一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子可注射原位水凝膠、制備及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠、制備及其應(yīng)用。它是在透明質(zhì)酸和殼聚糖鹽酸鹽的水溶液體系中加入EDC和NHS，在酸性條件下使透明質(zhì)酸在EDC/NHS作用下生成HA-NHS-活性酯中間體后，再加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子得到的。該水凝膠具有pH敏感特性，能在人體生理?xiàng)l件下完成溶液-凝膠的轉(zhuǎn)變過(guò)程，其注射到神經(jīng)組織后，會(huì)在神經(jīng)受損部位受體內(nèi)pH的作用下原位固化，避免外科手術(shù)的創(chuàng)傷性。之后利用該水凝膠的環(huán)境敏感特性，可以實(shí)現(xiàn)NGF在體內(nèi)緩慢釋放，有效解決NGF因半衰期短、擴(kuò)散或降解過(guò)快所造成的活性降低、突釋等問(wèn)題，保持NGF較好的生物活性，促進(jìn)神經(jīng)軸突延伸和髓鞘化，從而達(dá)到修復(fù)神經(jīng)的目的。
【專利說(shuō)明】—種神經(jīng)生長(zhǎng)因子可注射原位水凝膠、制備及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于神經(jīng)組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子可注射原位水凝膠、制備及其在神經(jīng)修復(fù)方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]周?chē)窠?jīng)損傷是臨床上的一種常見(jiàn)病癥。目前，臨床上一般采用神經(jīng)吻合、自體神經(jīng)移植、同種異體神經(jīng)移植、自體非神經(jīng)組織移植、生物材料替代等方法來(lái)進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)。其中，將生物材料加工成管狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管是目前研究的重點(diǎn)。但是當(dāng)遇到長(zhǎng)距離，粗大神經(jīng)的缺損時(shí)，這類單純由生物材料制成的導(dǎo)管由于缺乏生物活性物質(zhì)等微環(huán)境物質(zhì)的支持，取得的修復(fù)效果非常有限。
[0003]神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor, NGF)是具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突觸生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周?chē)窠?jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。然而，NGF生物半衰期短，不能長(zhǎng)期有效促進(jìn)神經(jīng)再生；并且NGF易遭受化學(xué)結(jié)構(gòu)破壞或被其他化學(xué)物質(zhì)修飾而失去生物活性，使其使用受到限制。所以，設(shè)計(jì)一種NGF緩控釋體系以實(shí)現(xiàn)NGF在修復(fù)神經(jīng)的過(guò)程中穩(wěn)定持續(xù)釋放，在促進(jìn)神經(jīng)軸突延伸和髓鞘化的同時(shí)，持續(xù)發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)，促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù)，已成為周?chē)窠?jīng)修復(fù)的研究熱點(diǎn)。
[0004]近年來(lái)，隨著智能水凝膠的發(fā)展，可注射原位水凝膠作為一種新型水凝膠成為水凝膠研究中的熱點(diǎn)之一。所謂可注射原位水凝膠是指注射前為流動(dòng)的液體，通過(guò)注射器注入皮下組織或肌肉組織后，在注射部位原位凝膠化，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度的水凝膠。由于其形成機(jī)制是利用高分子材料對(duì)外界剌激(比如PH值、溫度、離子濃度等)的響應(yīng)，使聚合物在生理?xiàng)l件下發(fā)生狀態(tài)或構(gòu)象的變化，完成溶液向凝膠的轉(zhuǎn)化過(guò)程。因此，這類水凝膠在生理?xiàng)l件下較強(qiáng)的實(shí)用性受到了研究者的廣泛關(guān)注。在組織工程領(lǐng)域，可注射原位凝膠類材料也適應(yīng)了微創(chuàng)傷技術(shù)發(fā)展的要求，具有微創(chuàng)傷修復(fù)組織缺損或畸形、組織損傷小、不破壞修復(fù)區(qū)血供、操作簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
[0005]一種理想的可注射性原位水凝膠材料，常需具備以下幾個(gè)條件:(I)注射前能保持低粘度溶膠狀，易于注射:(2)注射后凝膠化立即發(fā)生，并在短時(shí)間內(nèi)完成；(3)凝膠可生物降解或可逐漸溶解，降解產(chǎn)物是可生物吸收的；(4)凝膠自身(包括促使原位凝膠化的添加劑)及其降解產(chǎn)物都具有良好的生物相容性；(5)對(duì)于藥物緩釋體系需滿足所載藥物呈現(xiàn)一定的緩釋規(guī)律，而作為組織工程支架要求有良好的細(xì)胞粘附能力等。
[0006]殼聚糖(chitosan，CS)是一種天然的堿性多糖，具有低毒性、良好的生物相容性和生物降解性的特點(diǎn)。此外，殼聚糖還具有抗血栓、促進(jìn)傷口愈合及軟、硬組織的重建等生物活性，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。殼聚糖作為NGF的載體或直接用于周?chē)窠?jīng)缺損的修復(fù)，均取得了一定的成功。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)是一種天然聚陰離子聚合物，同時(shí)也是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，廣泛存在于人體的大部分器官和組織中，對(duì)細(xì)胞增殖、分化以及穩(wěn)定細(xì)胞與組織的表型等，均有重要作用。目前已有大量研究證明HA凝膠對(duì)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。同時(shí)，高濃度、高分子量的HA還具有抑制淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的遷移，減輕炎癥反應(yīng)，形成免疫屏障的作用，具有很高的利用價(jià)值。
[0007]雖然將CS和HA用于組織工程有很多優(yōu)勢(shì)，但將它們單獨(dú)制成的水凝膠存在力學(xué)強(qiáng)度較低，在體內(nèi)易出現(xiàn)坍塌，也易出現(xiàn)炎癥反應(yīng)等缺點(diǎn)。所以，CS或HA水凝膠單獨(dú)作為神經(jīng)修復(fù)用支架材料存在很大的不足。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠、制備及其應(yīng)用。該水凝膠具有pH敏感特性，能在人體生理?xiàng)l件下完成溶液-凝膠的轉(zhuǎn)變過(guò)程，其注射到神經(jīng)組織后，會(huì)在神經(jīng)受損部位受體內(nèi)pH的作用下原位固化，避免外科手術(shù)的創(chuàng)傷性。之后利用該水凝膠的環(huán)境敏感特性，可以實(shí)現(xiàn)NGF在體內(nèi)的緩慢釋放，有效解決NGF因半衰期短、擴(kuò)散或降解過(guò)快所造成的活性降低、突釋等問(wèn)題，保持NGF較好的生物活性，促進(jìn)神經(jīng)軸突延伸和髓鞘化，從而達(dá)到修復(fù)神經(jīng)的目的。
[0009]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0010]一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠，其特征在于:它是在透明質(zhì)酸(HA)和殼聚糖鹽酸鹽的水溶液體系中加入EDC和NHS，在酸性條件下使透明質(zhì)酸在EDC/NHS作用下生成HA-NHS-活性酯中間體后，再加入NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)而得到的。
[0011]按上述方案，所述的酸性條件為調(diào)節(jié)體系pH為4.7-6.0。
[0012]按上述方案，所述殼聚糖鹽酸鹽和透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為0.5-2.5:1。
[0013]按上述方案，所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠在人體生理環(huán)境下通過(guò)HA-NHS-活性酯中間體與殼聚糖鹽酸鹽中的NH2基團(tuán)進(jìn)行酰胺反應(yīng)完全轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。
[0014]按上述方案，所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠轉(zhuǎn)變得到的凝膠的孔徑范圍為0.5-10 微米。
[0015]一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠的制備方法，步驟如下:
[0016](1)在透明質(zhì)酸(HA)的水溶液中逐漸加入殼聚糖鹽酸鹽，磁力攪拌使其混合均勻后將pH調(diào)至4.7-6.0，然后稱取一定質(zhì)量的EDC和NHS于上述反應(yīng)液，使體系中EDC和NHS的摩爾質(zhì)量分別為10?70mM和10?70mM，反應(yīng)1?6小時(shí)后即得HA-CS溶膠體系；
[0017](2)在步驟⑴中制得的HA-CS溶膠體系中加入NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)，攪拌使其混合均勻即得。
[0018]按上述方案，所述步驟(1)的攪拌溫度為0_4°C。
[0019]按上述方案，所述步驟(2)的攪拌溫度為0_4°C。
[0020]按上述方案，所述步驟(2)中每毫升HA-CS溶膠體系所需的NGF的用量為25_75ng。
[0021]上述神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠在神經(jīng)修復(fù)方面的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明通過(guò)選擇類細(xì)胞外基質(zhì)成分殼聚糖(CS)鹽酸鹽和細(xì)胞外基質(zhì)成分透明質(zhì)酸(HA)，利用HA上的修飾基團(tuán)-C00H以及CS上的修飾基團(tuán)-NH2，選擇無(wú)細(xì)胞毒性且組織相容性好的酰胺交聯(lián)劑1-乙基-3-(3- 二甲氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)完成原位水凝膠的制備過(guò)程。首先，在酸性條件下，EDC/NHS與HA上的修飾基團(tuán)-C00H合成HA-NHS-活性酯中間體，之后當(dāng)pH值逐漸升高并到達(dá)人體生理pH時(shí)(7.4左右)，隨著HA-NHS-活性酯中間體與CS鹽酸鹽上的修飾基團(tuán)氨基酰胺反應(yīng)的完成，即可響應(yīng)生理pH實(shí)現(xiàn)溶液-凝膠轉(zhuǎn)變。具體機(jī)理見(jiàn)圖1。
[0023]本發(fā)明的有益效果:
[0024]1.本發(fā)明根據(jù)“仿生”的原理，制備出的能在人體生理環(huán)境(pH7.4左右)的條件下完成溶液-凝膠的轉(zhuǎn)變過(guò)程可注射的HA-CS原位水凝膠，改善了單獨(dú)運(yùn)用HA水凝膠或者CS水凝膠所具有的力學(xué)強(qiáng)度較低，穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)，形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)功能的模擬，為神經(jīng)再生提供良好“微環(huán)境”。將該水凝膠應(yīng)用于周?chē)窠?jīng)組織，一方面可以充分發(fā)揮其具有的原位凝膠化并緩慢釋放NGF的優(yōu)勢(shì)，另一方面也可以充分填充于復(fù)雜形狀缺損的神經(jīng)組織，避免手術(shù)的創(chuàng)傷性，減少患者的痛苦、加速愈合。為周?chē)窠?jīng)修復(fù)用材料提供新思路。目前，將可注射原位水凝膠作為生物載體攜帶神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF治療周?chē)窠?jīng)修復(fù)的研究至今尚未見(jiàn)到報(bào)道。具體地，本發(fā)明提供的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠具有以下特性:
[0025]1)凝膠材料組成的“仿生”性
[0026]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠充分發(fā)揮了 HA和CS材料本身的優(yōu)點(diǎn)、形成了優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有望改善單獨(dú)運(yùn)用HA水凝膠或者CS水凝膠所具有的力學(xué)強(qiáng)度較低，穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)。此外，該緩控釋體系在結(jié)構(gòu)組成上實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)功能的模擬，以期具有良好的生物相容性。
[0027]2)凝膠系統(tǒng)形成的智能性
[0028]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠是在人體生理pH的誘導(dǎo)下完成的溶液-凝膠轉(zhuǎn)變過(guò)程，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。在合成過(guò)程中用到的EDC和NHS也是無(wú)細(xì)胞毒性且組織相容性好的交聯(lián)劑，減少了體系的毒副作用，有效避免了 NGF易遭受化學(xué)結(jié)構(gòu)破壞或被其他化學(xué)物質(zhì)修飾而失去生物活性的缺點(diǎn)。
[0029]3) NGF釋放的控釋性
[0030]利用水凝膠響應(yīng)于體內(nèi)pH值發(fā)生交聯(lián)、溶脹、降解的特點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)凝膠的結(jié)構(gòu)參數(shù)、孔隙大小，實(shí)現(xiàn)了 NGF在體內(nèi)的緩慢釋放?？梢杂行У慕鉀QNGF半衰期短，避免因擴(kuò)散過(guò)快和降解過(guò)快造成的活性降低、突釋等問(wèn)題，提高NGF在體內(nèi)的利用率和安全性。
[0031]4)給藥途徑的便捷性
[0032]通過(guò)將溶液注射到體內(nèi)，原位形成凝膠，這就為NGF提供了一種很便捷的給藥途徑。從移植的觀點(diǎn)看，目前臨床上常用的神經(jīng)導(dǎo)管必須填滿受損部位，這就需知道受損部位的幾何尺寸，然后按照該幾何尺寸在體外進(jìn)行支架的制作，且需進(jìn)行外科操作。相比之下，通過(guò)注射器直接把流動(dòng)態(tài)的水凝膠送入體內(nèi)，使其通過(guò)體內(nèi)pH值的感應(yīng)形成凝膠，給藥途徑非常方便。
[0033]5)神經(jīng)修復(fù)的微創(chuàng)性
[0034]和利用生物材料制成神經(jīng)導(dǎo)管來(lái)修復(fù)神經(jīng)相比，將HA-CS-NGF可注射凝膠應(yīng)用于周?chē)窠?jīng)組織，是通過(guò)注射的方法將具有一定流動(dòng)性的生物材料注射到體內(nèi)原位形成水凝膠，不需要手術(shù)的方法植入，避免了手術(shù)的創(chuàng)傷性，滿足了微創(chuàng)傷技術(shù)發(fā)展的要求，有利于減少患者的痛苦，加速愈合。
[0035]6)支架形狀的可塑性
[0036]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠可以很容易充滿整個(gè)具有不規(guī)則形狀的神經(jīng)缺損部位，以達(dá)到支架和周?chē)軗p神經(jīng)組織密切接觸的目的。避免了預(yù)塑型支架材料難以與修復(fù)部位吻合的缺陷，有助于更好的修復(fù)不規(guī)則和復(fù)雜的神經(jīng)缺損，為周?chē)窠?jīng)修復(fù)用材料提供新思路。
[0037]7)系統(tǒng)制備的簡(jiǎn)易性
[0038]本發(fā)明提供的制備方法，方法簡(jiǎn)便，實(shí)施條件溫和，成本較低，環(huán)境污染少，對(duì)組織工程化治療神經(jīng)修復(fù)的臨床開(kāi)展具有重要意義。
[0039]8)系統(tǒng)適用的廣泛性
[0040]2.本發(fā)明提供神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠還可用于其它不同生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)藥物以及基因等，從而進(jìn)一步擴(kuò)大其運(yùn)用范圍，具有廣泛適用性。
[0041]3.本發(fā)明提供的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠制備方法簡(jiǎn)單，易于實(shí)施。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1:HA_CS可注射原位水凝膠的形成原理示意圖。
[0043]圖中，(a) HA與EDC/NHS在酸性條件下生成HA-NHS活性酯中間體；(b) HA-NHS活性酯中間體與CS在人體生理?xiàng)l件下生成水凝膠；照片分別為HA-CS溶膠和HA-CS水凝膠。
[0044]圖2:實(shí)施例1的HA-CS水凝膠的紅外光譜圖。
[0045]圖3:實(shí)施例1的HA-CS水凝膠的SEM圖。
[0046]圖4 =HA-CS-NGF原位水凝膠的體外失重率曲線圖。
[0047]圖5:NGF的體外累計(jì)釋放率曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0048]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容。但是應(yīng)當(dāng)理解，下面的實(shí)施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)以任何方式當(dāng)作對(duì)上述本發(fā)明總體的限制。
[0049]實(shí)施例1
[0050]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的制備
[0051](I)在4°C冰浴的條件下，將0.1g的HA加入到1ml去離子水中，磁力攪拌50min使其充分溶解，再逐漸加入0.1gCS鹽酸鹽，磁力攪拌Ih使其混合均勻后將pH調(diào)至4.7，然后稱取一定質(zhì)量的EDC和NHS于上述反應(yīng)液，使EDC和NHS的摩爾質(zhì)量分別為30mM和30mM，反應(yīng)2小時(shí)后即得HA-CS溶膠。
[0052](2)將(I)中制得的HA-CS溶膠與0.5 μ g/ml的NGF溶液0.5ml在4°C下混合，并攪拌30min使其混合均勻即得。
[0053]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的結(jié)構(gòu)、形貌表征
[0054]調(diào)整上述制備的體系的pH至7.4并置于37°C恒溫水浴中(模擬人體生理環(huán)境)，直至瓶中溶膠不能完全流動(dòng)時(shí)，真空冷凍干燥12?48h后備用。
[0055]采用壓片法對(duì)上述冷凍干燥后的水凝膠樣品進(jìn)行紅外檢測(cè)。取2_3mg干燥后的水凝膠樣品與200-300mg干燥的KBr粉末在瑪瑙研缽中混勻，充分研磨后在壓模下壓片。取出壓好的薄片夾在樣品架上，在紅外光譜儀上檢測(cè)。波數(shù)范圍:400-4000(^'紅外圖譜見(jiàn)圖2。紅外圖譜表明=HA-CS水凝膠的紅外圖譜出現(xiàn)了釀胺基團(tuán)的特征峰,其中164601^處的吸收峰為酰胺(-C0NH-)中羰基C = O的伸縮振動(dòng)峰(酰胺I峰)’ 1566cm^處出現(xiàn)的吸收峰為N-H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰(酰胺II峰)。這說(shuō)明:HA-CS原位凝膠在形成的過(guò)程中，HA中的-COOH與CS中的-NH2成功發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)形成酰胺。用掃描電鏡(SEM)對(duì)樣品橫截面微觀形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，SEM圖見(jiàn)圖3。掃描電鏡觀察到水凝膠孔徑較小的為1微米，較大的為10微米。
[0056]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的降解性表征
[0057]取lmL上述1制備的體系置于10mL玻璃試管內(nèi)，調(diào)整pH為7.4后于37°C水浴中(模擬人體生理環(huán)境)，直至瓶中溶膠不能完全流動(dòng)時(shí)，形成凝膠。然后將凝膠放入37°C的PBS溶液中，并于水浴搖床中恒溫振蕩(37±l°C，50±5rpm)降解。降解時(shí)間分別為1、2、3、7、9、11天等。降解到相應(yīng)的時(shí)間后，取出樣品，用去離子水洗滌，檢測(cè)失重率。經(jīng)檢測(cè):本發(fā)明的水凝膠在15天之內(nèi)失重率達(dá)到65%。
[0058]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的累計(jì)釋放量表征
[0059]在超凈工作臺(tái)下，將上述2制得的冷凍干燥后的水凝膠樣品置入滅菌過(guò)的5mL離心管，加入3mL磷酸緩沖溶液(pH = 7.4)，之后將離心管置于37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱(60r/min)，在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、ld、3d、5d、7d等)將緩釋液取出，于_70°C保存，并加入等量的磷酸緩沖溶液，繼續(xù)均勻搖動(dòng)，浸提液的制備過(guò)程均應(yīng)保證無(wú)菌。然后利用NGF-ELISA試劑盒的方法測(cè)定特定時(shí)間緩釋液中NGF的精確含量。20天之內(nèi)累計(jì)釋放量達(dá)到60%。
[0060]實(shí)施例2
[0061 ] HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的制備
[0062](1)在4°C冰浴的條件下，將0.2g的HA加入到10ml去離子水中，磁力攪拌50min使其充分溶解，再逐漸加入0.lgCS鹽酸鹽，磁力攪拌lh使其混合均勻后將pH調(diào)至5.4，然后稱取一定質(zhì)量的EDC和NHS于上述反應(yīng)液，使EDC和NHS的摩爾質(zhì)量分別為70mM和30mM，反應(yīng)1小時(shí)后即得HA-CS溶膠。
[0063](2)將(1)中制得的HA-CS溶膠與0.75 μ g/ml的NGF溶液0.5ml在4°C下以一定的比例混合，并攪拌30min使其混合均勻，即得。
[0064]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的結(jié)構(gòu)、形貌表征
[0065]調(diào)整上述制備的體系的pH至7.4并置于37°C恒溫水浴中(模擬人體生理環(huán)境)，直至瓶中溶膠不能完全流動(dòng)時(shí)，真空冷凍干燥12?48h后備用。
[0066]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì).HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的結(jié)構(gòu)、形貌、進(jìn)行表征。紅外結(jié)果表明成功生成酰胺。用掃描電鏡(SEM)對(duì)樣品橫截面微觀形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。掃描電鏡觀察到水凝膠孔徑較小的為0.5微米，較大的為5微米。
[0067]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的降解性表征
[0068]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì)HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的降解性表征
[0069]經(jīng)檢測(cè):本發(fā)明的水凝膠15天之內(nèi)失重率達(dá)到90%。
[0070]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的累計(jì)釋放量表征
[0071]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì)HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的累計(jì)釋放量表征
[0072]經(jīng)檢測(cè):本發(fā)明的水凝膠20天之內(nèi)累計(jì)釋放量達(dá)到50%。
[0073]實(shí)施例3
[0074]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的制備
[0075](1)在4°C冰浴的條件下，將0.2g的HA加入到10ml去離子水中，磁力攪拌50min使其充分溶解，再逐漸加入0.3gCS鹽酸鹽，磁力攪拌lh使其混合均勻后將pH調(diào)至6，然后稱取一定質(zhì)量的EDC和NHS于上述反應(yīng)液，使EDC和NHS的摩爾質(zhì)量分別為10mM和10mM，反應(yīng)2小時(shí)后即得HA-CS溶膠。
[0076](2)將(1)中制得的HA-CS溶膠與1 μ g/ml的NGF溶液0.5ml在4°C下以一定的比例混合，并攪拌30min使其混合均勻，即得。
[0077]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的結(jié)構(gòu)、形貌表征
[0078]調(diào)整上述制備的體系的pH至7.4并置于37°C恒溫水浴中(模擬人體生理環(huán)境)，直至瓶中溶膠不能完全流動(dòng)時(shí)，真空冷凍干燥12?48h后備用。
[0079]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì).HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的結(jié)構(gòu)、形貌、進(jìn)行表征。紅外結(jié)果表明成功生成酰胺。用掃描電鏡(SEM)對(duì)樣品橫截面微觀形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。掃描電鏡觀察到水凝膠孔徑較小的為1微米，較大的為7微米。
[0080]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的降解性表征
[0081 ] 參考實(shí)施例1的表征方法對(duì)HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的降解性表征
[0082]經(jīng)檢測(cè):本發(fā)明的水凝膠15天之內(nèi)失重率達(dá)到80%。
[0083]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的累計(jì)釋放量表征
[0084]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì)HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的累計(jì)釋放量表征
[0085]經(jīng)檢測(cè):本發(fā)明的水凝膠20天之內(nèi)累計(jì)釋放量達(dá)到30%。
[0086]實(shí)施例4
[0087]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的制備
[0088](1)在4°C冰浴的條件下，將0.lg的HA加入到10ml去離子水中，磁力攪拌50min使其充分溶解，再逐漸加入0.2gCS鹽酸鹽，磁力攪拌lh使其混合均勻后將pH調(diào)至5.4，然后稱取一定質(zhì)量的EDC和NHS于上述反應(yīng)液，使EDC和NHS的摩爾質(zhì)量分別為10mM和40mM，反應(yīng)0.5小時(shí)后即得HA-CS溶膠。
[0089](2)將(1)中制得的HA-CS溶膠與1.25 μ g/ml的NGF溶液0.5ml在4°C下以一定的比例混合，并攪拌30min使其混合均勻，即得。
[0090]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的結(jié)構(gòu)、形貌表征
[0091]調(diào)整上述制備的體系的pH至7.4并置于37°C恒溫水浴中(模擬人體生理環(huán)境)，直至瓶中溶膠不能完全流動(dòng)時(shí)，真空冷凍干燥12?48h后備用。
[0092]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì).HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的結(jié)構(gòu)、形貌、進(jìn)行表征。
[0093]紅外結(jié)果表明成功生成酰胺。用掃描電鏡(SEM)對(duì)樣品橫截面微觀形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。掃描電鏡觀察到水凝膠孔徑較小的為1微米，較大的為5微米。
[0094]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的降解性表征
[0095]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì)HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的降解性表征
[0096]經(jīng)檢測(cè):本發(fā)明的水凝膠20天之內(nèi)失重率達(dá)到30%。
[0097]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的累計(jì)釋放量表征
[0098]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì)HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的累計(jì)釋放量表征
[0099]經(jīng)檢測(cè):本發(fā)明的水凝膠15天之內(nèi)累計(jì)釋放量達(dá)到30%。
[0100]實(shí)施例5[0101 ] HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的制備
[0102](1)在4°C冰浴的條件下，將0.lg的HA加入到10ml去離子水中，磁力攪拌50min使其充分溶解，再逐漸加入0.25gCS鹽酸鹽，磁力攪拌lh使其混合均勻后將pH調(diào)至4.7，然后稱取一定質(zhì)量的EDC和NHS于上述反應(yīng)液，使EDC和NHS的摩爾質(zhì)量分別為10mM和70mM,反應(yīng)6小時(shí)后即得HA-CS溶膠。
[0103](2)將(1)中制得的HA-CS溶膠與1.5 μ g/ml的NGF溶液0.5ml在4°C下以一定的比例混合，并攪拌30min使其混合均勻，即得。
[0104]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的結(jié)構(gòu)、形貌表征
[0105]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì).HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的結(jié)構(gòu)、形貌、進(jìn)行表征。
[0106]紅外結(jié)果表明成功生成酰胺。用掃描電鏡(SEM)對(duì)樣品橫截面微觀形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。掃描電鏡觀察到水凝膠孔徑較小的為2微米，較大的為10微米。
[0107]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的降解性表征
[0108]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì)HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的降解性表征
[0109]經(jīng)檢測(cè):本發(fā)明的水凝膠18天之內(nèi)失重率達(dá)到60%。
[0110]HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的累計(jì)釋放量表征
[0111]參考實(shí)施例1的表征方法對(duì)HA-CS-NGF可注射原位水凝膠的累計(jì)釋放量表征
[0112]經(jīng)檢測(cè):本發(fā)明的水凝膠13天之內(nèi)累計(jì)釋放量達(dá)到50%。
【權(quán)利要求】
1.一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠，其特征在于:它是在透明質(zhì)酸和殼聚糖鹽酸鹽的水溶液體系中加入EDC和NHS，在酸性條件下使透明質(zhì)酸在EDC/NHS作用下生成HA-NHS-活性酯中間體后，再加入NGF而得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠，其特征在于:所述的酸性條件為調(diào)節(jié)體系PH為4.7-6.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠，其特征在于:所述殼聚糖鹽酸鹽和透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為0.5-2.5:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠，其特征在于:神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠在人體生理環(huán)境下通過(guò)HA-NHS-活性酯中間體與殼聚糖鹽酸鹽中的NH2基團(tuán)進(jìn)行酰胺反應(yīng)完全轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠，其特征在于:所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠轉(zhuǎn)變得到的凝膠的孔徑范圍為0.5-10微米。
6.一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠的制備方法，其特征在于:步驟如下: (1)在透明質(zhì)酸的水溶液中逐漸加入殼聚糖鹽酸鹽，磁力攪拌使其混合均勻后將PH調(diào)至4.7-6.0，然后稱取一定質(zhì)量的EDC和NHS于上述反應(yīng)液，使體系中EDC和NHS的摩爾質(zhì)量分別為1lOmM和l(T70mM，反應(yīng)I?6小時(shí)后即得HA-CS溶膠體系； (2)在步驟(I)中制得的HA-CS溶膠體系中加入NGF，攪拌使其混合均勻即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)的攪拌溫度為0-4°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)的攪拌溫度為0-4°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中每毫升HA-CS溶膠體系所需的NGF的用量為25_75ng。
10.權(quán)利要求1所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原位可注射水凝膠在神經(jīng)修復(fù)方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61L27/20GK104399118SQ201410758132
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】徐海星, 張凌溪, 許沛虎, 鄭芙蓉, 金鳴, 李安召, 汪志輝 申請(qǐng)人:武漢理工大學(xué)