xCT抑制劑的用途
【專利摘要】一種xCT抑制劑的用途，它屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及xCT抑制劑的用途，用于制備治療活動性結(jié)核的藥物；所述xCT抑制劑優(yōu)選為柳氮磺胺吡啶。本發(fā)明xCT基因在結(jié)核病人中的表達水平明顯高于潛伏感染以及健康人群的表達水平，因此xCT基因可作為診斷結(jié)核的特異標志基因，使結(jié)核診斷更加準確、快速；同時試驗證明，xCT基因的特異抑制劑可以顯著減輕結(jié)核菌感染的小鼠體內(nèi)的細菌含量，因此其可作為治療活動性結(jié)核的新靶點。
【專利說明】xCT抑制劑的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及xCT抑制劑的用途。

【背景技術(shù)】：
[0002] 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（結(jié)核菌）感染引起的慢性傳染病。由于缺乏有效疫 苗，當前的結(jié)核病防治策略主要是早期發(fā)現(xiàn)，早期治療。藥物治療不僅是降低結(jié)核病病死率 的關(guān)鍵，而且是減少結(jié)核病播散的關(guān)鍵，因而是當前結(jié)核病防治實踐中最有效的手段。我 國目前使用世界衛(wèi)生組織推薦的短程化療方案，包括由一線抗癆藥物異煙肼（INH)，利福平 (RFP)，吡嗪酰胺（PZA)，鏈霉素（SM)，乙胺丁醇（EMB)等不同組合治療。近年來，奎諾酮類被 越來越多的應(yīng)用在結(jié)核患者的治療。盡管這些藥物的應(yīng)用挽救了超過2千萬結(jié)核患者的生 命，但當前結(jié)核病治療藥物顯然不能滿足患者和結(jié)核病防治的要求。由于結(jié)核菌耐藥的發(fā) 生，尤其是耐多藥和廣泛耐藥的發(fā)生，使結(jié)核病防治面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。據(jù)統(tǒng)計，在我國結(jié) 核病人中，耐多藥發(fā)病率為8. 32%，總計約為12萬人，總數(shù)量僅次于印度位居世界第二位， 廣泛耐藥發(fā)病率則為0. 68 %，總計大約為1萬人，其危害遠遠超過艾滋病。因此，控制結(jié)核 病亟需高效新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)。
[0003] xCT是一種具有12個跨膜結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，通過形成二硫鍵與4Fhc相結(jié)合， 共同組成谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運體（glutamate/cystineantiporter)又稱為XC-系統(tǒng)，是 1980年由Bannai和Kitamura在人成纖維細胞中首先發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)運L-胱氨酸和L-谷氨酸的 Na+非依賴性的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。Xc-轉(zhuǎn)運體是一種專一性、電中性的陰離子轉(zhuǎn)運體。生理狀態(tài)下 細胞外的胱氨酸以陰離子形式被轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，同時細胞內(nèi)的谷氨酸被釋放到細胞外，二 者的比例為1:1。胱氨酸在細胞內(nèi)迅速被還原成半胱氨酸，一部分參與胞內(nèi)重要自由基清 除劑谷胱甘肽的合成，另一部分則出胞氧化成胱氨酸，重新參與XC-系統(tǒng)循環(huán)。因此，細 胞內(nèi)的胱氨酸水平遠遠低于細胞外。XC-的活性可通過使用L-胱氨酸和L-谷氨酸作為底 物來進行定量分析，并且這種轉(zhuǎn)運過程是Cl-依賴性的和Na+非依賴性的[。由于谷氨酸、 胱氨酸和XC-的親和性相似，因此胱氨酸的攝取可被谷氨酸抑制，反過來也一樣。
[0004] XC-轉(zhuǎn)運體有兩個主要功能。一方面它介導細胞攝取胱氨酸，這對維持細胞內(nèi)GSH 水平尤為重要，因為GSH是保護細胞免受氧化應(yīng)激和其他化學物質(zhì)損傷所必需的。另一方 面，它可以維持細胞胱氨酸和半胱氨酸的氧化還原平衡。在細胞外的環(huán)境中，半胱氨酸迅 速被氧化成胱氨酸，因此胱氨酸在循環(huán)中尤其在培養(yǎng)基中是主要的氨基酸形式，而細胞內(nèi) 則以半胱氨酸為主。進入細胞內(nèi)的胱氨酸（cystine，CySS)被還原為半胱氨酸（cysteine， Cys)，參與蛋白質(zhì)、假黑色素（pheomelanin)和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH)的合 成。在細胞內(nèi)，GSH可被氧化為氧化型谷胱甘肽（oxidizedglutathione.GSSG)。GSH/ GSSG偶聯(lián)體與CySS/Cys偶聯(lián)體組成體內(nèi)主要的氧化還原勢（redoxstate)，參與活性氧素 (reactiveoxygenspecies，R0S)生成、基因表達、細胞增殖、和細胞凋亡等的調(diào)節(jié)。
[0005] XCT在多種腫瘤中高表達，通過促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重 要作用，臨床上，靶向xCT的示蹤劑在肝癌等腫瘤的PET-CT檢查被證明具有很好的應(yīng)用 前景。相比之下，有關(guān)xCT在感染性疾病發(fā)生中的作用知之甚少，目前還沒有關(guān)于xCT與結(jié) 核病發(fā)生關(guān)系的文獻報道。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供利用xCT作為活動性治療的新靶點，可用于治療 干預(yù)活動性結(jié)核。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明提供了一種XCT抑制劑的用途，用于制備治療活動性結(jié)核的藥物。
[0009] 所述xCT抑制劑優(yōu)選為柳氮磺胺吡啶。
[0010] 本發(fā)明XCT基因在結(jié)核病人中的表達水平明顯高于潛伏感染以及健康人群的表 達水平，因此xCT基因可作為診斷結(jié)核的特異標志基因，使結(jié)核診斷更加準確、快速；同時 試驗證明，xCT基因的特異抑制劑可以顯著減輕結(jié)核菌感染的小鼠體內(nèi)的細菌含量，因此其 可作為治療活動性結(jié)核的新靶點。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0011] 圖1是本發(fā)明實施例1的XCT基因在人外周血中差異表達的定量RT-PCR結(jié)果圖。
[0012] 圖2是本發(fā)明實施例2的xCT敲除小鼠在感染結(jié)核菌后，與野生型小鼠肺部菌量 的比較結(jié)果。
[0013] 圖3是本發(fā)明實施例2的XCT敲除小鼠在感染結(jié)核菌后，與野生型小鼠肺部病理 情況的結(jié)果。
[0014] 圖4是本發(fā)明實施例2的利用SASP治療結(jié)核小鼠后，與野生型小鼠肺部菌量的 比較結(jié)果。

【具體實施方式】：
[0015] 下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明進行進一步描述：
[0016] 實施例1
[0017] 本實施例將人群分為三組：結(jié)核病患者、潛伏感染人群和健康人群（各20例），通 過檢測每例外周血單個核細胞（PBMC)中xCT基因mRNA變化，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)核病患者中呈明 顯的上調(diào)表達趨勢。
[0018] 本實施例用定量RT-PCR方法檢測每例xCT基因的表達變化。具體步驟如下：
[0019] 步驟一：外周血單個核細胞（PBMC)懸液的制備
[0020] 在離心管中加入淋巴細胞分離液（FreseniusKabiNOrgeAs:LYS3773) 5ml;取 上述確診的結(jié)核病患者，潛伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝靜脈血各2ml與等量IM 的磷酸緩沖液（PBS)充分混勻得到混合液，用移液器將混合液沿管壁緩慢疊加于淋巴細胞 分離液液面上，保持清晰的界面，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；用吸管吸取中間云霧層置入另 一離心管后接著加入5倍體積的IMPBS，1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘洗滌細胞，棄上清，相同 條件重復(fù)洗滌細胞一次，接著加入含小牛血清體積百分比為10 %的的RPMI1640(Thermo scientific:SH30807. 01b)lml，重懸細胞，得到三組人群的各20例PBMC懸液；每例取 20y1的PBMC懸液于血球計數(shù)板上，計數(shù)細胞濃度。
[0021] 步驟二：RNA抽提
[0022] 采用Qiagene公司的RNeasyMiniKit(貨號74106)對上述得到的三組人群的各 20例PBMC懸液進行RNA抽提。具體操作是：取上述含IXIO6個細胞的PBMC懸液于去DNA酶 和RNA酶的離心管中，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清；在細胞沉淀中加入350yIBuffer RLT，充分混勻裂解；加入250yl無水乙醇，混勻，把液體轉(zhuǎn)移到RNeasy柱子中，8,OOOg離 心30秒，棄廢液；加入350ylBufferRWl以8,OOOg離心30秒，棄廢液；加入80ylDNase 溶液（10UIDNase+70yIBufferRDD)，柱上消化 15min，8,OOOg離心 30 秒，棄廢液；加 入 350ylBufferRWl，8,OOOg離心 30 秒，棄廢液；加入 500ylBufferRPE，8,OOOg離心 30秒，棄廢液；空甩，8,OOOg離心1分鐘；把柱子轉(zhuǎn)移到一個去DNA酶和RNA酶的I. 5ml離 心管，加入40y1無RNase的ddH20,10,OOOg離心1分鐘，收集三組人群的各20例的RNA 于-80 °C保存、待用。
[0023] 步驟三：反轉(zhuǎn)錄
[0024] 采用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（DRR047)，取步驟二得到的RNA0. 5yg進行反 轉(zhuǎn)錄，該試劑盒較傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒增加了去除基因組DNA的步驟，可在最大程度上保證 RNA的純度和擴增的特異性。
[0025] 分步如下：
[0026] (1)基因組DNA的去除反應(yīng) [0027]表 1
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一種xCT抑制劑的用途，其特征在于，用于制備治療活動性結(jié)核的藥物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的xCT抑制劑的用途，其特征在于，所述xCT抑制劑為柳氮磺胺 吡啶。
【文檔編號】A61K31/635GK104473939SQ201410736443
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】陳心春, 蔡毅, 楊倩婷, 周伯平 申請人:深圳市第三人民醫(yī)院