一種鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗，即通過(guò)篩選獲得新型的鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1，并以該結(jié)構(gòu)蛋白VP1作為抗原來(lái)制備鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明中鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發(fā)明利用原核表達(dá)性載體構(gòu)建了能表達(dá)鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)出了28kD重組目的蛋白。將重組蛋白純化后制備成基因工程亞單位疫苗，免疫4月齡麻鴨，免疫后可以使孵化的雛鴨獲得免疫保護(hù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫 苗。

【背景技術(shù)】
[0002] 鴨病毒性肝炎是由鴨甲肝病毒（Duck h印atitis A viral，DHAV)和鴨星狀病毒 (Duck astrovirus)引起的一種高度致病、傳播迅速的病毒性疾病，該疾病主要出現(xiàn)在1-3 周齡的雛鴨上，死亡率高達(dá)90%以上。而且鴨甲肝病毒呈世界范圍分布，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)極大 的損失。
[0003] 鴨甲肝病毒是小RNA病毒科禽肝病毒屬的唯一成員，主要分為3個(gè)基因型：A型、B 型和C型，對(duì)應(yīng)于三個(gè)血清型DHAV-I、DHAV-2和DHAV-3。其中DHAV-I最早是在1950年從美 國(guó)分離得到的，是經(jīng)典毒株，目前分布于世界各地，也是中國(guó)目前流行的主要毒株。DHAV-2 是分離自臺(tái)灣的新型毒株，主要在臺(tái)灣地區(qū)流行。DHAV-3為最早分離自韓國(guó)的新型毒株，現(xiàn) 在在中國(guó)大陸也有越來(lái)越多的該血清型毒株被分離得到，其與DHAV-I的混和感染往往造 成鴨肝炎疫苗的免疫失敗。研究表明這三種血清型之間無(wú)交叉保護(hù)或者僅有有限的交叉保 護(hù)。
[0004] DHAV的VPl基因由714個(gè)堿基組成，編碼VPl蛋白大小為26. 4kD，含有多個(gè)DHAV 抗原表位，是鴨肝炎病毒主要的保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng)并獲得免疫 保護(hù)，是設(shè)計(jì)DHAV新型疫苗的首選目標(biāo)基因。付玉志等（2012)通過(guò)將鴨肝炎病毒VPl基因 插入甲病毒復(fù)制子PSCAl載體中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pSCAl/VPl，構(gòu)建I型鴨肝炎病毒VPl 基因的自殺性DNA疫苗，并對(duì)其在細(xì)胞中的表達(dá)和對(duì)雛鴨的免疫保護(hù)效果進(jìn)行研究，結(jié)果 表明，pSCAl/VPl不僅可以明顯誘導(dǎo)雛鴨淋巴細(xì)胞增殖，而且可以誘導(dǎo)雛鴨產(chǎn)生較高滴度的 DHAV特異性抗體，并對(duì)雛鴨有良好的免疫保護(hù)作用。張婧等將已建立的鴨瘟病毒TK基因 缺失轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行改造，在其綠色熒光表達(dá)盒內(nèi)插入I型鴨肝炎病毒VPl基因，構(gòu)建含有I 型鴨肝炎病毒VPl基因的重組鴨瘟病毒，并初步證實(shí)該重組病毒能夠在真核細(xì)胞中正確表 達(dá)VPl基因和綠色熒光蛋白的融合蛋白，為構(gòu)建鴨瘟和鴨病毒性肝炎二價(jià)基因工程疫苗的 研究奠定了基礎(chǔ)。
[0005] 但近年來(lái)我國(guó)DHAV-3導(dǎo)致的鴨病毒性肝炎頻繁爆發(fā)，且在一些地區(qū)與DHAV-I的 共流行，表明已有的疫苗已起不到有效的保護(hù)作用。而目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)上市的鴨病毒性 肝炎疫苗（鴨病毒性肝炎弱毒株A66株、CH60株）均為DHAV-I株，還未見(jiàn)DHAV-3疫苗株 出現(xiàn)。因此開(kāi)發(fā)DHAV-3的新型疫苗株對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展無(wú)疑具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗，即通過(guò)篩選獲得新型 的鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1，并以該結(jié)構(gòu)蛋白VPl作為抗原來(lái)制備鴨甲肝病毒基因工程亞 單位疫苗。
[0007] 本發(fā)明首先提供一種鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:1 ；
[0008] 上述蛋白的一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2 ;
[0009] 本發(fā)明還提供一種鴨甲肝病毒基因工程重組亞單位疫苗，其中的抗原為上述的鴨 甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1，其濃度為0. 1-lmg/ml之間；
[0010] 本發(fā)明的鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗，其制備步驟如下：
[0011] 1)將VPl基因表達(dá)載體中，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒；
[0012] 2)將構(gòu)建的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建了能表達(dá)鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl的 重組基因工程菌；用該重組基因工程菌表達(dá)出鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl ;
[0013] 3)對(duì)重組表達(dá)的VPl蛋白進(jìn)行純化后，加入白油佐劑制成疫苗。
[0014] 本發(fā)明利用pET28a(+)表達(dá)性載體構(gòu)建了能表達(dá)鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl的大腸 桿菌BL21(DE3)宿主菌。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)出了 28kD重組目的蛋白。將重組蛋白純 化后制備成基因工程亞單位疫苗，免疫4月齡麻鴨（產(chǎn)蛋種），免疫后可以使孵化的雛鴨獲 得免疫保護(hù)。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 申請(qǐng)人:在獲得一個(gè)具有自身免疫特性的新的鴨甲肝病毒基因的基礎(chǔ)上，通過(guò) pET28a(+)原核表達(dá)載體構(gòu)建出能表達(dá)鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl的大腸桿菌BL21(DE3)重 組基因工程菌，通過(guò)對(duì)工程菌的誘導(dǎo)、超聲破碎、蛋白純化、定量、與佐劑配比等制備和生產(chǎn) 方法制備出了鴨甲肝病毒基因工程重組亞單位疫苗。
[0016] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是， 在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案的情況下可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或 替換，這些修改和替換均落入本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。
[0017] 實(shí)施例1DHAV-3的VPl基因的篩選
[0018] 1、2012年5月青島某養(yǎng)鴨場(chǎng)爆發(fā)了鴨病毒性肝炎，導(dǎo)致鴨場(chǎng)很多鴨子死亡。但爆 發(fā)鴨病毒性肝炎的鴨群已經(jīng)注射過(guò)市售的鴨病毒性肝炎疫苗，因此推測(cè)致病的病原發(fā)生了 遺傳上的變異，因此，選用上述的發(fā)病鴨作為樣品進(jìn)行致病基因的分離。
[0019] 首先將發(fā)病鴨的肝臟病料用無(wú)菌生理鹽水研磨，反復(fù)凍融3次，加入雙抗（青鏈霉 素，1000U/ml)，尿囊腔接種11-13日齡的SPF鴨胚，0.2ml/枚。照蛋觀(guān)察，24h內(nèi)死亡者棄 去。分別取24-96小時(shí)死亡高峰期死亡的鴨胚的尿囊液、胚體，-20°C凍存，并觀(guān)察死亡胚體 及肝臟有無(wú)特征性鴨肝炎癥狀。連傳3代，分離獲得毒株命名為VF-3。
[0020] 2、取病變明顯的毒株VF-3的尿囊液，按Trizol試劑盒的方法提取總RNA，并進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以合成的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增DHAV-3的VPl基因，引物序列如 下：
[0021] Pl:5' -cgcggatcctccaatcagcttggt-3 '
[0022] P2 :5' -aagctttta ttcaatctccagatg-3'
[0023] 擴(kuò)增的條件如下：94°C 5min 變性，94°C 30S，65°C 30S，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，72DC 延伸lOmin。
[0024] 擴(kuò)增產(chǎn)物大小約714bp，進(jìn)行測(cè)序后將VPl基因序列在NCBI上Blast比對(duì)，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)與DHAV-3FX株（登錄號(hào)：KF826745)的同源性最高，為95%，推導(dǎo)的蛋白序列同源性最 高為92%，表明毒株VF-3為發(fā)生變異的DHAV-3病毒株。其VPl基因翻譯的氨基酸序列為 SEQ ID NO : 1。
[0025] 實(shí)施例2基因工程蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與工程菌的獲得
[0026] 1、上述擴(kuò)增得到的VPl基因蛋白基因 BamH I和Hind III雙酶切后連入pET28a 載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pET28a/VPl表達(dá)載體。
[0027] 2、用CaCl2法將pET28a/VP 1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)，涂布于含 50 μ g/ml卡那霉素的瓊脂平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。選取10個(gè)單菌落提取質(zhì)粒，BamH I和Hind III雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性的菌落進(jìn)一步測(cè)序鑒定。將測(cè)序驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵 培養(yǎng)至〇. 6?0. 8時(shí)加入0. 3mMIPTG誘導(dǎo)4?5小時(shí)，離心收集菌體跑SDS-PAGE電泳，同 時(shí)設(shè)立未誘導(dǎo)菌體作為對(duì)照。結(jié)果誘導(dǎo)后陽(yáng)性克隆比對(duì)照菌在28kD處多出一條蛋白條帶， 與重組蛋白理論分子量一致，表達(dá)量約為35%以上。經(jīng)DHAV-3抗體免疫印跡檢定,顯示陽(yáng) 性反應(yīng)。證明獲得的陽(yáng)性克隆為高效表達(dá)基因工程蛋白的工程菌，命名為YG株。
[0028] 實(shí)施例3發(fā)酵、純化與鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗的制備
[0029] 1、發(fā)酵工藝
[0030] DLB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 · 7H20的LB培養(yǎng)基 作為發(fā)酵培養(yǎng)基，補(bǔ)料為葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、 MgSO4 · 7H20 5g/L。
[0031] 2)發(fā)酵過(guò)程
[0032] 挑取鑒定過(guò)的工程菌接種于含卡那霉素的濃度為50 μ g/ml的LB培養(yǎng)基，37°C振 蕩培養(yǎng)8小時(shí)，作為種子液。將種子液按2%接種量接種于發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)好各參數(shù)，37°C， 200轉(zhuǎn)，溶氧控制在20%以上。發(fā)酵4小時(shí)后開(kāi)始流加補(bǔ)料，發(fā)酵6小時(shí)后加入0. 3mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)后6小時(shí)發(fā)酵結(jié)束。
[0033] 3)鎳柱純化、脫鹽
[0034] 4)親和層析
[0035] 采用鎳離子金屬螯合層析柱，重組蛋白可以用含300mmol/L咪唑的洗脫液洗下 來(lái)，純度達(dá)到90%以上
[0036] 5)脫鹽
[0037] 收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外液，透析脫鹽后用甲醛滅活 后測(cè)蛋白濃度，用PBS液稀釋至0. 5mg/ml，0. 22 μ m過(guò)濾除菌，即得重組蛋白液。
[0038] 2、鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗的制備
[0039] 將制備的重組蛋白96份與滅菌的4份吐溫-80充分?jǐn)嚢杌旌献鳛樗唷Ｍ瑫r(shí)注 射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸鋁2份，混合均勻，高壓滅菌后作為油相。按水相 和油相1:3比例混合乳化即可制備鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗。將制備的疫苗按獸用 生物制品規(guī)程的檢驗(yàn)方法進(jìn)行性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果表明疫苗各項(xiàng)指標(biāo)均合 格。
[0040] 具體操作如下：
[0041] 1菌毒種
[0042] I. 1制造用菌種為鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗生產(chǎn)菌株YG株；檢測(cè)用的強(qiáng)毒 株為DHAV-3強(qiáng)毒株VF-3。
[0043] I. 2生產(chǎn)用菌種標(biāo)準(zhǔn)
[0044] I. 2. 1形態(tài)和生化特性
[0045] 含有卡那霉素的LB瓊脂平板上過(guò)夜培養(yǎng)，在培養(yǎng)板上呈現(xiàn)圓形、邊緣整齊、突起、 乳白色有光澤的光滑菌落，革蘭氏染色后，鏡下顯示為革蘭氏陰性短桿菌；生化試驗(yàn)結(jié)果均 為葡萄糖發(fā)酵+，吲哚試驗(yàn)+，甲基紅試驗(yàn)+，VP-，枸櫞酸利用試驗(yàn)_。
[0046] 1. 2. 2培養(yǎng)特性可在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
[0047] 1. 2. 3鑒別檢驗(yàn)
[0048] 1. 2. 3. IPCR檢測(cè)將本菌的LB液體培養(yǎng)物3 μ 1做模板，用以下PCR引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，應(yīng)能擴(kuò)增出714bp左右的片段。
[0049] Pl:5' -cgcggatcctccaatcagcttggt-3'
[0050] P2 :5' -aagctttta ttcaatctccagatg-3'
[0051] 擴(kuò)增的條件如下：94°C 5min 變性，94°C 30S，65°C 30S，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸lOmin。
[0052] I. 2. 3. 2Western_blot檢測(cè)將LB固體培養(yǎng)平板上的重組菌單菌落接種于5ml含 有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D_值在0. 6?I. O之間時(shí)加入0. 8mM的IPTG誘 導(dǎo)，持續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，收集菌體，用PBS重懸后高壓勻質(zhì)破碎，8000r/min離心去沉淀，上清液 與抗鴨甲肝病毒3型陽(yáng)性血清進(jìn)行Western-blot試驗(yàn)，應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶。
[0053] 1.2. 4純粹用適宜培養(yǎng)基檢查，應(yīng)純粹。
[0054] 1.2. 6基礎(chǔ)種子代次F4?FlO代。
[0055] L 2. 7保存凍干菌種，-20°C，保存期為2年。
[0056] 2疫苗制造及半成品檢驗(yàn)
[0057] 2. 1生產(chǎn)用種子制備
[0058] 2. I. 1 -級(jí)種子繁殖和鑒定將凍干菌種分別接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C振蕩培養(yǎng)8?10小時(shí)，然后劃線(xiàn)接種于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng) 16?18小時(shí)，作為一級(jí)種子。在2?8°C保存，不超過(guò)14天；在培養(yǎng)基上傳代，應(yīng)不超過(guò)2 代。
[0059] 2. 1. 2二級(jí)種子繁殖在一級(jí)種子中選取符合1. 2. 1項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落10個(gè)混合 于少量LB培養(yǎng)液中，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)8?10小時(shí)，進(jìn)行純粹檢 驗(yàn)，應(yīng)純粹。置2?8°C保存，應(yīng)不超過(guò)3天。
[0060] 2. 2制苗用培養(yǎng)基為改良LB培養(yǎng)基，每IOOOml培養(yǎng)基中含胰蛋白胨10g，酵母浸 粉 5g，氯化鈉 10g，葡萄糖 5g，MgSO4 · 7H20 5g。
[0061] 2. 3制苗用抗原液制備
[0062] 2. 3. 1菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按培養(yǎng)罐容積裝入適量培養(yǎng)基（70 %左右）及 消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基量的2%接種二級(jí)種子菌液，37°C通氣培養(yǎng)，待菌液的0D_值達(dá)到 7.0時(shí)，加入8g/L的α-乳糖誘導(dǎo)，再繼續(xù)培養(yǎng)6?8小時(shí)。使用20% NaOH調(diào)節(jié)pH在7.0， 通過(guò)轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)控制溶氧在20%以上。當(dāng)溶氧迅速上升時(shí)，流加補(bǔ)料。
[0063] 2. 3. 2破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體。收集的菌體用PBS清洗2次，將收集的菌 體用PBS制成10%的懸液，在4°C下用高壓勻漿機(jī)破碎細(xì)菌。破碎后的菌液，8000r/min，離 心15分鐘，收集上清液。
[0064] 2. 3. 3鎳柱層析純化收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外液，透 析脫鹽后即得重組蛋白液。
[0065] 2. 3. 4滅活將純化的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，甲醛溶液的最終濃度 為0.2%，37°C滅活12小時(shí)，以滅活殘存的大腸桿菌。取少量樣品進(jìn)行半成品檢驗(yàn)。2? 8°C保存，不超過(guò)7天；-15°C以下保存，不超過(guò)60天。
[0066] 2. 4半成品檢驗(yàn)
[0067] 2. 4. IVPl含量檢測(cè)用BCA法檢測(cè)上清液蛋白濃度，稀釋至終濃度0. 5mg/ml，無(wú)菌 過(guò)濾，待用。
[0068] 2. 4. 2無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0069] 2. 4. 3內(nèi)毒素含量檢測(cè)按鱟試劑方法進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，內(nèi)毒素含量不高于 1000EU/ml者方可用于制苗。
[0070] 2. 5疫苗制備
[0071] 2.5. 1油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份。在油相罐中混合均勻，力口 熱融化至半透明狀，再加司本-806份，至溫度達(dá)到125?130°C時(shí)維持30分鐘，冷卻至室溫 備用。
[0072] 2. 5. 2水相制備取滅菌的吐溫-804份，加檢驗(yàn)合格的半成品96份，充分?jǐn)嚢柚镣?溫-80完全溶解。
[0073] 2. 5. 3乳化取油相3份置于高速剪切機(jī)內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)低速攪拌，同時(shí)緩緩加入水相 1份，再以3600r/min乳化40分鐘，在終止攪拌前加入1 %硫柳汞溶液，終濃度達(dá)到0. 01 %。 乳化后，取樣IOml加入離心管，以3000r/min離心15分鐘，管底析出水相應(yīng)不超過(guò)0. 5ml。
[0074] 2. 5. 4分裝定量分裝，密封瓶口。
[0075] 3成品檢驗(yàn)
[0076] 3. 1物理性狀
[0077] 外觀(guān)為乳白色乳劑。
[0078] 劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均應(yīng)不 擴(kuò)散。
[0079] 穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，經(jīng)3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相 應(yīng)不超過(guò)0. 5ml。
[0080] 黏度按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，符合規(guī)定。
[0081] 裝量檢查按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，符合規(guī)定。
[0082] 3. 2無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0083] 3. 3安全檢驗(yàn)取1日齡雛鴨10只，肌肉或頸部皮下注射疫苗0. 5ml/只，觀(guān)察14 天，不出現(xiàn)由疫苗引起的局部和全身不良反應(yīng)。
[0084] 3. 4效力檢驗(yàn)下列方法任擇其一。
[0085] 3. 4. 1抗體檢測(cè)將4月齡麻鴨（產(chǎn)蛋種）10只平均分為兩組，第一組為免疫組，用 制備的鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗進(jìn)行二次免疫（第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免 疫，每次每只〇. 5ml，皮下注射），第二次免疫14天后測(cè)對(duì)DHAV-3的血清中和抗體效價(jià)。第 二組為對(duì)照組，注射同等體積的無(wú)菌生理鹽水。免疫組的血清中和抗體效價(jià)均應(yīng)> 1:152， 而對(duì)照組中和抗體效價(jià)均應(yīng)< 1:4。
[0086] 3. 4. 2攻毒保護(hù)將4月齡麻鴨（產(chǎn)蛋種）10只平均分為二組，每組5只。第一組 為免疫組，用本發(fā)明制備的鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗進(jìn)行二次免疫（第一次免疫21 天后進(jìn)行第二次免疫，每次每只〇. 5ml，皮下注射），第二組為生理鹽水對(duì)照組，注射同等體 積的無(wú)菌生理鹽水。第二次免疫后21-28天收集各組鴨所產(chǎn)的鴨蛋進(jìn)行孵化，分別與雛鴨 出殼后的14天各隨機(jī)取10只，用DHAV-3強(qiáng)毒株VF-3 (IOOLD5tl)注射攻毒，攻毒14天后統(tǒng) 計(jì)攻毒保護(hù)率（未死亡的只數(shù)占總只數(shù)的百分率）。免疫組應(yīng)至少保護(hù)8只，對(duì)照組全部死 亡。
[0087] 3. 5甲醛、汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，均符合規(guī)定。
[0088] 實(shí)施例4鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗免疫后的抗體效價(jià)
[0089] 將4月齡麻鴨（產(chǎn)蛋種）10只平均分為兩組，第一組為免疫組，用制備的鴨甲肝 病毒基因工程亞單位疫苗進(jìn)行二次免疫（第一次免疫21天后進(jìn)行第二次免疫,每次每只 〇. 5ml，皮下注射），第二次免疫14天后測(cè)對(duì)DHAV-3的血清中和抗體效價(jià)。第二組為對(duì)照 組，注射同等體積的無(wú)菌生理鹽水。結(jié)果表明免疫組的血清中和抗體效價(jià)均> 1:128,而對(duì) 照組中和抗體效價(jià)均為陰性。
[0090] 表1 :鴨甲肝病毒基因工程亞單位疫苗免疫后的抗體效價(jià)
[0091]

【權(quán)利要求】
1. 一種鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因，其特征在于，所述的基因的編碼蛋白的氨基酸 序列為 SEQ ID N0:1。
2. 如權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
3. -種鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
4. 權(quán)利要求1所述的鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因在制備疫苗中的應(yīng)用。
5. -種鴨甲肝病毒亞單位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原為權(quán)利要求3所述的 鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1蛋白。
6. 如權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1蛋白 的濃度為〇? l-lmg/ml。
7. 權(quán)利要求5所述的疫苗的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括有如下的步 驟： 1) 將VP1基因連接入表達(dá)載體中，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒； 2) 將構(gòu)建的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建能表達(dá)鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的重組基 因工程菌；用該重組基因工程菌表達(dá)出鴨甲肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1 ; 3) 對(duì)重組表達(dá)的VP1蛋白進(jìn)行純化后，加入白油佐劑制成疫苗。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK104372013SQ201410668062
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】王宏華 申請(qǐng)人:青島宏昊生物科技有限公司