膜聯(lián)蛋白a2在制備調(diào)節(jié)pth作用的藥物上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】膜聯(lián)蛋白A2在制備調(diào)節(jié)PTH作用的藥物上的應(yīng)用。根據(jù)甲狀旁腺激素（PTH）的不同濃度，膜聯(lián)蛋白A2可以促進(jìn)或抑制PTH對(duì)ALP（堿性磷酸酶）的活性。此作用至少可實(shí)現(xiàn)以A2對(duì)PTH的成骨-破骨功能的雙向調(diào)節(jié)，發(fā)揮治療包括骨質(zhì)疏松類疾病的功效，并通過(guò)將膜聯(lián)蛋白A2與PTH的聯(lián)合應(yīng)用，使采用PTH對(duì)骨質(zhì)疏松的治療具有更精確的針對(duì)性和適應(yīng)性。
【專利說(shuō)明】膜聯(lián)蛋白A2在制備調(diào)節(jié)PTH作用的藥物上的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及膜聯(lián)蛋白A2在制備調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素（PTH)作用的藥物上的應(yīng)用，并 可進(jìn)一步通過(guò)膜聯(lián)蛋白A2雙向調(diào)節(jié)PTH對(duì)堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。該雙向調(diào)節(jié)作 用至少可被用于治療包括骨質(zhì)疏松的骨病的藥物。

【背景技術(shù)】
[0002] 以骨質(zhì)疏松類的骨病為例，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，是指隨年齡的增加(或婦女絕經(jīng) 后)，骨基質(zhì)和骨礦物質(zhì)等比例的減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，正常負(fù)荷發(fā)生變化，骨脆 性增加，導(dǎo)致易發(fā)生自發(fā)性骨折或輕微損傷時(shí)即發(fā)生骨折的情況。骨質(zhì)疏松的發(fā)生是破骨 細(xì)胞（osteoclast, 0C)的骨吸收作用與成骨細(xì)胞（osteoblast, 0B)的骨形成作用失衡的 結(jié)果，并由此引發(fā)骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加為特征的骨骼系統(tǒng)的代謝性疾病。隨著社會(huì) 的老齡化，骨質(zhì)疏松已成為影響老年人生活質(zhì)量的一種全球性的衛(wèi)生保健問(wèn)題，且發(fā)病率 在各國(guó)均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。
[0003] 對(duì)骨質(zhì)疏松治療的目的，是減少骨丟失，防止骨折的發(fā)生。目前治療骨質(zhì)疏松的藥 物主要分為兩大類，即骨吸收抑制劑和骨形成促進(jìn)劑。
[0004] 常用的骨吸收抑制劑，可包括有二磷酸鹽、雌激素、雌激素受體拮抗劑、降鈣素、活 性維生素D等。有研究表明雌激素受體拮抗劑可降低骨折發(fā)病率約50%，但其只降低了脊椎 骨骨折的發(fā)病率，并沒(méi)有減低周邊骨的骨折幾率。這些藥物都可以通過(guò)抑制骨吸收來(lái)增加 骨量，但是當(dāng)骨量增加到一定程度時(shí)，就不能再有效地維護(hù)骨骼的細(xì)微結(jié)構(gòu)，起不到降低骨 折危險(xiǎn)的作用。而且，這些藥物并不增加骨小梁的寬度，而是通過(guò)骨單位的重塑及再礦化增 加骨密度，即，其只能對(duì)骨質(zhì)疏松癥起到預(yù)防和緩解的作用，而不能從根本上治療。
[0005] 常用的骨形成促進(jìn)劑，可包括有氟化物、甲狀旁腺激素多肽片段、胰島素樣生長(zhǎng)因 子、雄性激素及蛋白同化激素等。其主要通過(guò)刺激成骨細(xì)胞的生殖和分化、提高骨小梁的密 度、抑制骨小梁的減少等來(lái)起作用。實(shí)踐顯示，其雖能顯著提高骨量，但治療效果也并不理 想，并不能有效降低骨折的發(fā)生。
[0006] 此外，已有研究表明，PTH(甲狀旁腺激素)對(duì)骨代謝可具有骨吸收和骨形成的雙重 生物學(xué)作用。這種特性使得其在用藥方式不同時(shí)可呈現(xiàn)出不同的效果。特別是其在成骨方 面的應(yīng)用被提出后，經(jīng)大量的前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，目前已被FDA批準(zhǔn)用于臨床治療 骨質(zhì)疏松。
[0007]PTH是由甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的堿性單鏈多肽類激素，由84個(gè)氨基酸組成，其主 要功能是調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物體內(nèi)鈣和磷的代謝，可促使血鈣水平升高和血磷水平下降。PTH受 體主要存在于骨細(xì)胞和腎臟。PTH在成熟骨組織中能夠促進(jìn)骨生長(zhǎng)或填充破骨細(xì)胞產(chǎn)生的 陷窩，注射入人體后可以使骨髓基質(zhì)中的骨髓成骨細(xì)胞前體成熟，并集聚在骨表面發(fā)揮成 骨作用。PTH同時(shí)還能抵御骨細(xì)胞的初始凋亡，使每一次骨重建周期的凈骨量增加，因而可 減少骨折發(fā)生率、增加骨鹽量，其這種效果是在使用上述骨吸收抑制劑時(shí)所看不到的，說(shuō)明 它在提高骨代謝周期的同時(shí)，起到了促進(jìn)骨形成、增加骨量、提高骨強(qiáng)度的作用。小劑量間 歇性方式用藥，PTH可刺激骨細(xì)胞分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-likegrowthfactor,IGF),促進(jìn)膠原和肌質(zhì)生成，有助于成骨。大量體內(nèi)研究已證實(shí)，PTH能影響成骨細(xì)胞表達(dá)細(xì) 胞因子，刺激分泌的如白介素-1 (IL-1)和白介素-6 (IL-6)等多種細(xì)胞因子，能夠通過(guò) 成骨-破骨細(xì)胞之間的聯(lián)系，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞（0B)和破骨細(xì)胞（0C)在骨組織中既互相對(duì)抗 又互相聯(lián)系的作用，協(xié)調(diào)完成成骨與破骨的動(dòng)態(tài)平衡。PTH對(duì)鈣磷代謝調(diào)節(jié)，也主要通過(guò)鈣 磷代謝的反饋機(jī)制調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞分泌PTH。為防止持續(xù)的骨丟失，PTH可通過(guò)改變和調(diào)節(jié) 鈣吸收的閾值，以促進(jìn)腎小管對(duì)鈣的重吸收；增強(qiáng)維生素D的功能，增加小腸對(duì)鈣的吸收， 或增加鈣外源性供給，為PTH提供所需的細(xì)胞外基質(zhì)中的鈣，則可減少骨吸收。因此，PTH是 一種治療骨質(zhì)疏松癥的有效藥物，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用PTH已是提高骨量、改善骨質(zhì)量、治療骨 質(zhì)疏松的一種新途徑。并且，包括PTH融合蛋白、PTH重組體和PTH突變體等其類似物，也 已經(jīng)逐步發(fā)展成為一系列治療骨質(zhì)疏松癥的有效藥物。特別是對(duì)該P(yáng)TH重組體，第一種可 用于臨床治療骨質(zhì)疏松癥的PTH的類似物rPTH(l-34)已獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，由美國(guó)禮來(lái)公 司生產(chǎn)的注射劑(商品名特立帕肽）也已于2003年初上市。該藥物具有與天然PTH氨基末 端34個(gè)氨基酸序列完全相同的結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)作用亦是通過(guò)與特異性、高親和性PTH-1受 體結(jié)合介導(dǎo)的，對(duì)骨和腎具有與天然的PTH相同的生理作用，同時(shí)可克服了羧基末端對(duì)骨 代謝的不利影響。同年，Unigene公司和葛蘭素史克公司開(kāi)發(fā)一種用于治療骨質(zhì)疏松可口 服劑型的PTH制劑。
[0008] 可調(diào)節(jié)PTH分泌的因素較多。由于甲狀旁腺細(xì)胞對(duì)胞外鈣濃度變化敏感，例如，給 予了 1，25 (0H)2D3可增加鈣離子的吸收而下調(diào)PTH的分泌，而使用降鈣素后則可以增加PTH 的分泌。因此目前研究已表明，影響和調(diào)節(jié)PTH分泌的主要是鈣離子的負(fù)向調(diào)節(jié)：胞外鈣例 子濃度增加的即刻效應(yīng)是PTH的分泌減低，而胞外鈣離子濃度減低會(huì)導(dǎo)致PTH的分泌增加。
[0009]另一方面，膜聯(lián)蛋白A2 (又稱膜聯(lián)蛋白AnnexinA2、P36、ANX2、LIP2、LPC2、CAL1H、 LPC2D、ANX2L4、PAP-IV等)，是膜聯(lián)蛋白超家族中的一員。膜聯(lián)蛋白A2是一類受鈣離子 活化和調(diào)節(jié)的、能結(jié)合到膜磷脂上的蛋白，在人體內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和 某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)豐富，并可游離存在于胞漿中，或在胞內(nèi)連接于細(xì)胞膜上（GerkeV， CreutzCE,MossSE.Annexins:linkingCa2+signallingtomembranedynamics[J]. TfetoreTfeKiers 2005;6(6):449_461)。研究表明，膜聯(lián)蛋白A2 具有Ca2+依賴性結(jié)合磷脂、細(xì)胞骨架蛋白的重要特性，因而與骨骼系統(tǒng)也有密切的關(guān)系。
[0010] 在骨的礦化過(guò)程中，包括I型膠原蛋白和堿性磷酸酶（ALP)等許多蛋白都有著 重要的作用。I型膠原蛋白可為骨的形成和礦物質(zhì)沉積提供骨架，并增強(qiáng)骨的拉伸強(qiáng)度； 而ALP在堿性條件下催化磷酸單酯酶的水解，降解焦磷酸鹽，促進(jìn)細(xì)胞外磷酸鈣的沉積。 JenniferM等發(fā)現(xiàn)，在Sa0SLM2 (人骨肉瘤細(xì)胞系)類成骨樣細(xì)胞膜上兩倍高表達(dá)的膜聯(lián)蛋 白A2,導(dǎo)致了堿性磷酸酶活性增加，同時(shí)使礦化作用增強(qiáng)。但這并不是因?yàn)锳LP的轉(zhuǎn)錄和蛋 白水平增加，而是因?yàn)榧?xì)胞膜上包含的完整膜聯(lián)蛋白A2脂閥對(duì)于ALP的活性具有非常重要 作用，從而促進(jìn)成骨樣的礦化過(guò)程。
[0011] 本申請(qǐng)的發(fā)明人在對(duì)PTH的深入研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)PTH功能的影響和調(diào)節(jié)，除目前研 究提出主要為鈣離子外，膜聯(lián)蛋白A2對(duì)PTH功能，具有重要的雙向調(diào)節(jié)作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 鑒于此，本發(fā)明提供了一種膜聯(lián)蛋白A2在制備調(diào)節(jié)PTH作用的藥物上的應(yīng)用，并 可進(jìn)一步通過(guò)膜聯(lián)蛋白A2雙向調(diào)節(jié)PTH對(duì)ALP活性的影響。該雙向調(diào)節(jié)作用至少可被用 于治療包括骨質(zhì)疏松的骨病的藥物。
[0013] 本申請(qǐng)所述的應(yīng)用，膜聯(lián)蛋白A2在制備調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素作用的藥物上的應(yīng)用。 所述的應(yīng)用中的調(diào)節(jié)，特別包括可促進(jìn)PTH對(duì)ALP的活性，或抑制PTH對(duì)ALP的活性的雙向 調(diào)節(jié)。
[0014] 上述的雙向調(diào)節(jié)包括，至少在A2的濃度為0?Of10000ng/ml的范圍內(nèi)： 一在0? 01ng/ml<PTH濃度彡10ng/ml范圍內(nèi)，A2可促進(jìn)PTH對(duì)ALP的活性； 一在10ng/ml<PTH濃度彡100ng/ml范圍內(nèi)，A2可抑制PTH對(duì)ALP的活性； 一在100ng/ml<PTH濃度彡10000ng/ml范圍內(nèi)，A2可促進(jìn)PTH對(duì)ALP的活性。
[0015] 在上述應(yīng)用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的具體應(yīng)用是至少可以用于制備治療骨質(zhì)疏松的藥 物。
[0016] 上述應(yīng)用的具體形式，可以采用將所述的藥物制備成注射制劑使用。
[0017] 本申請(qǐng)的發(fā)明人在就PTH對(duì)成骨活動(dòng)影響的深入研究中發(fā)現(xiàn)，ALP生物學(xué)活性與 成骨能力呈正相關(guān)。其中，在濃度為l〇〇〈PTH彡10000ng/ml范圍內(nèi)，UMR-106細(xì)胞的ALP生 物學(xué)活性與空白對(duì)照組比無(wú)明顯差異；而在濃度為0. 〇l〈PTH彡100ng/ml時(shí)則顯示，與空白 對(duì)照組相比PTH可增加UMR-106細(xì)胞ALP生物學(xué)活性，且與劑量成正比。
[0018] 深入的研究和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在PTH濃度為0? 01〈PTH〈10000ng/ml的范圍內(nèi)，其對(duì)ALP 生物學(xué)活性的作用和影響，可以進(jìn)一步通過(guò)膜聯(lián)蛋白A2來(lái)進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)。其中： 在0? 01ng/ml〈PTH濃度彡10ng/ml范圍內(nèi)時(shí)，分別將濃度為0?Of10000ng/ml的膜聯(lián) 蛋白A2加入U(xiǎn)MR-106細(xì)胞后，與單一加入PTH組相比，ALP的活性有所增高，并且高于空白 對(duì)照組的ALP活性； 在10ng/ml〈PTH濃度彡100ng/ml范圍內(nèi)時(shí)，分別將濃度同樣為0. 01~10000ng/ml的膜 聯(lián)蛋白A2加入U(xiǎn)MR-106細(xì)胞后，與單一加入PTH組相比，ALP的活性則有所降低，但仍高于 空白對(duì)照組的ALP活性； 在100ng/ml〈PTH濃度彡10000ng/ml范圍內(nèi)時(shí)，同樣濃度的膜聯(lián)蛋白A2加入U(xiǎn)MR-106 細(xì)胞后，與單一加入PTH組相比，ALP的活性有所增高。
[0019] 上述結(jié)果清楚表明，在PTH具有不同濃度的情況下，膜聯(lián)蛋白A2可以分別對(duì)PTH 的功能，特別是對(duì)ALP活性所產(chǎn)生影響的幅度，具有雙向調(diào)控作用，即可促進(jìn)PTH對(duì)ALP活 性，或減小PTH對(duì)ALP活性的影響。
[0020] 由于PTH具有調(diào)節(jié)骨代謝的雙重作用，可協(xié)調(diào)完成成骨與破骨的動(dòng)態(tài)平衡，并參 與對(duì)鈣磷代謝的調(diào)節(jié)，而PTH對(duì)ALP的生物學(xué)活性也有重要的影響，特別是在對(duì)骨的礦化過(guò) 程中，也離不開(kāi)ALP生物活性的重要作用。因此，本發(fā)明上述的應(yīng)用對(duì)于包括骨質(zhì)疏松在內(nèi) 的骨病的治療而言，就可以根據(jù)患者體內(nèi)實(shí)際的PTH不同濃度水平，采用PTH與膜聯(lián)蛋白A2 聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)膜聯(lián)蛋白A2對(duì)PTH的雙向調(diào)控作用，有助于提高PTH治療效果，特別是對(duì)目 前使用PTH治療骨質(zhì)疏松等疾病時(shí)，使用藥和治療能具有更精確的針對(duì)性和適應(yīng)性。
[0021] 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的 詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明 上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng) 包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1是不同濃度PTH與膜聯(lián)蛋白A2聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠成骨細(xì)胞UMR106的ALP活性 的影響。圖中橫坐標(biāo)是蛋白濃度，是PTH濃度一定時(shí)，A2的濃度從0. 01~10000ng/ml變化 時(shí)，ALP的0D值改變)。圖中的橫坐標(biāo)除單一PTH組曲線表示為PTH的濃度外，對(duì)其余曲線 均表示為A2的濃度，對(duì)應(yīng)曲線的PTH濃度分別如圖中所示。
[0023] 圖2是不同濃度的PTH、膜聯(lián)蛋白A2及二者聯(lián)合使用對(duì)大鼠成骨細(xì)胞UMR106增 殖活性的影響（MTT法)。圖中的橫坐標(biāo)除單一PTH組曲線表示為PTH的濃度外，對(duì)其余 曲線均表示為A2的濃度，其對(duì)應(yīng)曲線的PTH濃度分別如圖例中所注明，顯示A2濃度從 0.0ri0000ng/ml變化時(shí)，大鼠成骨細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
[0024] 圖3是不同濃度PTH與膜聯(lián)蛋白A2聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠成骨細(xì)胞UMR106礦化結(jié)節(jié)灰 度值的影響。圖中的橫坐標(biāo)除單一PTH的濃度外，其余均表示為A2濃度從0.OflOOOOng/ ml變化時(shí)，礦化結(jié)節(jié)灰度值的改變，各對(duì)應(yīng)組的PTH濃度分別如圖例中所注明。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1 對(duì)大鼠成骨細(xì)胞UMR106堿性磷酸酶活性的影響 1.大鼠成骨樣肉瘤UMR106細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代 從液氮中取出凍存的大鼠成骨樣肉瘤UMR106細(xì)胞，投入約38°C的水浴中解凍，期間 不斷振蕩，直至剛好完全解凍后，轉(zhuǎn)移至已加入預(yù)熱至37°C的8ml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中， 混勻，lOOOrpm離心沉淀5min，棄上清，沉淀物中加入約5ml的含10%新生小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中懸浮，轉(zhuǎn)移至l〇〇ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C、5%C02的飽和濕度二氧化碳孵箱中培 養(yǎng)。次日倒置生物顯微鏡下觀察并換液，適時(shí)用0. 25%的胰蛋白酶消化傳代，直至細(xì)胞數(shù)達(dá) 實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0026] 按表1設(shè)計(jì)方式分別加入不同梯度的PTH和膜聯(lián)蛋白A2組合蛋白樣品，誘導(dǎo) UMR106細(xì)胞(每一濃度均作4復(fù)孔）至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100yl，刺激24小時(shí)后檢 測(cè)相應(yīng)的ALP值。

【權(quán)利要求】
1. 膜聯(lián)蛋白A2在制備調(diào)節(jié)PTH作用的藥物上的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的調(diào)節(jié)為促進(jìn)或抑制PTH對(duì)ALP的活性的 雙向調(diào)節(jié)。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所述的雙向調(diào)節(jié)包括： 一在0? 01 ng/ml < PTH濃度彡10ng/ml范圍內(nèi)，A2可促進(jìn)PTH對(duì)ALP的活性； 一在10 ng/ml < PTH濃度彡100ng/ml范圍內(nèi)，A2可抑制PTH對(duì)ALP的活性； 一在100 ng/ml < PTH濃度彡10000ng/ml范圍內(nèi)，A2可促進(jìn)PTH對(duì)ALP的活性。
4. 如權(quán)利要求1至3之一所述的應(yīng)用，其特征是作為制備治療骨質(zhì)疏松藥物的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求1至3之一所述的應(yīng)用，其特征是所說(shuō)的藥物為注射制劑。
6. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征是所說(shuō)的藥物為注射制劑。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104383522SQ201410703246
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月29日
【發(fā)明者】陳雨雪, 白丁, 孟玉坤, 彭曉東, 魏大鵬 申請(qǐng)人:四川大學(xué)