一種抗菌肽ap-57及其制備方法和應(yīng)用方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗菌肽AP-57及其制備方法和應(yīng)用方法，抗菌肽AP-57，為多肽，含有57個(gè)氨基酸；制備方法包括以下步驟：將人源AP-57真核表達(dá)核酸序列優(yōu)化為適用于大腸桿菌表達(dá)的核酸序列；將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至工程化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞；挑單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)；親和層析；陽(yáng)離子交換層析；最后質(zhì)譜鑒定。本發(fā)明具有廣譜抗病原微生物的功能，包括抗細(xì)菌，抗真菌，抗病毒，抗支原體，為具有多種生物學(xué)功能的新型人源抗菌肽；AP-57抗菌肽具有顯著的抗細(xì)菌和抗真菌效果，具有非常顯著的抗包膜病毒和支原體的效果，在抑制微生物生長(zhǎng)，繁殖和散播，預(yù)防或治療病原微生物感染方面具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種抗菌肽AP-57及其制備方法和應(yīng)用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種抗菌肽AP-57及其制備 方法和應(yīng)用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微生物感染，包括細(xì)菌，真菌，病毒等，能夠引發(fā)很多包括肝炎，肺炎，艾滋病，肺結(jié) 核等在內(nèi)的非常嚴(yán)重的人類(lèi)疾病。病原微生物引起的傳染性流行病始終是導(dǎo)致人死亡的重 要病因之一。
[0003]抗生素發(fā)明以來(lái)，挽救了無(wú)數(shù)細(xì)菌感染患者的生命。然而大量抗生素的使用，不僅 會(huì)給患者帶來(lái)很多副作用，也造成了大量耐藥株的滋生。而且抗生素對(duì)于病毒性感染往往 難以起效。
[0004]抗菌肽是具有抗菌活性短肽的總稱(chēng)。1975年瑞典科學(xué)家G.Boman等人從惜古比天 蠶蛹中誘導(dǎo)分離得到一種殺菌肽，并將其命名為天蠶素（cecropin)。此后，人們相繼從細(xì) 菌、真菌、兩棲類(lèi)、昆蟲(chóng)、高等植物、哺乳動(dòng)物乃至人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)并分離獲得多種具有抗菌活性 的多肽，如娃皮素（magainins)、蜂毒素（melittins)，防御素（defensins)等。由于這類(lèi)活 性多肽對(duì)細(xì)菌具有廣譜高效殺菌活性，因而命名為"antibacterialp印itides，ABP"，中文 譯為抗菌肽，其原意為抗細(xì)菌肽。隨著人們研究工作的深入開(kāi)展，發(fā)現(xiàn)某些抗細(xì)菌肽對(duì)部分 真菌、原蟲(chóng)、病毒及癌細(xì)胞等均具有強(qiáng)有力的殺傷作用，因而許多學(xué)者也將其稱(chēng)之為多肽抗 生素（PeptideAntibiotics)，以及抗微生物膚（Antimicrobialpeptides，AMP)。另外，也 有報(bào)道一些抗菌肽具有促進(jìn)凝血，促進(jìn)傷口愈合，抗炎，調(diào)節(jié)免疫方面的功能。這些內(nèi)源性 的抗菌肽在機(jī)體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用。
[0005] 防御素（defensins)是分子量較小的（一般60個(gè)氨基酸以下，少數(shù)具有100多個(gè) 氨基酸）富含半胱氨酸的（一般含有6至8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，形成3至4對(duì)二硫鍵） 陽(yáng)離子蛋白質(zhì)，屬于抗微生物肽的一類(lèi)。廣泛存在于植物，低等動(dòng)物到哺乳動(dòng)物在內(nèi)的生物 類(lèi)群中。到目前為止人類(lèi)中共發(fā)現(xiàn)上百種防御素，每種防御素均含有6個(gè)半胱氨酸，每種防 御素都具有獨(dú)特的表達(dá)和功能特征。根據(jù)結(jié)構(gòu)及分布特征人源防御素分為a型和0型。 另外，近年來(lái)在恒河猴中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀防御素0 -Defensin。防御素是生物長(zhǎng)期與疾病斗爭(zhēng)中 進(jìn)化而來(lái)的，也是其自身防御體系的重要組成部分，也具有抗多種微生物，抗腫瘤，促進(jìn)凝 血和傷口愈合，抗炎，調(diào)節(jié)免疫等功能。
[0006]在食品安全事件頻發(fā)，耐藥性、藥殘、抗生素濫用等棘手問(wèn)題破待解決的當(dāng)前，很 多科學(xué)家和企業(yè)家將抗菌肽視為最有希望的抗生素替代品。大部分抗菌肽具有穿透細(xì)胞 膜，造成有胞膜不完整而至胞漿外溢，從而殺傷目標(biāo)微生物和細(xì)胞的作用。其直接破膜殺傷 的作用機(jī)制使得靶微生物不易產(chǎn)生耐藥性。一些抗菌肽，如乳鏈菌肽早已被批準(zhǔn)用于抗菌 的食品添加劑。因此，一種新的抗菌肽的發(fā)現(xiàn)具有較大的潛在應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)一的技術(shù)方案
[0008]自然界各種生物中存在非常多種類(lèi)的抗菌肽。人源抗菌肽至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上百 種，其中含有二硫鍵的抗菌肽大部分劃分為防御素。近十年來(lái)，非人源抗菌肽仍然不斷被人 們發(fā)現(xiàn)和鑒定出來(lái)，但是新的人源抗菌肽的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)非常罕見(jiàn)。
[0009] 有關(guān)AP-57多肽，前人的研究報(bào)道揭示了一些其可能與免疫調(diào)節(jié)，結(jié)腸癌腫瘤細(xì) 胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)的功能，這些報(bào)道并不能推測(cè)和預(yù)見(jiàn)AP-57具備抗菌肽功效。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)一的缺點(diǎn)
[0011] 雖然人們已經(jīng)從自然界多種生物中分離鑒定了非常多種類(lèi)的抗菌肽，每種抗菌肽 都具有對(duì)抗微生物的基本特征，但是不同的抗菌肽又具備不同的抗菌譜和抗菌效果。可以 說(shuō)每種抗菌肽都有自身獨(dú)特的功效。特別是被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的人源抗菌肽種類(lèi)卻相對(duì)較少。 我們知道，其它物種來(lái)源的抗菌肽應(yīng)用于人體很有可能會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，因此異種來(lái) 源抗菌肽在人用藥物開(kāi)發(fā)上非常受限。
[0012] 檢索近十年的文獻(xiàn)我們知道，新的人源抗菌肽的發(fā)現(xiàn)和報(bào)道已經(jīng)非常罕見(jiàn)。本發(fā) 明AP-57抗菌肽序列與現(xiàn)已有報(bào)道的抗菌肽在序列在同源性方面顯著不同。因此本發(fā)明 AP-57抗菌肽具備非常大的潛在應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值，特別是在人用抗微生物感染藥物開(kāi)發(fā)方面。
[0013] 現(xiàn)有技術(shù)二的技術(shù)方案
[0014] 現(xiàn)有含有二硫鍵的抗菌肽的生產(chǎn)多采用固相合成或酵母表達(dá)，使用方便快捷又經(jīng) 濟(jì)的大腸桿菌胞質(zhì)表達(dá)還是比較困難，成功的報(bào)道并不多見(jiàn)。也有一些使用大腸桿菌表達(dá) 抗菌肽成功的報(bào)道，但其生產(chǎn)制備工藝并不能廣譜適用于其它抗菌肽的制備?？梢哉f(shuō)不同 的抗菌肽，都具有不同的分子量，等電點(diǎn)，疏水性，空間結(jié)構(gòu)等特征，因此就應(yīng)該具有不同的 生產(chǎn)制備工藝。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)二的缺點(diǎn)
[0016] 多肽的固相合成適用于氨基酸數(shù)目少，二硫鍵少的目標(biāo)多肽。對(duì)于氨基酸數(shù)目和 二硫鍵多的蛋白質(zhì)，其生產(chǎn)和質(zhì)控比較困難，生產(chǎn)成本也較高。
[0017] 酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于氨基酸數(shù)目和二硫鍵多的目的蛋白質(zhì)比較適用。但是和大腸桿 菌表達(dá)系統(tǒng)相比，仍然存在明顯的生產(chǎn)成本高的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種抗菌肽AP-57及其制備方法和應(yīng)用方法，旨在 解決現(xiàn)有的技術(shù)存在的人源抗菌肽種類(lèi)相對(duì)較少，肽的固相合成適用于氨基酸數(shù)目少，二 硫鍵少的目標(biāo)多肽，對(duì)于氨基酸數(shù)目和二硫鍵多的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)和質(zhì)控比較困難，生產(chǎn)成本 較高的問(wèn)題。
[0019] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種抗菌肽AP-57,該抗菌肽AP-57,為多肽，對(duì)應(yīng)C10orf99 基因表達(dá)產(chǎn)物去掉信號(hào)肽之后的成熟蛋白序列，含有57個(gè)氨基酸，序列為：
[0020] KRRPAKAWSGRRTRLCCHRVPSPNSTNLKGHHVRLCKPCKLEPEPRLWVVPGALPQV；
[0021] 理論分子量為：6. 52D;理論等電點(diǎn)為11. 28 ;為強(qiáng)陽(yáng)離子雙親性抗菌肽。
[0022] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種抗菌肽AP-57的制備方法，該抗菌肽AP-57的制 備方法包括以下步驟：
[0023] 步驟一，序列優(yōu)化與載體構(gòu)建：首先將人源AP-57真核表達(dá)核酸序列優(yōu)化為適用 于大腸桿菌表達(dá)的核酸序列，并構(gòu)建于基因工程化pET28a載體上。
[0024] 步驟二質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和小量培養(yǎng)：將工程化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化，吸 取20-100ill置于1.5mlEP管中。加入1-2ill質(zhì)粒，輕輕混勻，在冰上靜置20-30min。然 后于42°C水浴中熱激60-90s，隨后立即冰浴2min。添加900ill未加抗生素的LB培養(yǎng)基 中，于37°C恒溫?fù)u床孵育lh。6000rpm離心3min，去上清液，100-200y1LB重懸菌液，吹打 混勻后涂布于加了抗生素的LB固體培養(yǎng)皿上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性單菌落接種于 裝有4mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C，220rpm振搖過(guò)夜，按1 : 1000的比例取上述菌液 轉(zhuǎn)接于裝有l(wèi)〇〇mlLB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C，220rpm振搖培養(yǎng)至0D600達(dá)到0. 6。
[0025] 步驟三，擴(kuò)大培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)：再按1 : 1000的比例取上述菌液轉(zhuǎn)接于裝有 1000-2000mlLB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，37 °C，220rpm振搖培養(yǎng)至0D600達(dá)到1. 0，添加 0. 5-lmmol/LIPTG，37°C誘導(dǎo)6h，收集菌體重懸于上樣緩沖液中（50mMNaH2P04. 2H20,0. 5M NaCl，pH8. 0)，在高壓均質(zhì)機(jī)中破碎。然后于4°C，13000rpm條件下離心機(jī)30-40min，取上 清于0. 22iim濾器過(guò)濾后，用于后續(xù)純化；
[0026] 步驟四，親和層析：將步驟三中裂解上清上樣至已裝好親和填料的層析柱，用3倍 柱體積的上樣緩沖液淋洗后，用洗脫緩沖液（50mMNaH2P04. 2H20,0. 5MNaCl，500mM咪唑， PH8.0)洗脫，收集流出峰蛋白樣品。
[0027] 步驟五，陽(yáng)離子交換層析：將蛋白樣品經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酶切后上樣于已裝好陽(yáng)離子填料 的層析柱，用平衡緩沖液（20mMTris，pH8. 5)淋洗后，用洗脫緩沖液（2MNaCl，20mMTris， PH8.5)洗脫，收集流出峰蛋白，留樣做SDS-PAGE電泳分析和質(zhì)譜驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)離子交換層析 后能夠得到高純度的人AP-57。
[0028] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種抗菌肽AP-57的應(yīng)用方法，該抗菌肽AP-57具有 廣譜抗病原微生物的功能，包括抗細(xì)菌，抗真菌，抗病毒，抗支原體；含有57個(gè)氨基酸的多 肽，命名為AP-57。
[0029] 本發(fā)明提供的抗菌肽AP-57及其制備方法和應(yīng)用方法，通過(guò)大規(guī)模表達(dá)和活性檢 測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)通過(guò)大腸桿菌基因工程重組表達(dá)的一個(gè)多肽，具有類(lèi)似防御素的功能；本發(fā)明 也提供了該多肽簡(jiǎn)單高效的制備方法，同時(shí)該多肽屬于人源多肽，方便應(yīng)用于人用藥物的 開(kāi)發(fā)，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)抗病原微生物的藥物，具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。本發(fā)明具有多種生物學(xué)功 能的新型人源抗菌肽具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值，AP-57抗菌肽具有顯著的抗細(xì)菌和抗真菌 效果，具有非常明顯的抗包膜病毒和支原體的效果，在抑制微生物生長(zhǎng)，繁殖和散播，預(yù)防 或治療病原微生物感染方面具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。此外本發(fā)明提供了AP-57簡(jiǎn)單高效 的生產(chǎn)制備技術(shù)方案，方便于AP-57抗菌肽應(yīng)用于抗微生物感染藥物的開(kāi)發(fā)，具有較大的 應(yīng)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的抗菌肽AP-57的制備方法流程圖；
[0031] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57同源性對(duì)比分析示意圖；
[0032] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57在大腸桿菌中可溶性誘導(dǎo)表達(dá)示意圖；
[0033] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57在大腸桿菌中不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)分析示 意圖；
[0034] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57在大腸桿菌中不同誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)AP-57表達(dá)分 析示意圖；
[0035] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的鎳柱親和層析純化AP-57的SDS-PAGE電泳結(jié)果示意 圖；
[0036] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的陽(yáng)離子層析純化AP-57的SDS-PAGE電泳結(jié)果示意圖； [0037]圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57對(duì)大腸埃希菌（ATCC25922)運(yùn)動(dòng)能力的抑制 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
[0038] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57對(duì)金黃色葡萄球菌（ATCC25923)的抑菌實(shí)驗(yàn) 結(jié)果圖；
[0039] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57對(duì)放線(xiàn)菌（臨床患者分離株）的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié) 果圖；
[0040] 圖11是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57對(duì)黑曲霉（ATCC16404)的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
[0041] 圖12是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57對(duì)支原體（臨床患者分離株）的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié) 果圖；
[0042] 圖13是本發(fā)明實(shí)施例提供的AP-57對(duì)慢病毒（HEK293細(xì)胞包裝）感染能力的抑 制實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0044] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0045] 本發(fā)明實(shí)施例的抗菌肽AP-57,為多肽，對(duì)應(yīng)C10orf99基因表達(dá)產(chǎn)物去掉信號(hào)肽 之后的成熟蛋白序列，含有57個(gè)氨基酸，序列為：
[0046] KRRPAKAWSGRRTRLCCHRVPSPNSTNLKGHHVRLCKPCKLEPEPRLWVVPGALPQV；
[0047] 理論分子量（MW)為：6.52D;理論等電點(diǎn)（pi)為11.28;為強(qiáng)陽(yáng)離子雙親性抗菌 肽，該多肽具有廣譜抗病原微生物的功能，包括抗細(xì)菌，抗真菌，抗病毒，抗支原體。
[0048] 新型抗菌肽，具有廣譜抗微生物的功效，所述抗菌肽具有SEQIDN0 :1所示序列， 含有57個(gè)氨基酸。將其命名為4?-57(抗菌肽-57,4拉11^(^〇1^31口印^(1657)。4?-57多 肽具有廣譜抗微生物的功效，本發(fā)明也提供了所述AP-57抗菌肽的制備方法。同時(shí)該多肽 屬于人源多肽，方便應(yīng)用于人用藥物的開(kāi)發(fā)，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)抗病原微生物的藥物，具有很大 的開(kāi)發(fā)潛力。
[0049] 如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的抗菌肽AP-57的制備方法包括以下步驟：
[0050]S101，序列優(yōu)化與載體構(gòu)建：首先將人源AP-57真核表達(dá)核酸序列優(yōu)化為適用于 大腸桿菌表達(dá)的核酸序列，并構(gòu)建于基因工程化pET28a載體上。
[0051] S102,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和小量培養(yǎng)：將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，37°C 倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性單菌落接種于裝有4mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C，220rpm振 搖過(guò)夜，按1 : 1000的比例取上述菌液轉(zhuǎn)接于裝有l(wèi)〇〇mlLB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C， 220rpm振搖培養(yǎng)至0D600達(dá)到0. 6。
[0052]S103,擴(kuò)大培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)：再按1 : 1000的比例取上述菌液轉(zhuǎn)接于裝有 1000-2000mlLB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C，220rpm振搖培養(yǎng)至0D600達(dá)到1.0，添加 0. 5-lmmol/LIPTG，37°C誘導(dǎo)6h，收集菌體重懸于上樣緩沖液中（50mMNaH2P04. 2H20,0. 5M NaCl，pH8. 0)，在高壓均質(zhì)機(jī)中破碎。然后于4°C，13000rpm條件下離心30-40min，取上清 于0. 22iim濾器過(guò)濾后，用于后續(xù)純化；
[0053]S104,親和層析：將步驟三裂解上清上樣至已裝好親和填料的層析柱，用3倍柱體 積的上樣緩沖液淋洗后，用洗脫緩沖液（50mMNaH2P04. 2H20,0. 5MNaCl，500mM咪唑，pH8. 0) 洗脫，收集流出峰蛋白樣品。
[0054]S105,陽(yáng)離子交換層析：將蛋白樣品經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酶切后上樣于已裝好陽(yáng)離子填料的 層析柱，用平衡緩沖液（20mMTris，pH8. 5)淋洗后，用洗脫緩沖液（2MNaCl，20mMTris， PH8.5)洗脫，收集流出峰蛋白，留樣做SDS-PAGE電泳分析和質(zhì)譜驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)離子交換層析 后能夠得到高純度的人AP-57。
[0055] 在步驟S101中：
[0056] 在編碼AP-57的57個(gè)氨基酸的真核表達(dá)核酸序列中（SEQIDN0:3)，共有9個(gè)大 腸桿菌稀有密碼子，將其全部替換為大腸桿菌喜好的密碼子。同時(shí)將SEQIDN0 :3中的終 止密碼子替換為大腸桿菌喜好的終止密碼子TGA。最終優(yōu)化后的序列為SEQIDN0 :5;詳細(xì) 替換情況如表1 :
[0057] 表1:編碼AP-57核酸序列的密碼子優(yōu)化
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗菌肽AP-57的制備方法，其特征在于，該抗菌肽AP-57的制備方法包括以下步 驟： 步驟一，序列優(yōu)化與載體構(gòu)建：首先將人源AP-57真核表達(dá)核酸序列優(yōu)化為適用于大 腸桿菌表達(dá)的核酸序列，并構(gòu)建于基因工程化pET28a載體上； 步驟二，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和小量培養(yǎng)：將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，37°C倒 置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性單菌落接種于裝有4ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C，220rpm振搖 過(guò)夜，按1 : 1000的比例取菌液轉(zhuǎn)接于裝有l(wèi)〇〇ml LB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C，220rpm 振搖培養(yǎng)至0D600達(dá)到0. 6 ; 步驟三，擴(kuò)大培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)：再按1 : 1000的比例取菌液轉(zhuǎn)接于裝有1000-2000ml LB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C，220rpm振搖培養(yǎng)至0D600達(dá)到1. 0,添加0. 5-lmmol/L IPTG， 37°C誘導(dǎo)6h，收集菌體重懸于上樣緩沖液中，50mM NaH2P04 ? 2H20,0. 5M NaCl，pH8. 0,在高 壓均質(zhì)機(jī)中破碎，然后于4°C，13000rpm條件下離心30-40min，取上清于0. 22 ii m濾器過(guò)濾 后，用于后續(xù)純化； 步驟四，親和層析：將上清上樣至已裝好親和填料的層析柱，用3倍柱體積的上樣緩 沖液淋洗后，用洗脫緩沖液洗脫，洗脫緩沖液50mM NaH2P04 ? 2H20,0. 5M NaCl，500mM咪唑， pH8. 0,收集流出峰蛋白樣品； 步驟五，陽(yáng)離子交換層析：將蛋白樣品經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酶切后上樣于已裝好陽(yáng)離子填料的層 析柱，用平衡緩沖液，20mM Tris，pH8. 5淋洗后，用洗脫緩沖液2MNaCl，20mM Tris，pH8. 5洗 脫，收集流出峰蛋白，留樣做SDS-PAGE電泳分析和質(zhì)譜驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)離子交換層析后能夠得 到高純度的人AP-57。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗菌肽AP-57的制備方法，其特征在于，在步驟一中，成熟 AP-57的核酸序列174bp : AAGAGGCGTCCTGCCAAGGCCTGGTCAGGCAGGAGAACCAGGCTCTGCTGCCACCGAGTCCCTAGCCCCAAC TCAACAAACCTGAAAGGACATCATGTGAGGCTCTGTAAACCATGCAAGCTTGAGCCAGAGCCCCGCCTTTGGGTGGT GCCTGGGGCACTCCCACAGGTGTAG。
3. 如權(quán)利要求1所述的抗菌肽AP-57的制備方法，其特征在于，在步驟一中，適用于大 腸桿菌表達(dá)的改造后的成熟AP-57的核酸序列174bp : AAGCGCCGTCCTGCCAAGGCCTGGTCAGGCCGCCGCACCCGCCTCTGCTGCCACCGCGTCCCTAGCCCTAAC TCAACAAACCTGAAAGGACATCATGTGCGCCTCTGTAAACCATGCAAGCTGGAGCCAGAGCCTCGCCTTTGGGTGGT GCCTGGGGCACTCCCACAGGTGTGA。
4. 一種抗菌肽AP-57,其特征在于，該抗菌肽AP-57,為多肽，對(duì)應(yīng)C10orf99基因表達(dá)產(chǎn) 物去掉信號(hào)肽之后的成熟蛋白序列，含有57個(gè)氨基酸，序列為： KRRPAKAWSGRRTRLCCHRVPSPNSTNLKGHHVRLCKPCKLEPEPRLWVVPGALPQV ； 理論分子量為：6. 52D ;理論等電點(diǎn)為11. 28 ;為強(qiáng)陽(yáng)離子雙親性抗菌肽。
5. -種抗菌肽AP-57的應(yīng)用方法，其特征在于，該抗菌肽AP-57具有廣譜抗病原微生物 的功能，包括抗細(xì)菌，抗真菌，抗病毒，抗支原體；含有57個(gè)氨基酸的多肽，命名為AP-57。
【文檔編號(hào)】A61P31/10GK104387465SQ201410669781
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】仝愛(ài)平, 楊梅佳, 唐梅, 郭剛, 馬先君, 楊麗佳, 周良學(xué), 魏于全 申請(qǐng)人:四川大學(xué)