一種生物活性材料、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物活性材料、其制備方法及應(yīng)用。所述生物活性材料為絲素蛋白膜，其縱切面呈多層結(jié)構(gòu)，其橫切面呈多孔褶皺結(jié)構(gòu)。其制備方法，包括以下步驟：(1)將絲素蛋白溶液，控制濃度、pH值及溫度，獲得前體溶液；(2)將前體溶液，在-200℃至40℃之間進(jìn)行溫度控制，讓大分子進(jìn)行自組裝，最終溫度在5℃以下，獲得凝固的自組裝生物大分子材料；(3)將自組裝生物大分子材料，進(jìn)行凍干處理，并進(jìn)行交聯(lián)處理，獲得所述生物活性材料。本發(fā)明提供的生物活性材料，用作胞外基質(zhì)仿生支架，促進(jìn)和引導(dǎo)細(xì)胞定向增殖和/或組織再生的效果良好。
【專利說明】一種生物活性材料、其制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，更具體地，涉及一種生物活性材料、其制備方法及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]組織工程是綜合應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、材料學(xué)和工程學(xué)的原理，以人工材料為支架，結(jié)合細(xì)胞植入，研究開發(fā)具有修復(fù)、改善損傷組織結(jié)構(gòu)和功能生物替代物的一門科學(xué)。在組織工程中，誘導(dǎo)組織再生修復(fù)的支架材料的構(gòu)建是其中關(guān)鍵的一環(huán)，支架材料主要可分為可吸收性和不可吸收性兩種。①不可吸收性材料，比如，聚四氟乙烯(PTFE)，這種材料力學(xué)性能良好，但其臨床應(yīng)用操作費時而且困難，放置4?6周后需二次手術(shù)摘除，給患者造成二次創(chuàng)傷，現(xiàn)在已較少應(yīng)用。②可吸收性降解材料，比如，多聚乳酸(PLA)和膠原蛋白材料。
[0003]可吸收性降解材料，具有患者使用后不需取出，促進(jìn)了愈合速度并減少了患者的痛苦的優(yōu)點。但這些材料植入體內(nèi)后，尚不具備定向調(diào)控組織再生修復(fù)的能力，促進(jìn)愈合速度的能力有待提聞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種生物活性材料、其制備方法及應(yīng)用，其目的在于提供一種具有特殊三位微觀結(jié)構(gòu)的生物活性材料，用于仿生組織再生微環(huán)境，從而定向誘導(dǎo)組織再生修復(fù)，由此解決現(xiàn)有的組織工程支架材料不能定向誘導(dǎo)組織再生修復(fù)、促進(jìn)愈合速度的能力不佳的技術(shù)問題。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種生物活性材料，所述生物活性材料為絲素蛋白膜，其縱切面呈多層結(jié)構(gòu)，其橫切面呈多孔褶皺結(jié)構(gòu)。
[0006]優(yōu)選地,所述生物活性材料,還包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過I %的藥物或生物活性因子，所述藥物優(yōu)選抗炎藥物，所述生物活性因子優(yōu)選促進(jìn)組織再生修復(fù)的生長因子。
[0007]按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述生物活性材料的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%至30%之間的絲素蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值在2至10之間；控制溫度在0°c至30°C之間，獲得前體溶液；
[0009](2)將步驟⑴獲得的前體溶液，在-200°C至40°C之間進(jìn)行溫度控制，溫度控制為單向降溫或梯度升降溫，變溫速度0.01度/秒至10度/秒，讓大分子自行組裝，控制最終溫度在5°c以下，獲得凝固的自組裝生物大分子材料；
[0010](3)將步驟⑵中獲得的凝固的自組裝生物大分子材料，進(jìn)行凍干處理，并對凍干后的生物大分子材料進(jìn)行交聯(lián)的處理，獲得所述生物活性材料。
[0011]優(yōu)選地，所述的制備方法，其步驟(2)在控制生物大分子溶液溫度過程中，當(dāng)生物大分子溶液處于溶液狀態(tài)或半凝固狀態(tài)時，向其注入藥物或生物活性因子。
[0012]優(yōu)選地，所述的制備方法，其步驟(2)當(dāng)溫度控制為梯度升降溫時，交替次數(shù)不超過5次。
[0013]按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述生物活性材料應(yīng)用，其應(yīng)用于促進(jìn)和引導(dǎo)細(xì)胞定向增殖和/或組織再生。
[0014]優(yōu)選地，所述生物活性材料應(yīng)用，其應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)。
[0015]優(yōu)選地，所述生物活性材料應(yīng)用，其應(yīng)用于引導(dǎo)缺損組織重建。
[0016]按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種胞外基質(zhì)仿生支架，包括所述的生物活性材料。
[0017]總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果:
[0018](I)本發(fā)明提供的生物活性材料，具有規(guī)整的通體微孔結(jié)構(gòu)以及較高的比表面積，能在體內(nèi)降解，相對于現(xiàn)有的可吸收性降解材料，由于其特殊的三維微觀結(jié)構(gòu)，能促進(jìn)和引導(dǎo)細(xì)胞定向增殖，更加有效的幫助組織再生，從而能加速創(chuàng)面愈合或引導(dǎo)缺損組織重建，幫助創(chuàng)面修復(fù)。
[0019](2)本發(fā)明提供的生物活性材料，能負(fù)載抗炎藥物或生物活性因子，可智能釋放生長活性因子引導(dǎo)組織再生，從而廣泛用于應(yīng)用于個人護(hù)理、細(xì)胞培養(yǎng)、創(chuàng)面及組織缺損的修復(fù)和重建領(lǐng)域。
[0020](3)本發(fā)明提供的生物活性材料，被酶解為天然的氨基酸，不像聚乳酸和聚乙交酯制成的膜在降解過程中會產(chǎn)生大量的酸，從而傷害修復(fù)的組織。具有良好生物相容性、無毒性、無刺激性切無細(xì)胞毒性。
[0021](4)本發(fā)明提供的所述生物活性材料的制備方法，原材料便宜易得，制備方法簡單，易于控制，適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明提供的生物活性材料結(jié)構(gòu)電鏡照片，其中圖1A為所述生物活性材料的縱截面電鏡照片，圖1B為所述生物活性材料的橫截面照片，圖1C為所述生物活性材料的，圖1D為橫截面納米纖維結(jié)構(gòu)；
[0023]圖2是實施例4人表皮細(xì)胞培養(yǎng)在胞外基質(zhì)生物活性材料表面黏附和增殖的電鏡照片；
[0024]圖3是實施例4人表皮細(xì)胞培養(yǎng)在胞外基質(zhì)生物活性材料表面黏附和增殖的熒光照片；
[0025]圖4是實施例5成骨細(xì)胞在實施例1制備的生物活性材料表面增殖的電鏡照片。

【具體實施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0027]本發(fā)明提供的生物活性材料，為絲素蛋白膜，具有三維立體千層餅狀微觀結(jié)構(gòu)，為規(guī)整的通體微孔結(jié)構(gòu)，如圖1所示，其縱切面呈多層結(jié)構(gòu)，如圖1A所示，其橫切面呈多孔褶皺結(jié)構(gòu)，如圖1B、圖1C所示，圖1B、圖1C為相互垂直的兩橫截面。優(yōu)選地，所述生物活性材料的橫截面具有納米纖維結(jié)構(gòu)，如圖1D所示。
[0028]所述生物活性材料，還可負(fù)載藥物、生物活性因子等活性成分。優(yōu)選的，所述生物活性材料還包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過I %的藥物或生物活性因子。所述藥物優(yōu)選抗炎藥物，所述生物活性因子，優(yōu)選促進(jìn)組織再生修復(fù)的生長因子，包括促進(jìn)纖維組織和結(jié)締組織再生修復(fù)的生長因子，例如:成纖維生長因子，骨再生生長因子。
[0029]所述生物活性材料，其制備方法包括以下步驟:
[0030](I)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%至30%之間的絲素蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值在2至10之間；控制溫度在0°c至30°C之間，獲得前體溶液；
[0031](2)將步驟(I)獲得的前體溶液，在-200°C至40°C之間進(jìn)行溫度控制，溫度控制為單向降溫或梯度升降溫，變溫速度0.01度/秒至10度/秒，讓大分子自行組裝，控制最終溫度在5°c以下，獲得凝固的自組裝生物大分子材料。梯度升降溫即逐漸降溫后逐漸升溫，交替進(jìn)行多次。如需負(fù)載藥物或生物活性因子，可在控制生物大分子溶液溫度過程中，當(dāng)生物大分子溶液處于溶液狀態(tài)或半凝固狀態(tài)時，向其注入藥物或生物活性因子。當(dāng)溫度控制為升降溫交替時，交替次數(shù)不超過5次。
[0032]其中梯度升降溫的溫度控制方法，為在迅速在多個溫度梯度上切換，并維持一定時間，根據(jù)前體溶液的黏度及表面張力等情況，溫度控制過程可能在升溫和降溫之間多次交替。溫度梯度之間溫差不超過10度，因此最大變溫速度為10度/秒。
[0033](3)將步驟⑵中獲得的凝固的自組裝生物大分子材料，進(jìn)行凍干處理，并對凍干后的生物大分子材料進(jìn)行交聯(lián)的處理，獲得所述生物活性材料。
[0034]本發(fā)明提供的生物活性材料，可作為胞外基質(zhì)仿生支架，應(yīng)用于促進(jìn)和引導(dǎo)細(xì)胞定向增殖和/或組織再生，尤其是創(chuàng)面修復(fù)、引導(dǎo)缺損組織重建等方面。創(chuàng)面修復(fù)，包括體內(nèi)、體外手術(shù)或外力所致創(chuàng)面，例如:燒傷創(chuàng)面、整形外科創(chuàng)面、體內(nèi)體外手術(shù)切口創(chuàng)面。引導(dǎo)缺損組織重建，例如:牙周組織缺損、骨組織缺損。
[0035]以下為實施例:
[0036]實施例1
[0037](I)用量筒準(zhǔn)確量取40ml濃度為10%的絲素蛋白溶液，用HCL調(diào)節(jié)pH值至6，控制溫度在20°C，獲得前體溶液。
[0038]所述絲素蛋白溶液按照如下方法制備:選取干凈除雜的蠶絲于0.5% Na2CO3水溶液中，100°C脫膠兩次，每次I小時，浴比1:50。脫膠后的絲素置于80°C的干燥箱中干燥至干。取脫膠后的絲素纖維10克溶于10ml的溴化鋰溶液中，在70°C恒溫磁力攪拌溶解。將上述獲得的絲素溶液進(jìn)行透析、脫鹽、純化，調(diào)節(jié)濃度，得到絲素蛋白溶液。
[0039](2)將步驟(I)獲得的前體溶液，倒入10cm*10cm模具中，在精密電機(jī)的帶動下，緩慢浸入液氮中，在_196°C至25°C之間進(jìn)行溫度控制，溫度控制為單向降溫，變溫速度1.5度/秒，控制最終溫度在-196，獲得凝固的自組裝生物大分子材料。單向降溫3分鐘，當(dāng)生物大分子溶液處于溶液狀態(tài)后迅速將成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)注入絲素溶液的0.2mm深處，使其通過界面擴(kuò)散效應(yīng)以及分子間氫鍵作用，實現(xiàn)擴(kuò)散。
[0040](3)待溶液完全凝固后，將步驟(2)中獲得的凝固的自組裝生物大分子材料，進(jìn)行凍干處理:負(fù)壓凍干48小時；然后對凍干后的生物大分子材料利用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)的處理:用戊二醛浸泡24h后用壓膜機(jī)將膜壓，再自然晾干，獲得所述生物活性材料。
[0041]實施例2
[0042](I)用量筒準(zhǔn)確量取40ml濃度為4%的絲素蛋白溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至
10;控制溫度在30°C，獲得前體溶液。
[0043]所述絲素蛋白溶液按照如下方法制備:選取干凈除雜的蠶絲于0.5% Na2CO3水溶液中，100°C脫膠兩次，每次I小時，浴比1:50。脫膠后的絲素置于80°C的干燥箱中干燥至干。取脫膠后的絲素纖維10克溶于10ml的溴化鋰溶液中，在70°C恒溫磁力攪拌溶解。將上述獲得的絲素溶液進(jìn)行透析、脫鹽、純化，調(diào)節(jié)濃度，得到絲素蛋白溶液。
[0044](2)將步驟(I)獲得的前體溶液，倒入10cm*10cm模具中，在_80°C至(TC之間進(jìn)行溫度控制，溫度控制為梯度升降溫，交替3次，變溫梯度為10度，控制最終溫度在-80，獲得凝固的自組裝生物大分子材料。當(dāng)生物大分子溶液處于0°環(huán)境時，向其注入抗炎藥物。
[0045](3)待溶液完全凝固后，將步驟(2)中獲得的凝固的自組裝生物大分子材料，進(jìn)行凍干處理:負(fù)壓凍干48小時；然后對凍干后的生物大分子材料利用甲醇進(jìn)行交聯(lián)處理:用甲醇浸泡24h后用壓膜機(jī)將膜壓至0.2mm厚，再自然晾干，獲得所述生物活性材料。
[0046]實施例3
[0047](I)將絲素蛋白粉配置成濃度為30%的溶液，用量筒準(zhǔn)確量取40ml濃度為30%的絲素蛋白溶液，用HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至2 ;控制溫度在10°C，獲得前體溶液。
[0048]所述絲素蛋白粉按照如下方法制備:選取干凈除雜的蠶絲于0.5% Na2CO3水溶液中，100°C脫膠兩次，每次I小時，浴比1:50。脫膠后的絲素置于80°C的干燥箱中干燥至干。取脫膠后的絲素纖維10克溶于10ml的溴化鋰溶液中，在70°C恒溫磁力攪拌溶解。將上述獲得的絲素溶液進(jìn)行透析、脫鹽、純化，凍干，獲得絲素蛋白粉。
[0049](2)將步驟(I)獲得的前體溶液，倒入10cm*10cm模具中，在精密電機(jī)的帶動下，緩慢浸入液氮中，在5至40°C之間進(jìn)行溫度控制，溫度控制為單向降溫，變溫速度0.01度/秒，控制最終溫度在5°，獲得凝固的自組裝生物大分子材料
[0050](3)待溶液完全凝固后，將步驟(2)中獲得的凝固的自組裝生物大分子材料，利用甲醇進(jìn)行交聯(lián)處理:用甲醇浸泡24h后用壓膜機(jī)將膜壓至0.2mm厚，再自然晾干，獲得所述生物活性材料。
[0051 ] 實施例4用于創(chuàng)面修復(fù)
[0052]將實施例1中制備的生物活性材料，采用MTT方法，接種人表皮細(xì)胞(Epidermalcells)，在96孔板上，鋪上生物材料和細(xì)胞培養(yǎng)基，接種細(xì)胞密度為I X 14,在37°C下，培養(yǎng)24小時。采用相應(yīng)的處理后，分別利用電鏡和熒光觀察細(xì)胞增殖情況。電鏡照片，如圖2所示,突光標(biāo)記的活細(xì)胞照片如圖3所示。數(shù)據(jù)顯示表皮細(xì)胞在材料表面沿著納米材料的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大量增殖，顯示了材料良好的生物相容性和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的能力。
[0053]實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的生物活性材料，能促進(jìn)和引導(dǎo)細(xì)胞定向增殖和/或組織再生，因此能加速創(chuàng)面愈合，進(jìn)一步地，能應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)。
[0054]實施例5用于誘導(dǎo)骨組織再生
[0055]將MG63細(xì)胞接種于鋪在24孔板的實施例1制備的生物活性材料面，每孔接種密度為IX104，經(jīng)過三天的培養(yǎng)，進(jìn)行沖洗和固定。利用電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的增殖情況。如圖4所示，成骨細(xì)胞在材料表面大面積的增殖，形成了骨組織，并具有一定生物礦化效果。表明該材料具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞再生和增值的能力，因此能應(yīng)用于引導(dǎo)缺損組織重建，尤其是缺損骨組織的重建。
[0056]本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種生物活性材料，其特征在于，所述生物活性材料為絲素蛋白膜，其縱切面呈多層結(jié)構(gòu)，其橫切面呈多孔褶皺結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的生物活性材料，其特征在于，還包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過I%的藥物或生物活性因子，所述藥物優(yōu)選抗炎藥物，所述生物活性因子優(yōu)選促進(jìn)組織再生修復(fù)的生長因子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生物活性材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%至30%之間的絲素蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值在2至10之間；控制溫度在0°C至30°C之間，獲得前體溶液； (2)將步驟(I)獲得的前體溶液，在-200°C至40°C之間進(jìn)行溫度控制，溫度控制為單向降溫或梯度升降溫，變溫速度0.01度/秒至10度/秒，讓大分子進(jìn)行自組裝，控制最終溫度在5°C以下，獲得凝固的自組裝生物大分子材料； (3)將步驟(2)中獲得的凝固的自組裝生物大分子材料，進(jìn)行凍干處理，并對凍干后的生物大分子材料進(jìn)行交聯(lián)處理，獲得所述生物活性材料。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟⑵在控制生物大分子溶液溫度過程中，當(dāng)生物大分子溶液處于溶液狀態(tài)或半凝固狀態(tài)時，向其注入藥物或生物活性因子。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)當(dāng)溫度控制為梯度升降溫時，交替次數(shù)不超過5次。
6.一種如權(quán)利要求1或2所述的生物活性材料應(yīng)用，其應(yīng)用于促進(jìn)和引導(dǎo)細(xì)胞定向增殖和/或組織再生。
7.如權(quán)利要求6所述的生物活性材料應(yīng)用，其特征在于，其應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)。
8.如權(quán)利要求6所述的生物活性材料應(yīng)用，其特征在于，其應(yīng)用于引導(dǎo)缺損組織重建。
9.一種胞外基質(zhì)仿生支架，其特征在于，包括如權(quán)利要求1或2所述的生物活性材料。
【文檔編號】A61L27/22GK104383598SQ201410733818
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】馬兆成 申請人:湖北賽羅生物材料有限責(zé)任公司