一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法
【專利摘要】一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明以聚乙二醇化殼聚糖（PEG-CS）作為包封材料，采用離子凝膠法制備載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球，即先將一定濃度的PEG-CS溶液和胰島素溶液混合，在磁力攪拌下滴加低濃度的三聚磷酸鈉（TPP），用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.5，反應(yīng)完成后，將懸濁液離心，收集微球即可。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，條件溫和，所得微球生物相容性好，可在模擬腸液中穩(wěn)定釋放7天，具有緩釋功能，且可保證藥物的生物活性，有望實(shí)現(xiàn)胰島素的口服給藥。
【專利說(shuō)明】一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種包封胰島素的方法，尤其是涉及一種關(guān)于胰島素緩釋口服制劑的制備方法，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]基礎(chǔ)胰島素是治療糖尿病的主要藥物，在I型和2型(也包括其他類型)糖尿病患者的治療中均起到重要作用，美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)指南中對(duì)基礎(chǔ)胰島素治療的評(píng)價(jià)是“最有效”。自從基因重組人胰島素技術(shù)使胰島素的廣泛應(yīng)用成為可能以后，胰島素皮下注射一直是糖尿病患者的主要給藥途徑。但皮下注射會(huì)造成皮下脂肪萎縮，給患者帶來(lái)不便與痛苦。為了克服皮下注射的缺點(diǎn)，提高患者的順應(yīng)性，改善患者的生活質(zhì)量，研制使用方便、療效確切、安全可靠的胰島素非注射給藥劑型，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界共同關(guān)注的課題。
[0003]口服給藥途徑是最傳統(tǒng)、方便和易于被患者接受的理想給藥方式。但胰島素口服給藥需要克服以下主要問(wèn)題:①制備、儲(chǔ)存和使用過(guò)程中如何保持胰島素的生物活性，穩(wěn)定胰島素構(gòu)型；②如何減少胰島素分子多聚體形成，促進(jìn)胰島素的吸收利用；③如何減輕消化道酶對(duì)胰島素的降解作用等。因此，提出一種可以穩(wěn)定地包封胰島素的口服制劑，提高其生物利用度，具有很大的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服治療糖尿病的藥物胰島素在使用過(guò)程中的不足，從而提出一種可以穩(wěn)定包封胰島素，實(shí)現(xiàn)其口服給藥的胰島素緩釋口服制劑的制備方法。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)將PEG-CS和TPP分別溶于蒸餾水中，得到PEG-CS溶液和TPP溶液；
將胰島素粉末用鹽酸溶解，再用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，最后用磷酸鹽緩沖溶液定容，得到胰島素溶液；
(2)將PEG-CS溶液和胰島素溶液混合，并在磁力攪拌下滴加鹽酸直至溶液澄清透明；
(3)再將TPP溶液緩慢滴加到步驟(2)澄清透明的溶液中，得到最終反應(yīng)液；用鹽酸調(diào)節(jié)最終反應(yīng)液的pH值，滴加完成后繼續(xù)反應(yīng)20min，得到懸濁液；
(4)將最終得到的懸濁液離心20min，收集沉淀，冷凍干燥，得到載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球，即胰島素緩釋口服制劑。
[0006]步驟(I)中PEG-CS的取代度為11.52%，PEG-CS溶液的濃度為2mg/mL。
[0007]步驟(I)中TPP溶液的濃度為lmg/ml。
[0008]步驟(I)中胰島素溶液的濃度為5mg/ml。
[0009]步驟(I)中，溶解胰島素粉末的鹽酸pH=2，NaOH溶液的濃度為0.1M，磷酸鹽緩沖溶液的 pH=7.4。
[0010]步驟(2)中滴加IM鹽酸直至溶液澄清透明。
[0011]步驟(3 )中PEG-CS溶液和TPP溶液的質(zhì)量比為2:1 ;調(diào)節(jié)最終反應(yīng)液pH值的鹽酸濃度為1M，經(jīng)鹽酸調(diào)節(jié)后的最終反應(yīng)液的pH值為5.5。
[0012]步驟(4)中懸濁液離心速度為11000r/min。
[0013]步驟(I)中PEG-CS是按以下步驟合成的:
稱取Ig CS (分子量500000)溶解于6 ml的醋酸中，用20ml TEMED.HCL稀釋，并加入到三口燒瓶中，測(cè)pH值為5 ;然后加入EDC和NHS，30min后按摩爾比為mPEG-COOH: CS=1:1的比例稱取mPEG-COOH，加入三口燒瓶中，恒溫水浴35 °C，攪拌反應(yīng)36h，反應(yīng)過(guò)程中控制pH為4-6 ;將得到的粗產(chǎn)物置于透析袋中透析4天，冷凍干燥得到PEG-CS。
[0014]所述醋酸的體積濃度為2 %。
[0015]本發(fā)明以水溶性聚乙二醇化殼聚糖(PEG-CS)作為包封材料，中性環(huán)境有利于胰島素活性的穩(wěn)定與保持。采用溫和的離子凝膠法制備載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球，即先將一定濃度的PEG-CS溶液和胰島素溶液混合，在磁力攪拌下滴加低濃度的三聚磷酸鈉(TPP)，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.5。反應(yīng)完成后，將懸濁液離心，收集微球即可。
[0016]本發(fā)明提供了一種可以穩(wěn)定包封胰島素，實(shí)現(xiàn)其口服給藥的制劑的制備方法，制備方法簡(jiǎn)單，條件溫和。所得微球生物相容性好，性能優(yōu)異，形貌可控，分散性良好，并且可以通過(guò)改變相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)節(jié)；包封率達(dá)50%以上，可實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島素的有效包封；用聚乙二醇化殼聚糖作為包封材料，其生物相容性和水溶性都很好，能提高胰島素的生物利用度；所得載胰島素微球具備緩釋功能，可在模擬腸液中穩(wěn)定釋放7天，且可保證藥物的生物活性(可保持胰島素活性不變)，有望實(shí)現(xiàn)胰島素的口服給藥。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)便可靠，實(shí)驗(yàn)周期較短，可望批量生產(chǎn)以實(shí)現(xiàn)應(yīng)用。
[0017]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1為本發(fā)明中載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球的--Μ圖；
圖2為本發(fā)明中胰島素的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖3為本發(fā)明中載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球在模擬腸液中的控制釋放曲線；
圖4為本發(fā)明中胰島素的圓二色光譜圖。
[0018]【具體實(shí)施方式】:
一、制備工藝
1.聚乙二醇化殼聚糖的合成
稱取Ig CS (CS為殼聚糖，分子量500000)，溶解于6 ml醋酸中，醋酸體積濃度(v/v)為2 %，用20 ml TEMED*HCL稀釋，加入到三口燒瓶中，測(cè)pH值為5左右，然后加入一定量EDC和NHS，30min后按摩爾比為mPEG-COOH: CS=1:1的比例稱取mPEG_C00H，加入三口燒瓶中，恒溫水浴35 °C，攪拌反應(yīng)36h，反應(yīng)過(guò)程中控制pH 4_6。
[0019]將得到的粗產(chǎn)物置于透析袋中透析4天，冷凍干燥得到聚乙二醇化殼聚糖。
[0020]2.載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球的制備
(I)分別稱取一定量的PEG-CS (聚乙二醇化殼聚糖)和TPP (三聚磷酸鈉)溶于蒸餾水中，得到PEG-CS溶液、TPP溶液，使PEG-CS溶液的濃度為2mg/ml，PEG-CS的取代度為11.52%，TPP溶液的濃度為lmg/ml ；
稱取一定量的胰島素粉末，用pH=2的鹽酸溶解，再用0.1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)定容，使其濃度為5mg/ml ； (2)將PEG-CS溶液和胰島素溶液混合，磁力攪拌下滴加濃度為IM的鹽酸直至溶液澄清透明；
(3)再將TPP溶液緩慢滴加到上述澄清透明的溶液中，得到最終反應(yīng)液，用濃度為IM的鹽酸調(diào)節(jié)最終反應(yīng)液的PH值至5.5，滴加完成后繼續(xù)反應(yīng)20min，得到懸濁液，其中，PEG-CS溶液和TPP溶液的質(zhì)量比為2:1 ；
(4)將最終得到的懸濁液離心20min(離心速度為11000r/min)，收集沉淀，冷凍干燥(_20°C)，即可得到載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球，即胰島素緩釋口服制劑。
[0021]二.載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球的表征 1.形貌及分散性
(I)透射電鏡
微球的形貌通過(guò)Tecna1-12透射電鏡(TEM)進(jìn)行觀察。首先將分散在蒸餾水中的微球滴在銅網(wǎng)上，紅外燈下干燥1min后用磷鎢酸(PTA)負(fù)染，再在紅外燈下干燥，之后進(jìn)行觀察。
[0022]圖1為載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球的TEM圖(放大倍數(shù)13500)，從圖中可看出微球呈球形或類球形。
[0023](2)動(dòng)態(tài)光散射
用動(dòng)態(tài)光散射5022F (Germany)檢測(cè)樣品的分散系數(shù)。以He-Ne激光為光源，波長(zhǎng)671nm，室溫下散射角90°。測(cè)得的分散系數(shù)為0.374，說(shuō)明分散性良好。
[0024]2.胰島素的標(biāo)準(zhǔn)曲線
逐級(jí)稀釋法配置一系列不同濃度的胰島素溶液，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS7.4)定容，再用UV-2501型紫外分光光度計(jì)測(cè)定，以胰島素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]圖2為胰島素溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.033χ-0.0009,其中χ為胰島素濃度，y為吸光度；線性回歸方程為R2=0.9999，說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，可作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線使用。
[0026]3.包封率
收集離心后的上清液，用0.22 μ m的水系針頭濾器過(guò)濾數(shù)遍，再用UV-2501型紫外分光光度計(jì)測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球的包封率。
[0027]本發(fā)明所制備出的載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球的包封率可達(dá)50%以上。
[0028]4.控制釋放
精確稱取一定量干燥了的載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球，置于截留分子量為5萬(wàn)的透析袋中，加入2ml pH=6.8的模擬腸液(磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的緩沖溶液)，透析袋置于裝有1ml釋放介質(zhì)的離心管中，放在170rpm，37°C的水浴搖床中釋放。每隔一段時(shí)間取一次樣，每次取ImL釋放介質(zhì)再補(bǔ)充相同量的新鮮介質(zhì)。取出的釋放介質(zhì)用UV-2501型紫外分光光度計(jì)測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出胰島素釋放量。
[0029]從圖3看出載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球在模擬腸液中釋放出的胰島素高達(dá)85%。
[0030]5.圓二色光譜圖(⑶光譜)
用J-810型圓二色光譜儀測(cè)定胰島素的二級(jí)結(jié)構(gòu):lnm光程差的圓柱形石英比色皿，恒溫4 °C下測(cè)定。
[0031]在圓二色光譜中，蛋白質(zhì)在208 nm和222 nm處的兩個(gè)負(fù)峰分別是α螺旋和β折疊的特征峰。從圖4可看出，載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球在模擬腸液中釋放出的胰島素的構(gòu)象和純胰島素溶液的構(gòu)象基本一致，說(shuō)明胰島素結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生改變，該微球可保持胰島素原有生物活性。
[0032]三、總結(jié)
本發(fā)明制備出的載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球，其PDI值在0.3-0.4，分散性良好；藥物包封率在50%以上，可在模擬腸液中穩(wěn)定釋放7天，控制釋放百分率高達(dá)85%，且可保持胰島素活性不變。因此，本發(fā)明有望實(shí)現(xiàn)胰島素的口服給藥。
【權(quán)利要求】
1.一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將PEG-CS和TPP分別溶于蒸餾水中，得到PEG-CS溶液和TPP溶液； 將胰島素粉末用鹽酸溶解，再用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，最后用磷酸鹽緩沖溶液定容，得到胰島素溶液； (2)將PEG-CS溶液和胰島素溶液混合，并在磁力攪拌下滴加鹽酸直至溶液澄清透明； (3)再將TPP溶液緩慢滴加到步驟(2)澄清透明的溶液中，得到最終反應(yīng)液；用鹽酸調(diào)節(jié)最終反應(yīng)液的pH值，滴加完成后繼續(xù)反應(yīng)20min，得到懸濁液； (4)將最終得到的懸濁液離心20min，收集沉淀，冷凍干燥，得到載胰島素聚乙二醇化殼聚糖微球，即胰島素緩釋口服制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中PEG-CS的取代度為11.52%，PEG-CS溶液的濃度為2mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中TPP溶液的濃度為lmg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中胰島素溶液的濃度為5mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，溶解胰島素粉末的鹽酸pH=2，NaOH溶液的濃度為0.1M，磷酸鹽緩沖溶液的pH=7.4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)中滴加1M鹽酸直至溶液澄清透明。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，步驟(3)中PEG-CS溶液和TPP溶液的質(zhì)量比為2:1 ;調(diào)節(jié)最終反應(yīng)液pH值的鹽酸濃度為1M，經(jīng)鹽酸調(diào)節(jié)后的最終反應(yīng)液的pH值為5.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，步驟(4)中懸濁液離心速度為11000r/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中PEG-CS是按以下步驟合成的: 稱取lg CS溶解于6 ml的醋酸中，用20ml TEMED.HCL稀釋，并加入到三口燒瓶中，測(cè)pH值為5 ;然后加入EDC和NHS，30min后按摩爾比為mPEG-COOH: CS=1:1的比例稱取mPEG-COOH，加入三口燒瓶中，恒溫水浴35°C，攪拌反應(yīng)36h，反應(yīng)過(guò)程中控制pH為4_6 ;將得到的粗產(chǎn)物置于透析袋中透析4天，冷凍干燥得到PEG-CS。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種胰島素緩釋口服制劑的制備方法，其特征在于，所述醋酸的體積濃度為2 %。
【文檔編號(hào)】A61K38/28GK104491844SQ201410712238
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】宋曉麗, 許春蘭, 閆彩鳳, 朱愛(ài)萍, 郭榮 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)