一種喜樹堿納米凝膠的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以PLGA包裹抗銀屑病藥物喜樹堿作為納米系統(tǒng)的核，將PAMAM包裹在PLGA表面作為納米系統(tǒng)的殼，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備載喜樹堿納米系統(tǒng)，并用油酸(OA)進(jìn)行修飾，得到經(jīng)表面改性的核殼納米給藥系統(tǒng)。并且進(jìn)一步地，以羥丙甲基纖維素(HPMC)為基質(zhì)，制備喜樹堿納米凝膠(CPT-PPO gel)。經(jīng)過油酸修飾的CPT-PPO gel可以顯著提高藥物皮膚吸收和滯留，而不增加皮膚滲透量，從而不增加藥物進(jìn)入血液循環(huán)的量，能有效降低藥物的全身毒性，是一種優(yōu)秀的喜樹堿局部治療的新劑型。
【專利說明】一種喜樹堿納米凝膠

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種喜樹堿納米凝膠以及其制備方法，屬于制藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 銀肩?。ㄋ追Q牛皮癬），是一種慢性、復(fù)發(fā)性、增殖性表皮疾患，是一公認(rèn)的皮膚 頑疾。臨床外用治療常使用喜樹堿及其它激素類藥物，但由于皮膚吸收能力差、毒性大，往 往給患者帶來極大的不便，達(dá)不到理想的治療效果。近年來，新型給藥系統(tǒng)特別是以納米載 體為基礎(chǔ)的給藥系統(tǒng)的發(fā)展，為皮膚相關(guān)疾病的治療提供了更多的選擇和機(jī)會。建立在納 米系統(tǒng)基礎(chǔ)上的藥物載體可以熟練地控制藥物緩慢等時(shí)釋放，建立皮膚儲庫在局部皮膚發(fā) 揮效應(yīng)。另外，納米粒徑的藥物由于粒徑小，因此可以在藥物停留、專一靶向性方面達(dá)到更 好的效果，可以提高給藥效率降低刺激性和毒性，同時(shí)也提高了患者的依從性。如固體脂質(zhì) 納米粒（SLN)、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體（NLC)以及脂質(zhì)體，在研宄和實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出了很好的皮膚 滲透性。但是這些藥物有限的載藥量和相對穩(wěn)定性的問題，導(dǎo)致其用于臨床應(yīng)用受到了限 制。而聚合物納米粒子，如聚（ε-己內(nèi)酯）、聚丙烯亞胺（PPI)、殼聚糖、聚乳酸（PLA)等 則顯示出了良好的局部用藥潛力。這些聚合物納米粒子通過修飾來減少藥物與皮膚直接接 觸的刺激以達(dá)到可控性和持續(xù)釋放的優(yōu)點(diǎn)。PLGA是一種生物相容性好的聚合物材料，基于 PLGA的聚合物納米粒已經(jīng)被廣泛的用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，它具有生物相容性好、毒性低、易被 水解等優(yōu)點(diǎn)。通過表面修飾陽離子聚合物以及加入化學(xué)促滲劑可以增加納米粒的穩(wěn)定性 和透皮效果。聚酰胺胺（PAMM)是一種人工合成的陽離子聚合物，分子高度分枝，呈單分散 性，其末端氨基豐富，正電性強(qiáng)，并易于修飾連接生物活性物質(zhì)以改變載體高分子性質(zhì)，有 相關(guān)研宄表明聚酰胺胺具有良好的促進(jìn)皮膚滲透的作用。通過PAMM表面修飾PLGA不僅 可以增加 PLGA包裹藥物（如喜樹堿）的穩(wěn)定性，PAMM表面的自由氨基還可以接枝化學(xué)促 滲劑（如油酸）進(jìn)一步打開皮膚角質(zhì)層同道，提高皮膚遞送效果。
[0003] 納米凝膠是聚合物通過物理或化學(xué)交聯(lián)的方式形成的納米粒徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它的 優(yōu)點(diǎn)是可以增加皮膚的滯留時(shí)間，增加藥物的有效負(fù)載。本實(shí)驗(yàn)將喜樹堿制備成納米凝膠 劑，以提高藥物經(jīng)皮滲透量及皮膚滯留量，為喜樹堿新型納米凝膠劑型的開發(fā)研宄提供實(shí) 驗(yàn)依據(jù)。
[0004] 本發(fā)明提供一種新型喜樹堿納米凝膠，以PLGA包裹抗銀肩病藥物喜樹堿作為納 米系統(tǒng)的核，將PAMM包裹在PLGA表面作為納米系統(tǒng)的殼，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備載喜 樹堿納米系統(tǒng)，并用油酸（OA)進(jìn)行修飾，得到經(jīng)表面改性的核殼納米給藥系統(tǒng)。并且進(jìn)一 步地，以羥丙甲基纖維素（HPMC)為基質(zhì)，制備喜樹堿納米凝膠（CPT-PPO gel)。經(jīng)過油酸修 飾的CPT-PPO gel可以顯著提高藥物皮膚吸收和滯留，而不增加皮膚滲透量，從而不增加藥 物進(jìn)入血液循環(huán)的量，能有效降低藥物的全身毒性，是一種優(yōu)秀的喜樹堿局部治療的新劑 型。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問題，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新型喜樹堿納米凝膠，以PLGA 包裹抗銀肩病藥物喜樹堿作為納米系統(tǒng)的核，將PAMM包裹在PLGA表面作為納米系統(tǒng)的 殼，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備載喜樹堿納米系統(tǒng)，并用油酸（OA)進(jìn)行修飾，得到經(jīng)表面改 性的核殼納米給藥系統(tǒng)。
[0006] 并且進(jìn)一步地，以羥丙甲基纖維素（HPMC)為基質(zhì)，制備喜樹堿納米凝膠（CPT-PP0 gel) 〇
[0007] 對其含量、理化性質(zhì)和體外透皮特性進(jìn)行考察，結(jié)果表明，經(jīng)過油酸修飾的 CPT-PPO gel可以顯著提高藥物皮膚吸收和滯留，而不增加皮膚滲透量，從而不增加藥物進(jìn) 入血液循環(huán)的量，能有效降低藥物的全身毒性，是一種優(yōu)秀的喜樹堿局部治療的新劑型。
[0008] 具體而言，本發(fā)明提供一種載喜樹堿納米粒，其制備方法為：
[0009] (1)將喜樹堿溶于適量乙醇中與含有PLGA的有機(jī)相充分混合；
[0010] ⑵由乳化溶劑揮發(fā)法制備載喜樹堿納米粒，并用油酸（OA)進(jìn)行修飾。
[0011] 所述步驟⑵的方法優(yōu)選為：
[0012] 取IOmg步驟⑴獲得的含有喜樹堿的PLGA，將其溶解在1.5ml二氯甲烷中 得到的溶液作為有機(jī)相，將有機(jī)相加入到14. 5ml 0. 1 % (W/V) PVA、4ml0. 5 % PAMM與 1.5ml吐溫80的混合溶液中，恒定的速度攪拌使之形成粗乳液，然后用超細(xì)均漿機(jī)攪拌 151^11(35000印111)使之形成納米乳 ；揮干有機(jī)相，加入100以11%(1/￥)三磷酸鈉〇1^)交 聯(lián)，然后在300rpm下攪拌2h后懸浮于磷酸鹽緩沖液（pH8. 0)中，與油酸（OA)溫育2h。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步還提供了一種喜樹堿納米凝膠，其制備方法為：
[0014] 將HPMC逐滴加入至不斷攪拌的上述獲得的喜樹堿納米粒水溶液中直至完全形成 凝膠，室溫穩(wěn)定24h備用。
[0015] 本發(fā)明所用儀器與材料：
[0016] 儀器
[0017] BS224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），DZF-6090真空干燥 箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)6-10超細(xì)勻漿機(jī)（規(guī)格：145W)，IKA磁力攪拌器， UPWS-I-5T超純水器（杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司），F(xiàn)I-IR紅外光譜儀（美國瓦里安公 司），TDL-60B低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器），SHZ-B水浴恒溫振蕩器（上海博訊實(shí) 業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），ADVENCE 400M核磁共振儀（美國瓦里安公司），LC3000型高效液 相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司），2010透射電鏡（日本JEOL公司），TK-12A型透皮 擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司），Zeta sizer ZS90粒度分析儀（英國Malvern 公司）。
[0018] 藥品和試劑：
[0019] PLGA(濟(jì)南岱罡生物工有限公司，分子量1.5萬），聚乙烯醇（PVA)(常州市天怡工 程纖維有限公司），PAMM(G3. 0,威海晨源化工新材料有限公司），喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品 生物制品檢定所），喜樹堿（CPT)(梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，分子量348. 36)， 油酸（OA)(西格瑪公司），羥丙甲基纖維素（HPMC，濟(jì)南岱罡生物工有限公司），美國聯(lián)合碳 化干型透析袋（MD34-70MW: 7000D)，除色譜用試劑為HPLC級，其他試劑均為分析純。
[0020] 本發(fā)明喜樹堿含量測定方法：
[0021] 色譜條件
[0022] 色譜柱：C18色譜柱（5 μπι，250mmX4. 6mm);流動相：甲醇 / 水（70/30, V/V);檢測 波長：254nm ;流速：1. Oml · miiT1;進(jìn)樣體積：20 μ 1。此條件下喜樹堿對照品溶液和樣品溶 液的HPLC圖見附圖1所示。
[0023] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和方法學(xué)研宄
[0024] 對照品溶液的制備：精密稱取CPT對照品3mg，置于IOOml容量瓶中，加入適量甲 醇超聲溶解并稀釋至刻度，得對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液〇. l、〇. 2、0. 4、 0. 8、1. 2、1. 6、2. Oml置于IOml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，制得質(zhì)量濃度為0. 3、 0. 6、1. 2、2. 4、3. 6、4. 8、6. 0 μ g · πιΓ1的CPT對照品溶液。將不同濃度的溶液分別進(jìn)樣 20 μ 1，按前述色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積（Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行 回歸分析，得到喜樹堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y = 594. 43X+339053，R = 0. 9999,結(jié)果表明CPT在 0.3?e.Oyg^mr1時(shí)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的 RSD均小于3. 0%，符合方法學(xué)要求。
[0025] 本發(fā)明的有益之處在于：
[0026] 本發(fā)明通過改性乳化溶劑揮發(fā)法制備了載有喜樹堿的納米凝膠，此凝膠作為一種 新型藥物，具有一定的載藥量，可顯著增加藥物皮膚滯留量，減少藥物經(jīng)皮的滲透，從而延 長藥物的作用時(shí)間，滿足局部治療的要求，是一種新型的局部外用的新劑型。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明色譜條件下喜樹堿對照品溶液和樣品溶液的HPLC圖：
[0028] . A:喜樹堿對照品；B:喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品。
[0029] 圖2為CPT-PPO透射電鏡照片。
[0030] 圖3為CPT-PPO和CPT-PP納米凝膠體外藥物釋放透曲線。
[0031] 圖4為CPT，CPT-PP和CPT-PPO納米凝膠24h藥物單位累計(jì)透皮量（η = 5， mean土SD, **:ρ〈0· 01)。
[0032] 圖5為CPT，CPT-PP和CPT-PPO納米凝膠的皮膚滯留量。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1喜樹堿納米粒極其凝膠的制備：
[0034] 空白及載藥納米粒的制備：
[0035] PLGA-PAMAM-OA (PPO)納米粒是由乳化溶劑揮發(fā)法制備，取IOmgPLGA溶解在I. 5ml 二氯甲烷中得到的溶液作為有機(jī)相，將有機(jī)相加入到14.5ml 0.1% (W/V)PVA、4ml 0.5% PAMAM與I. 5ml吐溫80的混合溶液中，恒定的速度攪拌使之形成粗乳液，然后用超細(xì)均漿 機(jī)攪拌15min(35000rpm)使之形成納米乳。揮干有機(jī)相，加入ΙΟΟμΙΙ% (W/V)三磷酸鈉 (TPP)交聯(lián)，然后在300rpm下攪拌2h后懸浮于磷酸鹽緩沖液（ρΗ8.0)中，與油酸（OA)溫育 2h，即得到空白的納米粒ΡΡ0,未修飾的PLGA納米粒（PLGA-PAMAM)參照上述方法制備。
[0036] 載喜樹堿載藥納米粒CPT/PLGA-PAMAM-OA (CPT-PPO)制備方法為：首先將喜樹堿 溶于適量乙醇中與含有PLGA的有機(jī)相充分混合，后續(xù)步驟參照空白納米粒制備方法。
[0037] CPT-PPO的電鏡形態(tài)觀察
[0038] 采用磷鎢酸負(fù)染法，將CPT-PPO稀釋至適當(dāng)濃度，滴于300目銅網(wǎng)表面，5?6min 后用濾紙吸去多余液體，加入1滴I %磷鎢酸溶液（pH 7. 0)染色5min，濾紙吸去多余液體， 晾干后將此銅網(wǎng)置透射電子顯微鏡下觀測并拍照，電鏡檢測結(jié)果見附圖2,納米粒大部分成 規(guī)則的球形，外觀圓整，大小均勾，納米粒之間無粘連。
[0039] 包封率的測定
[0040] 取3批制備好的載藥凝膠，在2000rpm · rnirT1條件下用超濾管超濾15min，將沉淀 用二氯甲烷溶解，過濾，濾液按照樣品溶液處理方法制備成供試品溶液，按前述色譜條件測 定，計(jì)算3批樣品中喜樹堿的含量，計(jì)算得到的量代入公式（1)計(jì)算包封率。所制得的喜樹 堿納米粒包封率為78. 7±6. 9%。
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 一種載喜樹堿納米粒的制備方法，其特征在于其步驟如下： 將喜樹堿溶于適量乙醇中與含有PLGA的有機(jī)相充分混合； (2)用乳化溶劑揮發(fā)法制備載喜樹堿納米粒，并用油酸進(jìn)行修飾。
2. 權(quán)利要求1所述的載喜樹堿納米粒的制備方法，所述步驟（2)的方法為： 取l〇mg步驟（1)制得的含有喜樹堿的PLGA，將其溶解在1. 5ml二氯甲烷中得到的溶液 作為有機(jī)相，將有機(jī)相加入到14. 5 ml 0. 1% (W/V)PVA、4 ml 0. 5%PAMAM與1. 5 ml吐溫80 的混合溶液中，恒定的速度攪拌使之形成粗乳液，然后用超細(xì)均衆(zhòng)機(jī)以35000 rpm的轉(zhuǎn)速攪 拌15 min使之形成納米乳；揮干有機(jī)相，加入100 W1% (W/V)三磷酸鈉交聯(lián)，然后在300 rpm下攪拌2 h后懸浮于pH8. 0的磷酸鹽緩沖液中，與油酸溫育2 h。
3. 權(quán)利要求1-2所述方法制備得到的載喜樹堿納米粒。
4. 一種喜樹堿納米凝膠的制備方法，其特征在于其步驟為： (1) 將喜樹堿溶于適量乙醇中與含有PLGA的有機(jī)相充分混合； (2) 用乳化溶劑揮發(fā)法制備載喜樹堿納米粒，并用油酸（0A)進(jìn)行修飾； (3) 將HPMC逐滴加入至不斷攪拌的步驟（2)得到的納米粒水溶液中直至完全形成凝 月父，室溫穩(wěn)定24 h。
5. 權(quán)利要求4所述的喜樹堿納米凝膠的制備方法，所述步驟（2)的方法為： 取l〇mg步驟（1)制得的含有喜樹堿的PLGA，將其溶解在1. 5ml二氯甲烷中得到的溶液 作為有機(jī)相，將有機(jī)相加入到14. 5 ml 0. 1% (W/V)PVA、4 ml 0. 5%PAMAM與1. 5 ml吐溫80 的混合溶液中，恒定的速度攪拌使之形成粗乳液，然后用超細(xì)均漿機(jī)攪拌15 min使之形成 納米乳；揮干有機(jī)相，加入100K 11% (W/V)三磷酸鈉交聯(lián)，然后在300 rpm下攪拌2 h后懸 浮于PH8. 0的磷酸鹽緩沖液中，與油酸溫育2 h。
6. 權(quán)利要求4-5所述的制備方法制備得到的喜樹堿納米凝膠。
【文檔編號】A61K31/4745GK104490764SQ201410725690
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】王翔, 陳楊, 張梁宇 申請人:中國人民解放軍第九八醫(yī)院