具有超聲造影功能的空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有超聲造影功能的空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑及其制備方法，所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑包括表面具有介孔、內(nèi)部空心的普魯士藍(lán)納米顆粒，以及裝載于所述普魯士藍(lán)納米顆粒中的溫敏型相變材料，其中，所述溫敏型相變材料包括氟碳化合物和/或薄荷醇。
【專利說明】具有超聲造影功能的空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料【技術(shù)領(lǐng)域】和生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及一種具有超聲造影功能和腫瘤光熱治療的空心介孔普魯士藍(lán)納米診療劑及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤的早期診斷與治療一直是醫(yī)學(xué)界的難題和研宄熱點(diǎn)，特別是兼診斷和監(jiān)控、治療等功能為一體的關(guān)鍵科學(xué)技術(shù)研宄更是科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。超聲成像(US)具有通透性強(qiáng)，非侵入性，易于操作和實(shí)時(shí)成像等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)影像上具有廣泛應(yīng)用。臨床上使用的第三代超聲造影劑是以含氟氣體為內(nèi)核的微泡造影劑，提高了微泡造影劑對(duì)超聲信號(hào)的敏感性，增強(qiáng)了超聲造影效果。但由于微泡較大的尺寸以及在血液循環(huán)中較差的穩(wěn)定性，因此臨床上急需尋找性能優(yōu)異并且更穩(wěn)定的超聲造影劑。目前一類液態(tài)氟烷納米粒/乳劑納米造影劑以其分子小、穿透力強(qiáng)的突出特性，引起了極大關(guān)注。
[0003]長(zhǎng)期以來，醫(yī)學(xué)界一直沒有停止過嘗試使用熱能來治療癌癥的研宄。熱療是一種借助儀器(例超聲、微波、射頻等)，將人體某個(gè)部位或器官的溫度升高而局部殺死腫瘤的治療方法。但這種方式存在的“熱傳遞的非專屬性”容易造成腫瘤周圍正常的組織器官損傷。因此，目前癌癥臨床治療中，熱療更多的是作為一種輔助治療手段，與化放療聯(lián)合使用，以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，提升癌癥治療效果。
[0004]納米技術(shù)的快速發(fā)展為“專屬性的熱傳遞”提供了可能。例如，近年來一種基于納米載體的新穎的光熱治療技術(shù)引起了廣泛的關(guān)注。在光熱治療中，將具有近紅外光熱轉(zhuǎn)換功能的納米材料運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位，然后僅對(duì)腫瘤區(qū)域局部實(shí)施近紅外光照，使腫瘤處產(chǎn)生局部超高溫度，從而輕易地將腫瘤細(xì)胞殺死。這種近紅外光介導(dǎo)的熱量腫瘤靶向傳遞，保證了治療中不會(huì)對(duì)正常組織造成損傷，顯著提高了熱療的安全性與有效性。光熱治療最大特點(diǎn)是從理論上實(shí)現(xiàn)了對(duì)幾乎所有實(shí)體腫瘤的有效治療，包括對(duì)放化療失敗和產(chǎn)生耐藥性腫瘤的高效治療。同時(shí)，光熱治療不會(huì)產(chǎn)生放化療伴隨的毒副作用而導(dǎo)致患者生存質(zhì)量的下降。這種治療技術(shù)的一個(gè)重要前提就是研發(fā)一種在近紅外區(qū)域具有超強(qiáng)吸收以及高的光熱轉(zhuǎn)化效率、良好生物相容性和安全性的光熱轉(zhuǎn)換材料。
[0005]目前所研宄的光熱轉(zhuǎn)換材料主要有金納米棒、碳基材料(碳納米管和石墨烯)、銅的氧族化物、過渡金屬氧族化合物以及一些有機(jī)化合物。這些光熱材料在體外及動(dòng)物體內(nèi)光熱治療中都具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，人們也做了大量工作評(píng)價(jià)其生物安全性。但由于缺少人體臨床試驗(yàn)，這些材料在復(fù)雜的人體環(huán)境中的安全性仍待考宄。因此在臨床上，它們的生物安全性依然是難以逾越的瓶頸。普魯士藍(lán)(PB)是一種古老的的藍(lán)色染料，并且是臨床上的解毒劑。PB在近紅外區(qū)具有較強(qiáng)的吸收，其摩爾消光系數(shù)與納米金處于同一個(gè)數(shù)量級(jí)，比碳納米管、硫化銅等光熱轉(zhuǎn)換劑要高2?3個(gè)數(shù)量級(jí)。但納米金棒在近紅外光循環(huán)照射下，容易發(fā)生聚集等，使其吸收峰發(fā)生變化，光熱穩(wěn)定性差，而PB具有良好的光熱轉(zhuǎn)換穩(wěn)定性。因此，基于普魯士藍(lán)納米材料的光熱轉(zhuǎn)換劑具有巨大的應(yīng)用前景。目前基于普魯士藍(lán)納米材料同時(shí)實(shí)現(xiàn)超聲造影和光熱治療的納米診療劑的研宄還未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研宄。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在進(jìn)一步拓展現(xiàn)有光熱診療劑的功能，本發(fā)明提供了一種具有超聲造影功能和腫瘤光熱治療的空心介孔普魯士藍(lán)納米診療劑(HMPB)及其制備方法。
[0007]本發(fā)明提供了一種空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑，所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑包括表面具有介孔、內(nèi)部空心的普魯士藍(lán)納米顆粒，以及裝載于所述普魯士藍(lán)納米顆粒中的溫敏型相變材料，其中，所述溫敏型相變材料包括氟碳化合物(全氟戊烷和/或全氟己烷)和/或薄荷醇等。
[0008]較佳地，所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑的表面帶負(fù)電荷，普魯士藍(lán)納米顆粒粒徑范圍為100?lOOOnm，普魯士藍(lán)納米顆粒外殼的厚度范圍為10?lOOnm，普魯士藍(lán)納米顆粒表面具有微孔和介孔，其中微孔的大小為0.5?2nm，介孔的大小為3.2?30nmo
[0009]較佳地，在所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑中，空心普魯士藍(lán)納米顆粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97% -99.0%，氟碳化合物溫敏型相變材料和/或薄荷醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0% -3%。
[0010]較佳地，所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑在近紅外光區(qū)域λ =650-970nm,實(shí)現(xiàn)光熱轉(zhuǎn)換。
[0011]又，本發(fā)明還提供了一種上述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑的制備方法，所述制備方法包括:
1)將0.132?0.396份鐵氰化鉀和2?10份聚乙烯吡咯烷酮加入到酸中，磁攪拌至得到澄清混合液，然后將澄清混合液轉(zhuǎn)至烘箱中，在60-100°C陳化，冷卻后分離、洗滌，得到所述具有介孔的普魯士藍(lán)納米顆粒；
2)將表面具有介孔的普魯士藍(lán)納米顆粒分散于酸中，在120?140°C陳化后，分離得到表面具有介孔、內(nèi)部空心的普魯士藍(lán)納米顆粒；
3)采用真空灌注法將氟碳化合物溫敏型相變材料和/或薄荷醇注入步驟2)制備的表面具有介孔、內(nèi)部空心的普魯士藍(lán)納米顆粒中，制備得到所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑。
[0012]較佳地，步驟I)中，酸的量為30-100份，酸為0.01-2M的鹽酸，陳化時(shí)間為12-20小時(shí)。
[0013]較佳地，步驟2)中，使用的酸為濃度1-2M的鹽酸，陳化時(shí)間為2-4小時(shí)。
[0014]較佳地，步驟3)中，真空灌注法為在真空度為500— 5000Pa下進(jìn)行冰水浴、超聲。
[0015]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明的基于HMPB的納米診療劑具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能，產(chǎn)生顯著的超聲成像信號(hào)以實(shí)時(shí)監(jiān)控腫瘤狀態(tài)。因此，它解決了傳統(tǒng)腫瘤光熱治療中熱量在腫瘤內(nèi)部分布不均對(duì)腫瘤消融不完全，導(dǎo)致腫瘤易于復(fù)發(fā)、化療毒副作用大等臨床應(yīng)用難題，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了腫瘤治療的實(shí)時(shí)監(jiān)控，為腫瘤的安全與高效治療提供了新技術(shù)和新的理論基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1示出了本發(fā)明中HMPB-PCM納米診療劑的一個(gè)制備流程圖；
圖2分別示出了本發(fā)明的實(shí)施例一中制備的MPB的透射電鏡圖(a)、HMPB的透射電鏡圖(b)、HMPB的電子衍射圖(c)以及HMPB的掃描電鏡圖⑷；
圖3a示出了實(shí)施例五中不同濃度的HMPB在近紅外光區(qū)域附近的紫外?可見吸收曲線；
圖3b示出了實(shí)施例6中在波長(zhǎng)808nm、功率密度為5W/cm2的激光照射下，不同濃度的HMPB的PBS溶液時(shí)間與溫度關(guān)系曲線；
圖3c示出了實(shí)施例七中Hela細(xì)胞在不同濃度的HMPB的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，經(jīng)過波長(zhǎng)808nm、功率密度為5W/cm2的激光照射5min后的熱療效果；
圖3d分別示出了實(shí)施例八中激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察到的細(xì)胞狀態(tài)(dl鈣黃綠素染色的熒光成像結(jié)果，d2是碘化吡啶染色的熒光成像結(jié)果)、實(shí)施例九中CLSM結(jié)果(d3顯示媽黃綠素染色后的細(xì)胞的熒光，d4為碘化吡啶染色后的細(xì)胞的熒光)、實(shí)施例十中CLSM結(jié)果(d5顯示鈣黃綠素染色后的細(xì)胞的熒光，d6為碘化吡啶染色后的細(xì)胞的熒光)；圖4示出了實(shí)施例^^一中ΗΜΡΒ-ΡΠ1在20°C體外超聲成像實(shí)驗(yàn)效果(a)和在42.5°C體外超聲成像實(shí)驗(yàn)效果(b);
圖5分別示出了實(shí)施例十三中體外超聲成像實(shí)驗(yàn)，單純PBS溶液在塑料滴管中的超聲成像效果(a)、實(shí)施例十四中HMPB-PFP在20°C體外超聲成像實(shí)驗(yàn)效果圖(b)、實(shí)施例十五中HMPB-PFP在42.5°C體外超聲成像實(shí)驗(yàn)效果圖(c)、實(shí)施例十六中HMPB-PFP體內(nèi)超聲成像實(shí)驗(yàn)，未做任何處理的腫瘤處超聲成像結(jié)果(d)、實(shí)施例十六中HMPB-PFP體內(nèi)超聲成像實(shí)驗(yàn)，注射實(shí)施例三中制備的HMPB納米診療劑之后的腫瘤處超聲成像結(jié)果(e)、以及實(shí)施例十六中HMPB-PFP體內(nèi)超聲成像實(shí)驗(yàn)，注射實(shí)施例三中制備的HMPB-PFP納米診療劑之后，用波長(zhǎng)808nm，功率密度為2W/cm2的激光照射后的腫瘤處超聲成像結(jié)果；
圖6示出了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中制備的MPB的HMPB的透射電鏡圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017]以下結(jié)合附圖和下述實(shí)施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，附圖及下述實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0018]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有光熱轉(zhuǎn)換材料及超聲造影劑在臨床應(yīng)用上的瓶頸，利用具有良好生物相容性和生物安全性的HMPB裝載溫敏型PCM，形成一種具有超聲造影功能和光熱治療腫瘤的新型診療系統(tǒng)。
[0019]本發(fā)明涉及一種基于空心介孔納米顆粒在超聲成像及光熱治療腫瘤方面應(yīng)用的超聲納米診療劑及其制備方法。所述的納米診療劑由具有優(yōu)異光熱轉(zhuǎn)換性能的單一組分形成的空心介孔納米粒子作為載體，裝載溫敏型PCM。本發(fā)明的納米診療劑基于HMPB，通過真空灌注方法裝入疏水性氟碳化合物等溫敏型PCM。
[0020]本發(fā)明的HMPB是由單一組分的普魯士藍(lán)組成，具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能(近紅外區(qū)域具有強(qiáng)的吸收，高的光熱轉(zhuǎn)換效率以及光熱穩(wěn)定性)。高分散，尺寸均一可控的HMPB納米粒子制備方法簡(jiǎn)便，原料價(jià)格低廉，具有良好的光熱轉(zhuǎn)換性能以及良好的生物相容性以及生物安全性。HMPB外殼在近紅外光區(qū)域具有強(qiáng)的吸收，高的光熱轉(zhuǎn)換效率。在近紅外光的照射下，使病變組織處溫度達(dá)到42.5°C以上，從而殺死腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，PCM在該溫度下發(fā)生液-氣相變產(chǎn)生大量氣泡，并從HMPB外殼層的介孔孔道中持續(xù)釋放，穩(wěn)定有效地增強(qiáng)超聲成像造影，可用于腫瘤的治療以及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
[0021]所述的納米診療劑其表面帶有負(fù)電荷，HMPB (外殼)粒徑范圍為100?100nm可控，外殼殼層的厚度范圍為10?10nm可控，孔徑大小范圍為微孔:0.5?2nm可控；介孔大小為3.2?30nm可控。本發(fā)明的空心介孔納米材料由于具有大的空腔結(jié)構(gòu)(空心立方體)，可以裝載大量的客體分子有望用于超聲造影。其空心介孔結(jié)構(gòu)可以作為藥物載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤化療和熱療協(xié)同治療，最終形成超聲造影和治療的診療系統(tǒng)。
[0022]氟碳化合物包括疏水性的全氟戊烷(PFP)、全氟己烷(PFH)等。本發(fā)明的超聲造影的客體分子為溫敏型PCM，包括全氟己烷(PFH)和全氟戊烷(PFP)。采用真空灌注法將客體分子裝載進(jìn)入HMPB的空腔，該方法簡(jiǎn)便、易行。
[0023]所述的納米診療劑在近紅外光區(qū)域(λ = 650-970nm)具有強(qiáng)的吸收，高的光熱轉(zhuǎn)換效率。
[0024]本發(fā)明的納米診療劑基于HMPB，內(nèi)裝有疏水性的PFP、PFH等溫敏型PCM。本發(fā)明的納米診療劑在近紅外區(qū)域具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)化性能，通過吸收近紅外光，并高效地轉(zhuǎn)換成熱能，使腫瘤部位溫度升高，足夠有效殺死腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，內(nèi)部氟碳化合物等溫敏型PCM吸熱發(fā)生液-氣相變，產(chǎn)生的氣泡具有良好的超聲造影診斷功能以及空化效應(yīng)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了腫瘤的診療一體化，大大提高了腫瘤的治療效果，為臨床化應(yīng)用建立了基礎(chǔ)，得到一種集超聲成像診斷和光熱治療為一體的納米診療劑。解決了傳統(tǒng)腫瘤光熱治療中熱量在腫瘤內(nèi)部分布不均導(dǎo)致的腫瘤易于復(fù)發(fā)、化療毒副作用大等臨床應(yīng)用難題，為腫瘤的安全與高效治療提供了新技術(shù)和新的理論基礎(chǔ)。
[0025]本發(fā)明的基于HMPB的納米診療劑還包括裝載抗腫瘤藥物和基因等。空心介孔結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)抗腫瘤藥物和基因的包覆和傳輸，達(dá)到化療和熱療協(xié)同作用效果，同時(shí)具有超聲造影功能。所述抗腫瘤藥物和基因包括但不限于鹽酸阿霉素、紫杉醇、伊立替康、阿柔比星、奧沙利鉑、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿等納米藥物中的一種或者兩種及兩種以上的混合物。
[0026]本發(fā)明提供了一種原料價(jià)格低廉易得、制備方法簡(jiǎn)單、易于批量生產(chǎn)的方法制備出具有良好分散性和穩(wěn)定性、良好生物相容性、粒徑和孔徑可控、優(yōu)異光熱轉(zhuǎn)換性能、明顯的超聲造影性能以及對(duì)腫瘤進(jìn)行光熱治療的多功能納米診療劑。
[0027]本發(fā)明的基于HMPB的納米診療劑具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能，產(chǎn)生顯著的超聲成像信號(hào)以實(shí)時(shí)監(jiān)控腫瘤狀態(tài)。因此，它解決了傳統(tǒng)腫瘤光熱治療中熱量在腫瘤內(nèi)部分布不均導(dǎo)致的腫瘤易于復(fù)發(fā)、化療毒副作用大等臨床應(yīng)用難題，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了腫瘤治療的實(shí)時(shí)監(jiān)控，為腫瘤的安全與高效治療提供了新技術(shù)和新的理論基礎(chǔ)；
本發(fā)明的基于HMPB的納米診療劑的制備原料價(jià)格低廉易得，制備方法簡(jiǎn)單，易于批量生產(chǎn)。
[0028]本發(fā)明還提供了一種制備所述診療劑的方法，包括:以鐵氰化鉀為原料制備空心介孔普魯士藍(lán)納米立方體(HMPB)殼層，用真空灌注法裝載氟碳化合物液滴等溫敏型相變材料(PCM)。
[0029]具體為:
步驟A)將132?396mg的鐵氰化鉀和2?1g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到30?10mL濃度為的0.01?2M鹽酸中，磁攪拌至得到澄清混合溶液； 步驟B)將混合液轉(zhuǎn)至80°C的烘箱中，陳化12?20h取出，冷卻至室溫，離心分離，去離子水洗數(shù)次，溶于20?50mL濃度為I?2M的鹽酸中待用；
步驟C)將20mL上述溶液轉(zhuǎn)移至水熱釜，置于電爐中，120?140°C陳化2?4h，取出冷卻至室溫，離心分離，去離子水洗數(shù)次，冷凍干燥；
步驟D)將制備的20?50mg HMPB于5mL膠塞小瓶中，密封抽真空并保持一定真空度。用注射器注入100?150 μ L溫敏型PCM，冰水浴中超聲2min使PCM充分裝入HMPB立方體的空腔中，得到納米診療劑HMPB-PCM。
[0030]參見圖1，其示出本發(fā)明的具有超聲造影功能的空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑的制備流程。
[0031]首先，采用水熱法一步合成介孔普魯士藍(lán)納米粒子，可通過調(diào)節(jié)其pH以及原料的量對(duì)其尺寸，孔道結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整。
[0032]運(yùn)用表面保護(hù)，內(nèi)部刻蝕的方法，制備空心介孔普魯士藍(lán)納米載體:以具有良好生物相容性的PVP作為保護(hù)劑，通過與介孔普魯士藍(lán)納米粒子混合攪拌，在其表面形成一層保護(hù)層。在水熱的條件下，H+可以通過保護(hù)層進(jìn)入介孔普魯士藍(lán)納米粒子內(nèi)部，對(duì)其進(jìn)行刻蝕。將產(chǎn)物收集后充分洗滌，真空干燥，最終得到空心介孔普魯士藍(lán)納米載體。
[0033]然后在步驟D，采用真空灌注法裝載溫敏型PCM，得到具有超聲造影功能的空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑HMPB-PCM。大致過程可如下所示:將制備的HMPB經(jīng)過一定的預(yù)處理(例如溶解，脫氣)，于5mL膠塞小瓶中，密封抽真空并保持一定真空度。用注射器注入一定量(例如100?150 μ L)的溫敏型PCM，冰水浴中超聲分散一定時(shí)間(例如2min)，使PCM充分裝入HMPB立方體的空腔中，得到納米診療劑HMPB-PCM。選擇生物相容性良好的溫敏型PCM(PFP，PFH)作為客體分子。在近紅外光的照射下，HMPB吸收近紅外光，將其高效地轉(zhuǎn)換為熱量，使溫度達(dá)到一定溫度(> 42.50C )，對(duì)腫瘤進(jìn)行光熱治療。同時(shí)，溫敏型PCM發(fā)生相變，由超疏水性的液相轉(zhuǎn)變?yōu)楦邚椥缘姆細(xì)馀?，并從載體的介孔孔道中緩慢、持續(xù)地釋放，穩(wěn)定有效地增強(qiáng)超聲成像。應(yīng)理解，示出的溫敏型PCM不僅僅局限于PFP，PHL
[0034]此外還可以對(duì)納米診療劑進(jìn)行PBS溶液的封裝，可以配制成不同濃度的溶液。制備HMPB后，裝載不同相變溫度、超聲敏感特性的良好生物相容性的溫敏型PCM(PFP，PFH)，優(yōu)賦予具優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能以及熱穩(wěn)定性的空心介孔普魯士藍(lán)納米載體材料優(yōu)良的超聲敏感特性。
[0035]本發(fā)明中，普魯士藍(lán)外殼能有效吸收近紅外光，具有較高的光熱轉(zhuǎn)化效率。HMPB外殼產(chǎn)生的熱能有效殺死腫瘤細(xì)胞并使殼層內(nèi)部溫敏型PCM發(fā)生液-氣相變。PCM產(chǎn)生的氣泡具有良好的超聲造影效果以及空化效應(yīng)。本發(fā)明制備過程簡(jiǎn)單，原料成本低廉，診療劑具有良好的生物相容性和生物安全性，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的臨床應(yīng)用前景。
[0036]下面進(jìn)一步例舉實(shí)施例以詳細(xì)說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個(gè)示例，即本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。
[0037]實(shí)施例一
稱量132mg鐵(III)氰化鉀和3g聚乙烯基吡咯烷酮K?30 (PVP)于40mL0.0lM的鹽酸中，攪拌30min使充分溶解形成黃色透明溶液，置于80°C烘箱中反應(yīng)20h。11000r/min離心lOmin，水洗一次，得到介孔普魯士藍(lán)納米粒子(MPB)。MPB溶于20mLlM的鹽酸中分散均勻，140°C水熱刻蝕4h，11000r/min離心lOmin，水洗一次，得到空心介孔普魯士藍(lán)(HMPB)干燥備用。制備的HMPB刻蝕前后透射電鏡圖及HMPB掃描電鏡圖如圖2所示；
由圖2中(a)可見，制備的介孔普魯士藍(lán)納米立方體具有良好的分散性，粒徑較均勻，在100?500nm。用IM的鹽酸刻蝕后，形成空心結(jié)構(gòu)，其粒徑基本保持不變，分散性良好，空心結(jié)構(gòu)的殼層壁厚為10?lOOnm。圖2中(c)顯示空心介孔普魯士藍(lán)納米立方體為單晶結(jié)構(gòu)。由掃描電鏡圖可看出，HMPB表面有一些大小不等的介孔。
[0038]實(shí)施例二
稱量132mg鐵(III)氰化鉀和3g PVP于40mL0.1M的鹽酸中，攪拌30min使充分溶解形成黃色透明溶液，置于80°C烘箱中反應(yīng)20h。11000r/min離心lOmin，水洗一次，得到介孔普魯士藍(lán)納米粒子，溶于20mLlM的鹽酸中分散均勻，140°C水熱刻蝕4h，11000r/min離心lOmin，水洗一次，得到空心介孔普魯士藍(lán)。
[0039]實(shí)施例三
稱取實(shí)施例一中制備的HMPB50mg于5mL膠塞小瓶中，密封抽真空并保持一定真空度。用注射器注入150 μ L PFP，冰水浴中超聲2min使PFP充分裝入HMPB的空腔中，得到納米診療劑HMPB-PFP。將HMPB-PFP分散于1mL PBS中，冰水浴中保存?zhèn)溆谩?br> [0040]實(shí)施例四
稱取實(shí)施例一中制備的HMPB50mg于5mL膠塞小瓶中，密封抽真空并保持一定真空度。用注射器注入150 μ L PFH,冰水浴中超聲2min使Ρ--充分裝入HMPB的空腔中，得到納米診療劑HMPB-PHL將HMPB-Pi7H分散于1mL PBS中，冰水浴中保存?zhèn)溆谩?br> [0041]實(shí)施例五
把實(shí)施例一中得到的HMPB分散于PBS中，濃度分別為，12.5ppm、25ppm、50ppm、lOOpprn、200ppm，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其在近紅外光處的吸收峰，如圖3 (a)所示。可以看出，所制備的材料在近紅外光區(qū)域有較強(qiáng)較寬的吸收峰，在710nm左右最強(qiáng)，并且隨濃度增加吸收越來越強(qiáng)。
[0042]實(shí)施例六
取實(shí)施例三中得到的多份HMPB-PFP分別散于PBS中，25ppm、50ppm、100ppm、200ppm的溶液各ImL于石英比色皿中，功率密度為5W/cm2，波長(zhǎng)為808nm激光輻照l(shuí)Omin，記錄溶液在不同時(shí)間點(diǎn)的溫度如圖3(b)所示，隨輻照時(shí)間的增加，溶液溫度逐漸升高，而且濃度越高，升溫速率越快，200ppm時(shí)，輻照十分鐘可以升到35°C，說明HMPB具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能。
[0043]實(shí)施例七
將實(shí)施例一中制備的HMPB在紫外燈光下輻照過夜進(jìn)行滅菌，用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液配制成0ppm、12.5ppm、25ppm、50ppm、10ppm濃度，用噻挫藍(lán)(MTT)法評(píng)價(jià)不同濃度材料對(duì)細(xì)胞的熱療效果。人宮頸癌(Hela)細(xì)胞以IXlO4接種到96孔板中，在37°C、含5% 0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)使細(xì)胞貼壁。以每孔10uL的量加入不同濃度HMPB的細(xì)胞培養(yǎng)液到96孔板中培養(yǎng)4小時(shí)后，用808nm激光5W/cm2下輻照5min繼續(xù)培養(yǎng)20h，倒掉上層培養(yǎng)液，每孔加入MTT的DMEM培養(yǎng)液(0.5?lmg/mL)各100 μ L培養(yǎng)4h。最后除去MTT的培養(yǎng)液加入100 μ L DMSO,輕輕搖晃后在酶標(biāo)儀上測(cè)其在490nm吸光度。熱療效果用Oppm細(xì)胞活力的百分比表示，如圖3(c)?？梢钥闯鲭SHMPB濃度增大，激光輻照后，細(xì)胞存活率逐漸變低，即對(duì)細(xì)胞的殺傷力越來越強(qiáng)。
[0044]實(shí)施例八
將Hela細(xì)胞以5X 15的數(shù)量接種到共聚焦皿中，在37°C、含5% CO 2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)使細(xì)胞貼壁。倒掉共聚焦皿中的培養(yǎng)基，繼續(xù)加入ImL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4h，作為對(duì)照組，用鈣黃綠素和碘化吡啶染色，激光共聚焦顯微鏡(CLSM)進(jìn)行觀察。鈣黃綠素用來染活細(xì)胞，CLSM觀察為綠色，碘化吡啶用來染凋亡和壞死的細(xì)胞，CLSM觀察呈現(xiàn)紅色。如圖3d中(dl)、圖3d中(d2)所示，未做任何處理的細(xì)胞只有極少數(shù)凋亡和壞死。
[0045]實(shí)施例九
將Hela細(xì)胞以5 X 15分別接種到共聚焦皿中，在37°C、含5% CO 2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)基，加入ImL濃度為50ppm的HMPB的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4h，用808nm激光5W/cm2下福照5min后，用1?黃綠素和碘化卩比啶染色，CLSM進(jìn)行觀察。如圖3d中(d3)-(d4)所示，有部分細(xì)胞凋亡和壞死。
[0046]實(shí)施例十
將Hela細(xì)胞以5 X 15分別接種到共聚焦皿中，在37°C、含5% CO 2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)使細(xì)胞貼壁。共聚焦皿中的培養(yǎng)基，加入ImL濃度為50ppm的HMPB的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4h，用808nm激光5W/cm2下分別福照1min后，用1?黃綠素和碘化卩比啶染色，CLSM進(jìn)行觀察。如圖3d中(d5)-(d6)所示，隨激光輻照時(shí)間增加，越來越多細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死。
[0047]實(shí)施例^^一
將實(shí)施例三中制備的HMPB-Pra的配成2mg/mL的PBS溶液3mL置于塑料滴管中在20°C脫氣水中，B模式，機(jī)械指數(shù)為0.8時(shí)觀察超聲成像效果，如圖4中(a)，裝有PHl的HMPB在室溫(20°C )能產(chǎn)生少量氣泡，具有微弱超聲成像功能。
[0048]實(shí)施例十二
將實(shí)施例三中制備的HMPB-Pra的配成2mg/mL的PBS溶液3mL置于塑料滴管中在42.5°C脫氣水中，B模式，機(jī)械指數(shù)為0.8時(shí)觀察超聲成像效果，如圖4中(b)，在42.5°C時(shí)可以產(chǎn)生大量氣泡，圖像變亮，具有顯著的超聲造影效果。
[0049]實(shí)施例十三
將PBS3mL置于塑料滴管中，在脫氣水中，B模式，機(jī)械指數(shù)為0.8時(shí)觀察超聲成像效果，如圖5中(a)所示，單純PBS溶液幾乎觀察不到超聲成像信號(hào)。
[0050]實(shí)施例十四
將實(shí)施例三中制備的HMPB-PFP的配成2mg/mL的PBS溶液3mL置于塑料滴管中在20°C脫氣水中，B模式，機(jī)械指數(shù)為0.8時(shí)觀察超聲成像效果，如圖5中(b)，裝有PFP的材料HMPB在室溫(20°C )能產(chǎn)生少量氣泡，具有一定超聲造影功能。
[0051]實(shí)施例十五
將實(shí)施例三中制備的HMPB-PFP的配成2mg/mL的PBS溶液3mL置于塑料滴管中在42.5°C脫氣水中，B模式，機(jī)械指數(shù)為0.8時(shí)觀察超聲成像效果，如圖5中(C)，在42.5°C時(shí)可以產(chǎn)生大量氣泡，具有顯著的超聲造影效果。
[0052]實(shí)施例十六
將種有Hela腫瘤的的裸鼠進(jìn)行麻醉，B模式機(jī)械指數(shù)為0.8觀察未注射HMPB-PFP的PBS溶液腫瘤的狀態(tài)如圖5中(d)。注射實(shí)施例三中制備的HMPB-PFP的2mg/mL的PBS溶液30uL后用B模式下機(jī)械指數(shù)為0.8觀察腫瘤處成像效果如圖5中(e)。然后注射HMPB-PFP的腫瘤處用808nm激光2W/cm2福照5min，在B模式機(jī)械指數(shù)為0.8觀察腫瘤的狀態(tài)如圖5中(f)所示。如圖5所示，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，注射HMPB-PFP之前腫瘤區(qū)域觀察不到成像效果，注入HMPB-PFP之后有微弱超聲成像，當(dāng)用808nm激光照射后有顯著超聲信號(hào)增強(qiáng)，說明制備的納米診療劑具有顯著的超聲造影功能。
【權(quán)利要求】
1.一種空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑，其特征在于，所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑包括表面具有介孔、內(nèi)部空心的普魯士藍(lán)納米顆粒，以及裝載于所述普魯士藍(lán)納米顆粒中的溫敏型相變材料，其中，所述溫敏型相變材料包括氟碳化合物和/或薄荷醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑，其特征在于，所述氟碳化合物包括全氟戊烷和/或全氟己烷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑，其特征在于，所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑的表面帶負(fù)電荷，普魯士藍(lán)納米顆粒粒徑范圍為100-1000nm，普魯士藍(lán)納米顆粒外殼的厚度范圍為10-100 nm，普魯士藍(lán)納米顆粒表面具有微孔和介孔，其中微孔的大小為0.5-2 nm，介孔的大小為3.2-30 nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑，其特征在于，在所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑中，空心普魯士藍(lán)納米顆粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%-99.0%，氟碳化合物溫敏型相變材料和/或薄荷醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%-3%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1一4中任一所述的空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑，其特征在于，所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑在近紅外光區(qū)域λ = 650-970 nm，實(shí)現(xiàn)光熱轉(zhuǎn)換。
6.—種權(quán)利要求1-5中所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括: 1)將0.132-0.396份鐵氰化鉀和2_10份聚乙烯吡咯烷酮加入到酸中，磁攪拌至得到澄清混合液，然后將澄清混合液轉(zhuǎn)至烘箱中，在60-100°C陳化，冷卻后分離、洗滌，得到所述具有介孔的普魯士藍(lán)納米顆粒； 2)將表面具有介孔的普魯士藍(lán)納米顆粒分散于酸中，在120-140°C陳化后，分離得到表面具有介孔、內(nèi)部空心的普魯士藍(lán)納米顆粒； 3)采用真空灌注法將氟碳化合物溫敏型相變材料和/或薄荷醇注入步驟2)制備的表面具有介孔、內(nèi)部空心的普魯士藍(lán)納米顆粒中，制備得到所述空心介孔普魯士藍(lán)納米光熱診療劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟I)中，酸的量為30-100份，酸為0.01-2M的鹽酸，陳化時(shí)間為12-20小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中，使用的酸為濃度1-2M的鹽酸，陳化時(shí)間為2-4小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中，真空灌注法為在真空度為500— 5000Pa下進(jìn)行冰水浴、超聲。
【文檔編號(hào)】A61K9/14GK104474559SQ201410712157
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】蔡曉軍, 賈曉慶, 陳航榕, 施劍林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所