系統(tǒng)， 由中心納米材料載體、表面靶向抗體或適配體及抗癌或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組成，其中中 心部分是由具有多價(jià)絡(luò)合效應(yīng)、良好尺寸效應(yīng)、高度負(fù)載能力及表面官能團(tuán)豐富的納米材 料支架構(gòu)成；外圍部分則是由能特異性識(shí)別和結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs)表面生物標(biāo)記物 的兩種或兩種以上靶向抗體或適配體構(gòu)成；抗癌或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的藥物則是由抗癌或預(yù)防 癌癥轉(zhuǎn)移的低毒高效的小分子量化學(xué)藥物構(gòu)成。本發(fā)明得到的納米材料載藥系統(tǒng)，不僅結(jié) 構(gòu)穩(wěn)定，并能同時(shí)保持納米材料和靶向抗體或適配體本身的優(yōu)良特性，還可用于體外對(duì)模 擬和臨床病人血液樣本中微量CTCs的特異性識(shí)別和捕獲研究，且可用于對(duì)所捕獲的CTCs 活性進(jìn)行調(diào)控，從而在腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)警和預(yù)防方面開拓應(yīng)用前景。
[0013] 本發(fā)明詳細(xì)描述如下： 可用于本發(fā)明的納米材料應(yīng)有多價(jià)絡(luò)合效應(yīng)、良好的尺寸效應(yīng)和生物穩(wěn)定性及高度的 負(fù)載能力，可采用但不局限于下列物質(zhì)：樹狀物（dendrimers )、金納米顆粒（AuNPs )、娃納 米顆粒（SiNPs)、磁性納米顆粒（MNPs)、氧化石墨烯（graphene oxide)。優(yōu)先用于本發(fā)明 的為聚酰胺-胺型樹枝狀大分子（PAMM dendrimers)，除了具有普通納米材料共有的特性 (外部規(guī)整精細(xì)的球狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部呈疏水性空腔特性，可為疏水性藥物以及無機(jī)探針分子的 負(fù)載提供場(chǎng)所，達(dá)到藥物的控釋和緩釋及無機(jī)探針的靶向遞送等目的）外，其表面還有大量 可控功能基團(tuán)(氨基)，可以對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾、多價(jià)絡(luò)合靶向抗體、配體及藥物分子等，從 而構(gòu)建安全有效的生物復(fù)合物（bioconjugate)。
[0014] 可用于本發(fā)明的靶向抗體選擇針對(duì)那些能在腫瘤細(xì)胞尤其是循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面 高度表達(dá)，而在正常細(xì)胞尤其是血細(xì)胞和白細(xì)胞上低表達(dá)或不表達(dá)的生物標(biāo)記物，可采用 但不局限于下列標(biāo)記物：EpCAM、Sialyl Lewis 乂、冊(cè)1?246?1?40)!11、0)44。優(yōu)先用于本發(fā)明 的為針對(duì)上皮循環(huán)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的EpCAM和Sialyl Lewis X的抗體，其中EpCAM又稱為 CD326, TACSTD1，C017-1A，GA733-2和KSA等，屬單次跨膜I型糖蛋白，分子質(zhì)量為30?40 kD，由3部分構(gòu)成，即胞外結(jié)構(gòu)域、單次跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域以一個(gè)信號(hào) 序列開始，其后緊接著一個(gè)上皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列、一個(gè)人類甲狀腺球蛋白序列和一個(gè) 缺乏半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，上皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列和人類甲狀腺球蛋白序列形成一個(gè)球狀 結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)EpCAM分子的同源細(xì)胞黏附特性。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?yàn)橐粋€(gè)具有26個(gè)氨基酸的短鏈，含 有2個(gè)a-輔肌動(dòng)蛋白（a-actinin)結(jié)合位點(diǎn)，可以與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，從而和細(xì)胞骨架相互 作用。生理情況下EpCAM不同程度地表達(dá)于除鱗狀上皮之外所有的正常上皮中，且多位于 細(xì)胞間緊密連接。在結(jié)締組織及造血系統(tǒng)來源的細(xì)胞、腦組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞中缺乏明顯 的EpCAM的表達(dá)。病理情況下EpCAM幾乎表達(dá)于所有的腺癌中，包括結(jié)直腸腺癌、胃腺癌、 乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝細(xì)胞癌和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。因此，EpCAM 常作為癌癥早期檢測(cè)和診斷的指標(biāo)。另外一個(gè)抗體是針對(duì)抗原Sialy Lewis X (Slex)。 Slex又稱為⑶15s，是腫瘤標(biāo)志物單唾液酸神經(jīng)節(jié)糖苷脂CA19-9的同分異構(gòu)體，也是黏附 分子選擇素（E-selectin，即⑶62)所識(shí)別的比較確定的配基之一，由半乳糖（Gal)、葡萄糖 (61(3)、唾液酸（他1^(：)、^乙?；?3)、巖藻糖斤11(3)5個(gè)分子結(jié)合而成。細(xì)胞粘附分子 作為介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)的相互識(shí)別和作用的分子基礎(chǔ)，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程 中發(fā)揮著重要作用。糖抗原的高表達(dá)，反映了腫瘤細(xì)胞膜糖抗原糖鏈的變化。通過化學(xué)修 飾作用產(chǎn)生的糖鏈異質(zhì)性改變及分布，可能掩蓋某些腫瘤抗原，降低腫瘤細(xì)胞免疫原性，增 加分子的凈負(fù)電荷，減弱淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞結(jié)合與殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，促使腫瘤細(xì)胞 發(fā)生免疫逃避。由于細(xì)胞表面相互間的排斥力增大，吸附和結(jié)合能力降低，因而使腫瘤細(xì)胞 易于從組織脫落轉(zhuǎn)移。粘附分子在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著雙重作用，一方面 腫瘤細(xì)胞必須先通過細(xì)胞粘附分子下調(diào)，從原發(fā)灶脫落；另一方面又需要通過細(xì)胞外基質(zhì) 受體或內(nèi)皮細(xì)胞配體的上調(diào)，與細(xì)胞外基質(zhì)或血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附而移動(dòng)，才能形成轉(zhuǎn)移灶。 ⑶15s高表達(dá)與灶性去分化是腫瘤轉(zhuǎn)移傾向的重要標(biāo)志。因此，⑶15s也作為CTCs研究的 革巴點(diǎn)之一。
[0015] 可用于本發(fā)明的構(gòu)成功能納米材料載藥系統(tǒng)的藥物，通常指那些高效低毒的抗癌 或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的化學(xué)藥物，可采用但不局限于下列化合物：熊果酸及其衍生物、米非司酮 及其衍生物、卡托普利及其衍生物、大黃素及其衍生物。優(yōu)先推薦用于本發(fā)明的米非司酮及 其衍生物。因它們可抑制血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)膜的粘附及對(duì)外周組織的侵襲，故 可在癌癥轉(zhuǎn)移的預(yù)防中發(fā)揮重要作用。
[0016] 可用于本發(fā)明的中心納米材料與表面靶向抗體或適配體的共價(jià)連接方式，可采用 但不局限于下列方法：1-乙基-(3-甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC)/ N-羥基丁 二酰亞胺（NHS)法、親和素（avidin) /生物素（biotin)法和N-羥基丁二酰亞胺（NHS) / 順丁烯二酰亞胺（maleimide)化學(xué)法。優(yōu)先用于本發(fā)明的EDC/NHS催化法，不僅可使雙抗 體（anti-EpCAM、anti_Slex)依次共價(jià)連接在PAMAM dendrimers表面，還可減少抗體在材 料表面的物理吸附（anti-fouling effect)，降低納米材料本身的毒性，增加納米材料-抗 體絡(luò)合物在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性。
[0017] 可用于本發(fā)明的功能納米材料載藥系統(tǒng)的制備，可采用但不局限于下列方法實(shí) 現(xiàn)：將化學(xué)藥物共價(jià)偶聯(lián)在納米材料表面、將化學(xué)藥物靜電吸附在納米材料表面、將化學(xué)藥 物包埋在納米材料空腔中。優(yōu)先推薦用于本發(fā)明的物理包埋法，即將化學(xué)藥物米非司酮及 其衍生物在一定環(huán)境中包埋到PAMAM dendrimers的3D空腔結(jié)構(gòu)中。該方法既避免了化學(xué) 藥物與抗體共同連接在PAMAM dendrimers表面所產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)，又最大程度地利用 了 PAMAM dendrimers的空間結(jié)構(gòu)，提高了藥物裝載量。
[0018] 可用于本發(fā)明的中心納米材料，表面應(yīng)具有反應(yīng)官能團(tuán)，便于與靶向抗體的共價(jià) 連接，可選用但不局限于下列基團(tuán)：-0H、-NH 2、-C00H、-SH。
[0019] 可用于本發(fā)明的納米材料與靶向抗體進(jìn)行連接時(shí)，減少空間位阻效應(yīng)的中 間體，可采用但不局限于下列物質(zhì)：羧基化的聚乙二醇、巰基化的聚乙二醇（PEG-SH)、 hydrazide-polyethylene glycol-dithiol Λ orthopyridyl-disulfide-polyethyleneglyc ol-N-hydroxy-succinimide (OPSS-PEG-NHS)。
[0020] 可用于本發(fā)明的中心納米材料與表面靶向抗體，為了實(shí)現(xiàn)最大多價(jià)絡(luò)合效應(yīng)，靶 向抗體的用量要遠(yuǎn)比納米材料本身多，具體多少要依據(jù)納米材料表面裸露的反應(yīng)官能團(tuán)而 定。
[0021 ] 可用于本發(fā)明的體外循環(huán)腫瘤細(xì)胞模型應(yīng)選取那些研究集中、術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)程 度中高的癌細(xì)胞株，可采用但不局限于下列癌細(xì)胞株：乳腺癌細(xì)胞株、前列腺癌細(xì)胞株、結(jié) 腸癌細(xì)胞株、肝癌細(xì)胞株、宮頸癌細(xì)胞株、胃癌細(xì)胞株、肺癌細(xì)胞株。優(yōu)先推薦選用人結(jié)腸癌 細(xì)胞株HT29作為體外循環(huán)腫瘤細(xì)胞模型。因結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)程度適中， 風(fēng)險(xiǎn)性較??；且生物標(biāo)記物EpCAM和Slex在該細(xì)胞表面穩(wěn)定性高度表達(dá)，故選取HT29為體 外CTCs模型，將會(huì)有助于本研究的順利開展。
[0022] 可用于本發(fā)明的體外含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的血液樣本取自那些研究集中、術(shù)后轉(zhuǎn)移 和復(fù)發(fā)程度中高的中晚期癌癥病人，可選取并不局限于下列癌癥病人：結(jié)腸癌病人、乳腺癌 病人、肝癌病人、前列腺癌病人、宮頸癌病人、胃癌病人、肺癌病人。
[0023] 可用于本發(fā)明的功能納米材料載藥系統(tǒng)的理化性質(zhì)表征手段，可采用但不局限于 下列方法：核磁共振譜（ 1H NMR)、紅外光譜（FTIR)、紫外可見光譜（UV-Vis)、熒光光譜或圖 譜、激光粒度（DLS)/ Zeta電位、場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（FSEM)圖、原子力顯微鏡（AFM)圖、投射 電鏡圖、電泳圖。
[0024] 可用于本發(fā)明的功能納米材料載藥系統(tǒng)體外CTCs捕獲研究的手段，可采取但不 局限于下列方法：按照病人血液中CTCs含量（1/10 3_106)，首先向大量的干擾細(xì)胞(諸如白 細(xì)胞、紅細(xì)胞、生物標(biāo)記物不表達(dá)的正常細(xì)胞或其它腫瘤細(xì)胞）中添加一定量的目標(biāo)腫瘤 細(xì)胞或向全血中添加一定量的目標(biāo)腫瘤細(xì)胞，后加入定量的納米材料-雙/多靶向抗體或 適配體絡(luò)合物開展捕獲研究。優(yōu)先推薦使用本發(fā)明中通過單獨(dú)考察PAMAM dendriemrs-雙 抗絡(luò)合物對(duì)懸浮和貼壁HT29細(xì)胞的識(shí)別和捕獲作用，或考察在大量干擾細(xì)胞（白血病細(xì)胞 HL-60或紅細(xì)胞RBCs)存在下，對(duì)少量HT29細(xì)胞的捕獲情況，采用熒光拍照和流式細(xì)胞儀分 析法評(píng)估雙抗絡(luò)合物體外在模擬血液樣本中對(duì)CTCs模型的特異性捕獲效果。
[0025] 可用于本發(fā)明的功能納米材料載藥系統(tǒng)對(duì)臨床病人血液樣本中CTCs的捕獲研究 手段，可采用但不局限于本方法：獲取術(shù)后或化療后腫瘤病人的血液樣本，經(jīng)處理獲取淋巴 細(xì)胞層后，加入納米材料-雙/多靶向抗體或適配體絡(luò)合物共孵育或直接全血中加入納米 材料-雙/多靶向抗體或適配體絡(luò)合物開展捕獲研究。優(yōu)先推薦使用本發(fā)明中通過獲取腫 瘤醫(yī)院的術(shù)后結(jié)腸癌血液樣本，添加定量的PAMAM dendrimers-雙抗絡(luò)合物進(jìn)行捕獲實(shí)驗(yàn)， 血液后期處理后，流式定量分析其捕獲CTCs數(shù)目，激光共聚焦分析其捕獲情況。
[0026] 可用于本發(fā)明的功能納米材料載藥系統(tǒng)對(duì)捕獲CTCs的活性調(diào)控研究手段，可采 用但不局限于下列評(píng)估措施：用MTT、XTT、LDH法測(cè)試納米材料-雙/多靶向抗體絡(luò)合物的 細(xì)胞毒性，用PI染色法、BrdU摻入法等測(cè)試絡(luò)合物影響細(xì)胞周期的分布情況，用Annexin V-FITC/PI、TUNEL、Annexin V-PE/7-AAD、DAPI、AO/EB、Caspase 3/8/9 等染色法評(píng)估細(xì)胞 的凋亡狀況。優(yōu)先推薦本發(fā)明中采用MTT法、形態(tài)學(xué)染色觀察法、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 和細(xì)胞凋亡法深入探索PAMAM dendrimers-雙抗絡(luò)合物對(duì)捕獲CTCs活性的抑制機(jī)理。
[0027] 本發(fā)明的有益效果： (1) 本發(fā)明提供了一種特異性識(shí)別、捕獲和抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的功能納米材料絡(luò)合物 載藥系統(tǒng)，該載藥系統(tǒng)可特異性地識(shí)別、捕獲和抑制血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，從而有望在癌癥 轉(zhuǎn)移的預(yù)警和預(yù)防領(lǐng)域發(fā)揮重要作用； (2) 本發(fā)明提供了將兩種或兩種以上抗體或適配體偶聯(lián)到同一種納米材料表面的技術(shù) 信息，該制備方法簡(jiǎn)單，易于操作，反應(yīng)條件溫和，對(duì)設(shè)備的要求低，且具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前 旦 -5^ 〇

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為識(shí)別、捕獲和抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的功能納米材料載藥系統(tǒng)的發(fā)明示意 圖。i,納米材料PAMAM dendrimers表面進(jìn)行羧基化修飾；ii,修飾的dendrimers表面 共價(jià)連接兩種抗體（aEpCAM和aSlex); iii-v,所制備的dendrimers-雙抗體載藥系統(tǒng) 在有無干擾細(xì)胞存在下對(duì)目標(biāo)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29的特異性識(shí)別和捕獲；vi，所制備的 dendrimers-雙抗體載藥系統(tǒng)對(duì)捕獲的癌細(xì)胞進(jìn)行活性抑制作用。
[0029] 圖2為實(shí)施例1、2所得的G6 PAMAM dendrimers對(duì)應(yīng)衍生物（CC G6)及抗體絡(luò)合 物（G6-5aEpCAM-5aSlex)的氫核磁圖譜。
[0030] 圖3為實(shí)施例1、2所得的G6 PAMAM dendrimers對(duì)應(yīng)衍生物（CC G6)及抗體絡(luò)合 物（G6-5aEpCAM-5aSlex)的紅外圖譜。
[0031] 圖4為實(shí)施例1、2所得的G6 PAMAM dendrimers對(duì)應(yīng)衍生物（CC G6)及抗體絡(luò)合 物（G6-5aEpCAM-5aSlex)的紫外吸收?qǐng)D譜。
[0032] 圖5為實(shí)施例1、2所得的雙抗絡(luò)合物G6-5aEpCAM-5aSlex的掃描電鏡圖。
[0033] 圖6為實(shí)施例3所得到的熒光標(biāo)記雙抗絡(luò)合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC體外 對(duì)貼壁HT29細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合熒光圖譜。
[0034] 圖7為實(shí)施例3所得到的熒光標(biāo)記雙抗絡(luò)合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC體外 對(duì)非貼壁HT29細(xì)胞的識(shí)別和捕獲熒光圖譜。
[0035] 圖8為實(shí)施例3所得到的熒光標(biāo)記雙抗絡(luò)合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex-FITC在大 量RBCs干擾下對(duì)微量目標(biāo)HT29細(xì)胞的捕獲效率流式分析。
[0036] 圖9為實(shí)施例4所得到的熒光標(biāo)記雙抗絡(luò)合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC對(duì)術(shù) 后結(jié)腸癌病人血樣中微量CTCs的捕獲熒光圖譜。
[0037] 圖10為實(shí)施例4所得到的熒光標(biāo)記雙抗絡(luò)合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC對(duì) 術(shù)后結(jié)腸癌病人血樣中微量CTCs的捕獲流式圖譜。
[0038] 圖11為實(shí)施例5所得的不同濃度的雙抗絡(luò)合物G6-5aEpCAM_3aSlex對(duì)HT29細(xì)胞 的周期分布影響。**表示同等條件下與空白對(duì)照組的比較，/7〈0. 01。
[0039] 圖12為實(shí)施例5所得的不同濃度的雙抗絡(luò)合物G6-5aEpCAM_3aSlex對(duì)HT29細(xì)胞 的凋亡影響。*和**表示同等條件下與空白對(duì)照組的比較， #和##表示同等條件下同一樣 品不同濃度間的比較；當(dāng)為*或#時(shí)，/?〈〇. 05 ;當(dāng)為**或##時(shí)，/?〈0. 01。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0041] 實(shí)施例1 :雙抗體包被的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子絡(luò)合物的制備 有無熒光標(biāo)記抗體包被的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子絡(luò)合物可通過將抗體與聚酰 胺-胺型樹枝狀大分子共價(jià)連接而獲得，從而用于體外對(duì)CTCs的特異性識(shí)別、捕獲和活性 調(diào)控，具體制備過程如圖1所示。
[0042] ( I)聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的完全羧基化修飾： 取甲醇溶解的含有60 mg末端為氨基的第6代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子（G6 PAMM dendrimers)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉甲醇溶液后，用2 ml DMSO溶液溶解完全，后加入246 mg琥珀酰 酐，室溫下避光強(qiáng)磁力攪拌反應(yīng)24 h，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用截留分子量為8, 000?14, 000的 纖維素透析膜在超純水中500 ml X 3中透析24 h，待完全純化后，最后冷凍干燥得到樹狀 大分子表面氨基完全羧酸化的產(chǎn)物CC G6 (G6 -(COOH) 256); (2) 聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的部分乙?；揎棧?將G6 -(COOH) 256溶于pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，使其濃度為0.276 μ g/ml，取8 ml 濃度為0·276 μg/ml的G6-(C00H) 256，加入EDC 302 ng和NHS18L5ng，室溫避光攪拌 活化I h，從而得到樹狀大分子表面部分乙?；闹虚g產(chǎn)物； (3) 聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的雙抗體（aEpCAM)和（aSlex)修飾 取活化后的中間產(chǎn)物溶液lml，加入118.6 μ?濃度為50 yg/ml的aEpCAM溶液和 7. 12 μ 1濃度為500 μ g/ml的aSlex溶液，室溫下避光攪拌過夜，然后經(jīng)透析純化，冷凍 干燥得到樹狀大分子表面偶聯(lián)抗體aEpCAM和aSlex的G6-5aEpCAM-3aSle X雙抗絡(luò)合物； (4) 聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的雙抗體（aEpCAM)和（aSlex)修飾 取活化后的中間產(chǎn)物溶液lml，加入118.6 μ 1濃度為50 μ g/ml的aEpCAM溶液和 11.86 μ 1濃度為500 μ g/ml的aSlex溶液，室溫下避光攪拌過夜，然后經(jīng)透析純化，冷凍 干燥得到樹狀大分子表面偶聯(lián)抗體aEpCAM和aSlex的G6 -5aEpCAM-5aSleX雙抗絡(luò)合物。
[0043] (5)熒光標(biāo)記的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的雙抗體（aEpCAM和aSlex)修飾 取Iml上述活化的產(chǎn)物CC G6,先加入3.56 μ?的aSlex及3.56 μ?的二抗IgG-FITC 溶液室溫下避光反應(yīng)12 h，后加入15 μ 1的aEpCAM-ΡΕ溶液繼續(xù)反應(yīng)12 h，然后經(jīng)產(chǎn)物 透析純化24 h，最后冷凍干燥得到雙熒光標(biāo)記的PE-5aEpCAM-G6-3aSlex-FITC絡(luò)合物。
[0044] (6)熒光標(biāo)記的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的雙抗體（aEpCAM和aSlex)修飾 取Iml上述活化的產(chǎn)物CC G6,先加入5.93 μ?的aSlex及5.93 μ?的二抗IgG-FITC 溶液室溫下避光反應(yīng)12 h，后加入15 μ 1的aEpCAM-ΡΕ溶液繼續(xù)反應(yīng)12 h，然后經(jīng)產(chǎn)物 透析純化24 h，最后冷凍干燥得到雙熒光標(biāo)記的PE-5aEpCAM-G6-5aSlex-FITC絡(luò)合物。
[0045] 實(shí)施例2:雙抗體包被的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子絡(luò)合物的表征 (1)取新制備的一定量的CC G6、G6-5aEpCAM-5aSlex物質(zhì)，分別用700 μ 1的D2O溶 解充分后放置在核磁管中，后用400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀做1H NMR分析。（2)取新制備的 一定量的CC G6、G6-5aEpCAM-5aSlex物質(zhì)，用I3BS (pH 7. 4)溶解充分后，經(jīng)超聲波處理5 min,經(jīng)0.22 μ m的一次性水溶性過濾器過濾后，于DLS/Zeta potential儀測(cè)定各自的水 溶性粒徑及電勢(shì)分布。（3)取新制備的一定量的CC G6、G6-5aEpCAM-5aSleX物質(zhì)，用適量 KBr粉末混勻經(jīng)壓片后，于紅外儀中分別測(cè)試其FTIR圖譜。
[0046] (4)取新制備的一定量的 CC G6、G6-5aEpCAM-5aSlex 物質(zhì)，用 PBS (pH 7.4)將其 溶解配制成一定濃度后，并以PBS (pH 7. 4)為基準(zhǔn)，于Q5000超微量分光光度計(jì)上分別測(cè) 定這些物質(zhì)在波長(zhǎng)210-600 nm的紫外吸收?qǐng)D譜。
[0047] (5)取新制備的G6-5aEpCAM-5aSlex絡(luò)合物，先將導(dǎo)電膠粘結(jié)在樣品座上，后用 毛細(xì)管吸取超聲分散的0.1% (W/W)的該絡(luò)合物水溶液，逐滴滴加在導(dǎo)電膠上，風(fēng)干后放入 掃描電鏡中觀察。
[0048] 表征結(jié)果分析知，CC G6和G6-5aEpCAM_5aSlex的1H NMR圖譜差異（如圖2所 示）顯示出抗體連接前后物質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同，尤其是酯峰的出現(xiàn)，說明了抗體在G6 PAMM dendrimers表面的存在。FTIR圖譜(如圖3所示)中，當(dāng)CCG6連接上抗體aEpCAM和aSlex 后,雖保持在1680-1630 cnT1處的C=O伸縮振動(dòng)，但在1420-1400 cnT1處的C-N伸縮的酰 胺鍵特征吸收峰增強(qiáng)，可見物質(zhì)表面基團(tuán)的差別也反映出雙抗體在納米材料表面的成功偶 聯(lián)。因 CC G6本身在220 nm處沒有紫外吸收，而抗體aEpCAM和aSlex均在220 nm處有 特征紫外吸收值，故選擇220 nm的吸收峰作為判斷抗體是否連接到納米材料上的指標(biāo)。UV 圖譜顯示(如圖4所示)，雖是低濃度的G6-5aEpCAM-5aSlex絡(luò)合物，但在220 nm處仍有特 征吸收峰，可見納米材料表面已成功包被了抗體。所制備的雙抗絡(luò)合物G6-5aEpCAM-5aSlex 有何理化特性呢，將其單分散的水溶液粒子進(jìn)行粒徑和電勢(shì)測(cè)定表明（見表1)，當(dāng)納米材料 CC G6共價(jià)連接雙抗體后，雖電負(fù)特性未有明顯變化，但其水溶性粒徑急劇增大，可見抗體 的存在會(huì)造成一定的聚集趨勢(shì)。掃描電鏡圖譜(如圖5所示)也進(jìn)一步確定了所制備雙抗絡(luò) 合物的形貌和直徑，該絡(luò)合物表面近似球形，水平直徑在100 nm左右。
[0049] 表1為G6 PAMAM dendrimers對(duì)應(yīng)的衍生物（CC G6)及抗體絡(luò)合物 (G6-5aEpCAM_5aSlex)的水溶性直徑和Zeta電勢(shì)。

【權(quán)利要求】
1. 一種功能納米材料載藥系統(tǒng)，其特征在于：所述功能納米材料載藥系統(tǒng)由中心納米 材料載體、表面靶向抗體或適配體、抗癌或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能納米材料載藥系統(tǒng)，其特征在于：所述的中心納米材料 載體為PAMAM dendrimers、金納米顆粒AuNPs、娃納米顆粒SiNPs、磁性納米顆粒MNPs或氧 化石墨烯 graphene oxide。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能納米材料載藥系統(tǒng)，其特征在于：所述的表面靶向靶向 抗體或適配體由兩種或兩種以上能特異性識(shí)別和結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面生物標(biāo)記物的靶 向抗體或適配體組成，所述生物標(biāo)記物為EpCAM、Sialyl Lewis X、HER2、EGFR、ALDH1或 CD44。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能納米材料載藥系統(tǒng)，其特征在于：所述的抗癌或預(yù)防癌 癥轉(zhuǎn)移的藥物包括熊果酸及其衍生物、米非司酮及其衍生物、卡托普利及其衍生物、大黃素 及其衍生物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能納米材料載藥系統(tǒng)，其特征在于：所述的中心納米 材料載體與表面靶向抗體或適配體采用共價(jià)連接方式進(jìn)行，所述共價(jià)連接方式為1-乙 基-(3-甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽/ N-羥基丁二酰亞胺法、親和素/生物素法或 N-羥基丁二酰亞胺/順丁烯二酰亞胺化學(xué)法。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能納米材料載藥系統(tǒng)，其特征在于：所述的功能納米材料 載藥系統(tǒng)通過將所述抗癌或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的藥物與中心納米材料載體進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)、靜電 吸附、物理包埋的方式來制備。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的功能納米材料載藥系統(tǒng)，其特征在于：所述的中心納米材料 載體表面具有反應(yīng)官能團(tuán)，所述反應(yīng)官能團(tuán)為-〇H、_NH2、-C00H或-SH。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的功能納米材料載藥系統(tǒng)，其特征在于：所述的中心納米材料 載體與表面靶向抗體或適配體采用中間連接體進(jìn)行連接，所述中間連接體為羧基化的聚乙 二醇、疏基化的聚乙二醇、hydrazide-polyethylene glycol-dithiol 或 OPSS-PEG-NHS。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK104353082SQ201410639414
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】賈力, 謝靜靜, 陳紅寧 申請(qǐng)人:福州大學(xué)