一種ca16病毒感染沙鼠的動物模型及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CA16病毒感染沙鼠的動物模型及評價疫苗的應用，所述的方法為：將CA16病毒腹腔注射感染沙鼠，每只沙鼠的注射量為1.0×103.0-1.0×105.0TCID50，獲得感染CA16病毒的沙鼠；本發(fā)明模型極大模擬了臨床病人感染CA16病毒后在神經(jīng)系統(tǒng)方面出現(xiàn)的病變，如腦干和脊髓等組織，而已有的新生鼠模型則沒有；結(jié)合已有的EV71病毒感染沙鼠模型，可以做為評價EV71/CA16雙聯(lián)疫苗保護效果的動物模型。
【專利說明】一種CA16病毒感染沙鼠的動物模型及應用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動物模型的構(gòu)建方法，特別涉及一種CA16病毒感染沙鼠的動物 模型及其評價疫苗的應用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 柯薩奇病毒A組16型（Coxsackievirus A16, CA16)屬于小核糖核酸病毒科， 腸道病毒屬成員，1952年在南非首次被分離出來，是引起手足口?。℉FMD)的主要病原 體之一。CA16感染可以導致5歲以下嬰幼兒出現(xiàn)手、足、口部皰瘆、咽峽炎等癥狀，少數(shù) 患者可以出現(xiàn)心肌炎、無菌性腦膜炎等多種并發(fā)癥。CA16常與另外一種腸道病毒71型 (Enterovirus71, EV71)交替或共同流行，自20世紀90年代以來導致了中國大陸、中國臺 灣和其他亞太地區(qū)的多次手足口病爆發(fā)流行，2008年后在亞太地區(qū)以外的多個國家也出現(xiàn) 了高強度的流行，以往認為HFMD中嚴重與死亡病例主要由于EV71病毒感染所致，忽略了對 CA16的研宄。而現(xiàn)在對CA16感染導致的重癥和死亡病例在美國、法國、日本、中國臺灣和中 國大陸等地區(qū)均有報道，并且CA16還可與EV71發(fā)生遺傳物質(zhì)重組，加大了重癥HFMD的防 控難度。
[0003] 我國研發(fā)的EV71疫苗已經(jīng)進入三期臨床階段，其中多種EV71感染動物模型（乳 鼠、食蟹猴和獼猴等）的建立與不斷完善，極大促進了 EV71病毒的機理研宄及EV71疫苗的 順利研發(fā)。國際上對CA16疫苗的研發(fā)進展相對緩慢，目前已報道的CA16感染動物模型只 有一種新生鼠模型，但新生鼠對CA16病毒的敏感期很短，只有日齡小于7天的新生鼠才對 CA16病毒敏感，這不僅加大了實驗的操作難度，同時由于許多實驗如疫苗長期保護效果評 價等持續(xù)時間往往不止一周，制約了新生鼠在理論研宄和疫苗評價等產(chǎn)業(yè)化方面的應用， 而非人靈長類動物模型如獼猴等由于成本較高，即使開發(fā)成功也不利于大規(guī)模的應用研 宄。因此開發(fā)一種經(jīng)濟、實用和有效的動物模型，不僅可以更加深入的研宄CA16病毒，闡明 CA16病毒的感染途徑和致病機理，同時也將加快CA16疫苗及EV71/CA16雙價疫苗的研發(fā)步 伐，為解決我國HFMD這一嚴重的公共衛(wèi)生問題打下基礎(chǔ)。
[0004] 長爪沙鼠 （Meriones unguiculatus)又稱長爪沙土鼠，屬于倉鼠科、沙鼠屬，大小 介于大白鼠和小白鼠之間，易飼養(yǎng)和繁殖，其作為實驗動物在醫(yī)學領(lǐng)域的應用已有30多年 歷史，是研宄腦梗塞，癲癇和絲蟲病等疾病的理想動物模型。 申請人:前期利用沙鼠動物模型 成功研發(fā)出了我國流行性出血熱疫苗，證明這是一種穩(wěn)定的、適用于疫苗免疫效果評價的 動物模型。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有CA16感染動物模型只有新生小鼠模型的不足，本發(fā)明提供了一種對 CA16病毒敏感期長達21天，模擬CA16感染臨床病人神經(jīng)性并發(fā)癥的沙鼠動物模型及其建 立方法以及該動物模型在評價疫苗中的應用。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種CA16病毒感染沙鼠的動物模型，所述動物模型按如下方法構(gòu)建： 將CA16病毒腹腔注射感染沙鼠，每只沙鼠的注射量為I. OX IO3 tl-L OX IO5 tlTCID5ci，獲得感 染CA16病毒的沙鼠。本發(fā)明CA16病毒感染沙鼠的動物模型驗證方法為：取感染CA16病毒 沙鼠的組織進行病毒滴度測定、PCR檢測組織RNA，并進行病理檢測，當腦干和骨髓的病毒 滴度為IX l〇5_°TCID5(l/ml以上，組織切片中檢測到細胞病變（如：細胞炎癥與壞死），或者 PCR檢測組織Ct值為30以下，CA16病毒感染沙鼠動物模型構(gòu)建完成。沙鼠在注射CA16病 毒2-3天后出現(xiàn)肢體癱瘓或昏迷癥狀，4-5天后死亡。
[0008] 進一步，步驟⑴中CA16病毒液注射量為0.01-0. 1ml，滴度為 I. OXlO5tl-L OXKfcVml TCID5tl，使每只沙鼠的 CA16 病毒接種量為 1X105°TCID5Q。CA16 病毒的制備方法為：將I X l〇7_°TCID5(lCA16病毒接種于含有50ml MEM培養(yǎng)液（購自Gbico 公司）的Vero細胞培養(yǎng)瓶中，置于37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3-5天至Vero細胞出現(xiàn)明顯的 細胞病變后（CPE)，收集上清培養(yǎng)液，放入-70 °C冰箱中反復凍融3次，隨后4000rpm離 心lOmin，取上清接種于Vero細胞中，重復傳3代之后，離心收集上清，即為制備滴度為 I. O X ΙΟ6· 5-1· O X 107· 7Vml 的 CA16 病毒液。
[0009] 進一步，步驟（1)中沙鼠為1-21日齡沙鼠，優(yōu)選7-21日齡沙鼠。
[0010] 本發(fā)明還涉及一種所述CA16病毒感染沙鼠的動物模型的應用，所述應用包括以 下步驟：（1)CA16全病毒滅活疫苗的制備：在滴度1.0X 106-1.0X 107/ml CA16病毒液中 加入體積比為1:2500的福爾馬林，37 °C滅活疫苗4天，隨后4 °C，6000rpm離心30分鐘 后取上清，將上清通過IOOK的超濾系統(tǒng)濃縮至原體積的1/20,濃縮液通過S印harose 6 色譜柱分離純化，得到4000-8000U的CA16全病毒滅活疫苗；所述CA16病毒液的制備方 法為：將1X10 7_°TCID5(ICA16病毒接種于含有50ml MEM培養(yǎng)液的Vero細胞培養(yǎng)瓶中，置 于37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3-5天，收集上清培養(yǎng)液，放入-70°C冰箱中反復凍融3次，隨后 4000rpm離心lOmin，取上清接種于Vero細胞中，重復傳3代之后，離心收集上清，即為滴度 I. 0 X ΙΟ6· 5-1· 0 X 107· 7Vml 的 CA16 病毒液；
[0011] (2)CA16全病毒滅活疫苗保護效果的評價：將步驟（1)所得CA16全病毒滅活疫 苗用MEM培養(yǎng)基稀釋劑量至2. 5?40U/0. lml，在沙鼠培養(yǎng)至第7、14天各注射2. 5?40U CA16全病毒滅活疫苗，培養(yǎng)至第21天時，腹腔接種I X 103_°TCID5(ICA16病毒液，觀察沙鼠是 否出現(xiàn)肢體癱瘓，昏迷甚至死亡等臨床特征，完成CA16病毒感染沙鼠的動物模型對疫苗保 護效果的評價。
[0012] 本發(fā)明所述對感染CA16病毒沙鼠進行組織病毒滴度測定、PCR檢測組織RNA，并進 行病理檢測的方法均為本領(lǐng)域公知的常規(guī)操作，21日齡沙鼠對CA16病毒敏感，表明21日齡 以下沙鼠對CA16病毒均敏感。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明在國際上首次構(gòu)建了 CA16病毒感染的沙鼠動物模型，其對CA16病毒的敏感期長達21天，優(yōu)于先前敏感期只有7 天的新生鼠模型，可用于CA16疫苗保護效果尤其是長期保護效果的評價；該模型極大模擬 了臨床病人感染CA16病毒后在神經(jīng)系統(tǒng)方面出現(xiàn)的病變，如腦干和脊髓等組織，而已有的 新生鼠模型則沒有；結(jié)合已有的EV71病毒感染沙鼠模型，可以做為評價EV71/CA16雙聯(lián)疫 苗保護效果的動物模型。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為長爪沙鼠接種CA16病毒后的臨床癥狀;A :正常沙鼠；B:攻毒后沙鼠，后肢 出現(xiàn)癱瘓。
[0015] 圖2為7、14和21日齡沙鼠分別接種CA16病毒（IXIO5TCID 5q)后的存活率（A)及 臨床表現(xiàn)（B)。
[0016] 圖3為21天沙鼠接種IX 105_°TCID5QCA16后，病毒在各組織中的增殖情況。A、感 染后2天；B、感染后3天；C、感染后5天。
[0017] 圖4為21天沙鼠腹腔接種I X 105_°TCID5QCA16病毒后各組織qRT-PCR結(jié)果。
[0018] 圖5為21天沙鼠腹腔接種I X 105_°TCID5QCA16病毒各組織病理變化：B、C為脊髓 小膠質(zhì)細胞增生及噬神經(jīng)現(xiàn)象；E腦干噬神經(jīng)現(xiàn)象；G骨胳肌細胞中淋巴細胞增生及肌纖維 廣泛破壞；A、D、F為正常沙鼠組織。
[0019] 圖6為CA16疫苗對沙鼠的保護作用。
[0020] 圖7為免疫流程圖。 (五）

【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0022] 實施例1沙鼠感染實驗
[0023] CA16病毒液：CA16病毒菌種（由杭州市第六人民醫(yī)院提供），將 IX 107_°TCID5QCA16病毒接種于含有50ml MEM (購自Gbico公司）培養(yǎng)液的Vero細胞培養(yǎng) 瓶中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，培養(yǎng)至Vero細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變后（CPE)，收集 上清培養(yǎng)液，放入-7〇°C冰箱中反復凍融3次，隨后4000rpm離心lOmin，取上清接種于Vero 細胞中，重復傳3代之后，離心收集上清，即為制備滴度為I. O X 106_5-l. O X 107_ 7Vml的CA16 病毒液。
[0024] 選擇7日、14日和21日齡沙鼠各16只，分實驗組和對照組兩組，沙鼠腹腔注射 CA16病毒液，接種量為I. OX 105_ciTCID5c/只，正常飼養(yǎng)，觀察沙鼠狀態(tài)，從圖1可以看出接種 病毒后沙鼠毛發(fā)缺少光澤，形體消瘦，后肢出現(xiàn)癱瘓現(xiàn)象，同時計算存活率，存活率=活沙 鼠數(shù)/總沙鼠數(shù)X 100%，并根據(jù)其臨床表現(xiàn)給其打分（見下表1)。
[0025] 表1沙鼠臨床表現(xiàn)打分
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種CA16病毒感染沙鼠的動物模型，其特征在于所述的動物模型按如下方法構(gòu)建： 將CA16病毒腹腔注射感染沙鼠，每只沙鼠的注射量為1. OX 103-1. OX 105TCID5Q，獲得感染 CA16病毒的沙鼠。
2. 如權(quán)利要求1所述CA16病毒感染沙鼠的動物模型，其特征在于CA16病毒注射量為 每只小鼠 1. 〇X105TCID5Q。
3. 如權(quán)利要求1所述CA16病毒感染沙鼠的動物模型，其特征在于沙鼠為1-21日齡沙 鼠。
4. 一種權(quán)利要求1所述CA16病毒感染沙鼠的動物模型的應用。
5. 如權(quán)利要求4所述CA16病毒感染沙鼠的動物模型的應用，其特征在于所述的應用 包括以下步驟：（1)CA16全病毒滅活疫苗的制備：在滴度1.0X 106-1.0X 107/ml CA16病毒 液中加入體積比為1:2500的福爾馬林，37°C滅活疫苗4天，隨后4°C，6000rpm離心30分 鐘后取上清，將上清通過100K的超濾系統(tǒng)濃縮至原體積的1/20,濃縮液通過S印harose 6色譜柱分離純化，得到4000-8000U的CA16全病毒滅活疫苗；所述CA16病毒液的制備 方法為：將1X107_°TCID5(ICA16病毒接種于含有50ml MEM培養(yǎng)液的Vero細胞培養(yǎng)瓶中， 置于37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3-5天，收集上清培養(yǎng)液，放入-70°C冰箱中反復凍融3次，隨后 4000rpm離心lOmin，取上清接種于Vero細胞中，重復傳3代之后，離心收集上清，即為滴度 1. 0 X 106_ 5-1. 0 X 107_ 75/ml 的 CA16 病毒液； (2)CA16全病毒滅活疫苗保護效果的評價：將步驟（1)所得CA16全病毒滅活疫苗用 MEM培養(yǎng)基稀釋至2. 5?40U/0. lml，在沙鼠培養(yǎng)至第7、14天各注射2. 5?40U的CA16全 病毒滅活疫苗，培養(yǎng)至第21天時，腹腔接種1 X 103TCID5(ICA16病毒液，觀察沙鼠是否出現(xiàn)肢 體癱瘓，昏迷甚至死亡，完成CA16病毒感染沙鼠的動物模型對疫苗保護效果的評價。
【文檔編號】A61P31/14GK104490937SQ201410749415
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】朱函坪, 孫一晟, 陳直平, 姚蘋蘋, 徐芳, 謝榮輝, 楊章女, 朱智勇, 周小龍, 盧杭景 申請人:浙江省疾病預防控制中心