一種禽肺病毒病滅活疫苗的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種禽肺病毒病滅活疫苗的生產(chǎn)方法，包括如下步驟禽肺病毒繁殖、禽肺病毒滅活和滅活禽肺病毒乳化步驟；以Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒繁殖，方法簡(jiǎn)單可操作并且成本低，病毒收獲量和含量最高；病毒滅活徹底且不影響病毒的免疫性；乳化工藝即有水相，也有油相，水油混合的工藝不但節(jié)省時(shí)間和成本、便于操作、生產(chǎn)工序簡(jiǎn)化，并且制備的疫苗的性狀指標(biāo)均合格，并經(jīng)過上雞試驗(yàn)驗(yàn)證，其安全性、效力性均比國(guó)外產(chǎn)品更穩(wěn)定有效，產(chǎn)生抗體更快、抗體滴度更高、抗體有效期更長(zhǎng)。
CGMCC No.9001
20140324
【專利說明】_種禽肺病毒病滅活疫苗的生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種禽肺病毒（APV)病滅活疫苗的生產(chǎn)方法，屬于獸用生物制品技術(shù) 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽肺病毒（Avianpneumovims，APV)在上世紀(jì)70年代于南非首先分離到，此病在非 洲、北美、南美、中東、遠(yuǎn)東都有發(fā)生。禽肺病毒可以感染多種禽類，可導(dǎo)致感染動(dòng)物鼻氣管 炎、腫頭征、產(chǎn)蛋下降等疾病，給禽類養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的危害。近些年來，雞群對(duì)禽肺病毒的感 染愈來愈多，此病很容易引起繼發(fā)感染疫病，給禽業(yè)養(yǎng)殖戶帶來很多煩惱。
[0003] 美國(guó)于1989年分離到禽肺病毒，針對(duì)該病毒，應(yīng)對(duì)的疫苗只有國(guó)外的活疫苗。抗 原的滅活是關(guān)系到疫苗安全和有效的關(guān)鍵步驟之一，如果病毒滅活不徹底，可能存在潛在 的疫苗安全隱患，而過量滅活又會(huì)影響病毒的免疫原性，影響產(chǎn)品的免疫效果。目前禽類的 滅活疫苗在生產(chǎn)中許多還是采用雞胚、鴨胚等等材料的某一部分來繁殖，造價(jià)比較高，并且 疫苗效果不是特別好，而目前我國(guó)沒有一家生產(chǎn)針對(duì)此病的疫苗。
[0004] 因此，對(duì)于禽肺病毒滅火疫苗，必須在在生產(chǎn)工藝上做改進(jìn)，不但可以有效的增強(qiáng) 免疫效果，并且不存在潛在的安全隱患。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種禽肺病毒病滅 活疫苗的生產(chǎn)方法，工藝簡(jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間和成本，制備的疫苗安全性、效力性均比國(guó)外產(chǎn)品 更穩(wěn)定有效，產(chǎn)生抗體更快、抗體滴度更高、抗體有效期更長(zhǎng)。
[0006] 本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明首先提供一種禽肺病毒SHS/B病毒株，于2014年3月24日保藏于北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9001。
[0008] 一種禽肺病毒病滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0009] (1)禽肺病毒繁殖：按常規(guī)方法制備Vero單層細(xì)胞，培養(yǎng)液為MEM，將禽肺病毒 SHS/B病毒株接種于Vero細(xì)胞上，接種量為培養(yǎng)液體積的0. 5-1. 5%;將接種病毒的細(xì)胞放 置于37°C、CO2培養(yǎng)箱中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為7-13轉(zhuǎn)/小時(shí)；每日觀察2-4次，培養(yǎng)至60-90% 以上病毒發(fā)生病變時(shí)收獲病毒液；
[0010] (2)禽肺病毒滅活：向步驟1獲得的病毒液中加入甲醛溶液，至甲醛溶液為總抗原 量體積的〇. 1-0. 05%，于37°C下、在150r/min速度搖床中滅活，滅活時(shí)間為10-24h ;
[0011] (3)滅活禽肺病毒乳化：將步驟（2)的滅活禽肺病毒抗原與吐溫-80按95:5體積 的比例混勻后制備成水相，將白油、司本-80和硬脂酸鋁按95:5:1的體積比例混勻后制備 成油相；取油相1-3份于乳化罐中于2500-4000r/min條件下攪拌3-5min，再向乳化罐中加 入1份水相，于2500-4000r/min條件下乳化20-50min后得禽肺病毒病疫苗，分裝密封保 存。
[0012] 優(yōu)選的，步驟1中所述的病毒接種量為培養(yǎng)液重量的I %，轉(zhuǎn)速為9-11轉(zhuǎn)/小時(shí)， 培養(yǎng)至70-80%以上病毒發(fā)生病變時(shí)收獲病毒液。
[0013] 優(yōu)選的，步驟2中所述的濃度為0. 1%，滅活時(shí)間為16h。
[0014] 優(yōu)選的，步驟3中所述的水相和油相的重量比為1 :2。
[0015] 優(yōu)選的，步驟3中所述的攪拌和乳化轉(zhuǎn)速為3500r/min，乳化時(shí)間為30-40min。
[0016] 本發(fā)明還提供一種禽肺病毒病滅活疫苗，是按照上述方法制備而成的。
[0017] 本發(fā)明疫苗制備方法，以Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒繁殖，方法簡(jiǎn)單可操作并且成本低， 病毒收獲量和含量最高；病毒滅活徹底且不影響病毒的免疫性；乳化工藝節(jié)省時(shí)間和成 本、便于操作、生產(chǎn)工序簡(jiǎn)化，檢產(chǎn)品的性狀指標(biāo)均合格，并經(jīng)過上雞試驗(yàn)驗(yàn)證，其安全性、 效力性均比國(guó)外產(chǎn)品更穩(wěn)定有效，產(chǎn)生抗體更快、抗體滴度更高、抗體有效期更長(zhǎng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1 :本發(fā)明禽肺病毒病滅活疫苗的生產(chǎn)方法的工藝流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)禽肺病毒病滅活疫苗的生產(chǎn)方法進(jìn)行詳細(xì)的描述：
[0020] 實(shí)施例1 :
[0021] 禽肺病毒SHS/B病毒株來源于山東省某養(yǎng)雞場(chǎng)，由青島易邦生物工程有限公司分 離鑒定，已于2014年3月24日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微 生物研宄所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9001， 研宄禽肺病毒繁殖的最佳條件：
[0022] (1)按常規(guī)方法制備Vero單層細(xì)胞，培養(yǎng)液為MEM，將禽肺病毒SHS/B病毒株接種 于Vero細(xì)胞上，接種量為培養(yǎng)液體積的0. 5%、1 %、1. 5% ;將接種病毒的細(xì)胞放置于37°C、 CO2培養(yǎng)箱中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為10轉(zhuǎn)/小時(shí)；每日觀察2-4次，培養(yǎng)至80%以上病毒發(fā)生病 變時(shí)收獲病毒液，并測(cè)定病毒含量，結(jié)果如表1所示：
[0023] 表1 :不同接種量對(duì)病毒含量的影響
[0024]

【權(quán)利要求】
1. 一種禽肺病毒SHS/B病毒株，于2014年3月24日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏編號(hào)為 CGMCC No. 9001。
2. -種禽肺病毒病滅活疫苗，其特征在于，包括有經(jīng)滅活的禽肺病毒抗原、佐劑和油 相。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的禽肺病毒病滅活疫苗，其特征在于，所述的佐劑為吐溫-80， 滅活禽肺病毒抗原與吐溫-80的體積比為95:5,二者混勻后制備成水相。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的禽肺病毒病滅活疫苗，其特征在于，所述的油相包括白油、司 本-80和硬脂酸鋁，三者的體積比例為95:5:1，三者混勻后制備成油相。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述禽肺病毒病滅活疫苗，其特征在于，所述的水相與 油相的體積比為1:1-3。
6. 權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的禽肺病毒病滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如 下步驟： (1) 禽肺病毒繁殖：按常規(guī)方法制備Vero單層細(xì)胞，培養(yǎng)液為MEM，將禽肺病毒SHS/B 病毒株接種于Vero細(xì)胞上，接種量為培養(yǎng)液體積量的0. 5-1. 5% ;將接種病毒的細(xì)胞放置 于37°C的C02培養(yǎng)箱中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為7-13轉(zhuǎn)/小時(shí)；每日觀察2-4次，培養(yǎng)至60-90% 以上病毒發(fā)生病變時(shí)收獲病毒液； (2) 禽肺病毒滅活：向步驟1獲得的病毒液中加入甲醛溶液，至甲醛溶液為總抗原量體 積的0. 1-0. 05%，于37°C下、在150r/min速度搖床中滅活，滅活時(shí)間為10-24h ; (3) 滅活禽肺病毒乳化：將步驟（2)的滅活禽肺病毒抗原與吐溫-80按95:5的體積比 例混勻后制備成水相，將白油、司本-80和硬脂酸鋁按95:5:1的體積比例混勻后制備成油 相；取油相1-3份于乳化罐中于2500-4000r/min條件下攪拌3-5min，再向乳化罐中加入1 份水相，于2500-4000r/min條件下乳化20-50min后得禽肺病毒病疫苗，分裝密封保存。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟1中所述的病毒接種量為培養(yǎng)液重量 的1%，轉(zhuǎn)速為9-11轉(zhuǎn)/小時(shí)，培養(yǎng)至70-80%以上病毒發(fā)生病變時(shí)收獲病毒液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2中所述的濃度為0. 1 %，滅活時(shí)間 為 16h〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3中所述的水相和油相的重量比為 1:2〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3中所述的攪拌和乳化轉(zhuǎn)速為 3500r/min，乳化時(shí)間為 30-40min。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK104491856SQ201410742349
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月7日
【發(fā)明者】李陸梅, 宮曉, 劉新文, 程增青, 徐保娟, 朱艷梅, 范根成, 鄒敏, 郭偉偉, 楚電峰, 杜元釗 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司