一種全人源抗TLR4的抗體Fab及其全分子抗體IgG和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種全人源抗TLR4的抗體Fab及其全分子抗體IgG和應(yīng)用，該全分子抗體IgG輕鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO.11所示，重鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO.12所示。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的全人源抗TLR4全分子抗體IgG可有效識(shí)別重組及天然TLR4蛋白，并能阻斷LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞對(duì)TNF-α的表達(dá),抑制率達(dá)85.7％。
【專利說(shuō)明】一種全人源抗TLR4的抗體Fab及其全分子抗體I gG和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因重組抗體藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種全人源抗TLR4的抗體Fab及其 全分子抗體IgG，以及其在制備阻斷炎癥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 感染性休克亦稱膿毒性休克，或中毒性休克，是指由微生物及其毒素等產(chǎn)物所引 起的膿毒病綜合征伴休克。感染灶中的微生物及其毒素、胞壁產(chǎn)物等侵入血循環(huán)，激活宿主 的各種細(xì)胞和體液系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子和內(nèi)源性介質(zhì)，作用于機(jī)體各種器官、系統(tǒng)，影響其 灌注，導(dǎo)致組織細(xì)胞缺血缺氧、代謝紊亂、功能障礙，甚至多器官功能衰竭。其特點(diǎn)是病情 重、進(jìn)展快、死亡率高。
[0003] 感染性休克最重要的發(fā)病機(jī)制主要與感染的細(xì)菌及其內(nèi)毒素引起的一系列炎癥 因子有關(guān)。內(nèi)毒素血癥可引起發(fā)熱反應(yīng)，內(nèi)毒素直接作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，或作用 于白細(xì)胞使之釋放內(nèi)原性致熱原；促使血管活性物質(zhì)如緩激肽、組胺、5_羥色胺、血管緊張 素等釋放，使血壓下降，導(dǎo)致微循環(huán)障礙；引起白細(xì)胞和血小板減少，激活凝血、纖溶系統(tǒng)， 產(chǎn)生出血傾向；彌漫性血管內(nèi)凝血；經(jīng)C3旁路或經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體；直接或間接損害肝臟， 引起糖代謝紊亂及酶學(xué)、蛋白代謝的改變；激活白三烯、前列腺素、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及內(nèi) 皮細(xì)胞活性。
[0004] 脂多糖是細(xì)菌內(nèi)毒素（endotoxin)的主要成分，是革蘭氏陰性細(xì)菌胞壁的成分。 內(nèi)毒素有多種生物活性，進(jìn)入人體血液可造成內(nèi)毒素血癥（ETM)，可引起多種病理生理過(guò) 程變化如發(fā)熱、休克、彌漫性血管內(nèi)凝血和粒細(xì)胞減少等，甚至造成嚴(yán)重后果如呼吸窘迫綜 合癥（ARDS)，急性腎衰竭（ARF)，甚至多器官功能衰竭等多種疾病，最終可因內(nèi)毒素休克死 亡。
[0005] TLR4(Toll-like receptor 4, TLR4)是Toll樣受體家族的成員之一，也是一種模 式識(shí)別受體，能夠識(shí)別微生物進(jìn)化過(guò)程中的一些保守結(jié)構(gòu)PAMP (pathogen-associatedmole cular pattern，PAMP)，如LPS，被認(rèn)為是內(nèi)毒素激活炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。TLR4在體內(nèi)和體外 對(duì)LPS效應(yīng)起著主要感受器的作用，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的促炎癥因子表達(dá)和組織對(duì)損傷的炎癥反 應(yīng)。近年來(lái)，對(duì)LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與TLR4的關(guān)系的研究取得了重大進(jìn)展。TLR4屬于I型跨膜 受體蛋白；胞外區(qū)由富含亮氨酸的重復(fù)序列LRR組成，胞內(nèi)區(qū)與IL-I受體胞內(nèi)區(qū)相似，稱為 TIR(T〇ll/IL-lreCept〇r)區(qū)。TLR4廣泛表達(dá)在各種淋巴細(xì)胞表面，其中既包括非特異免疫 細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中型粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，又包括介導(dǎo)特異免疫反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞和B淋巴 細(xì)胞，活化TLR4將誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)，從而產(chǎn)生強(qiáng)有力的炎癥反應(yīng)。LPS在細(xì)胞外 被識(shí)別后導(dǎo)致TLR4受體寡聚化激活，將LPS刺激信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)MyD88依賴和 非MyD88依賴的2條途徑觸發(fā)一系列的信號(hào)激聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)NF- κ B、AP-1和IRF-3等轉(zhuǎn)錄 因子磷酸化和核轉(zhuǎn)位，上調(diào)TNF-a、IL-I、IL-6、IL-8和IFN-Y等細(xì)胞因子的表達(dá)，最后 啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在這一過(guò)程中起著極其重要的作用，可能會(huì)成為治療內(nèi) 毒素血癥的重要靶點(diǎn)。
[0006] 目前，研究人員普遍認(rèn)為T(mén)LR4是內(nèi)毒素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的瓶頸和內(nèi)毒素瀑布效 應(yīng)的限速步驟，阻斷TLR4對(duì)內(nèi)毒素信號(hào)的傳導(dǎo)，是控制內(nèi)毒素生物效應(yīng)的最為有效的手 段。雖然現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了對(duì)TLR4進(jìn)行的相關(guān)研究，但是尚無(wú)開(kāi)發(fā)出針對(duì)人源TLR4的抗體， 從而不能有效控制內(nèi)毒素的生物效應(yīng)，因此對(duì)于TLR4介導(dǎo)的各種炎癥反應(yīng)，沒(méi)有得到十分 有效的控制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的在于提供一種全人源抗TLR4的抗體Fab及其全 分子抗體IgG，以及該抗體CDR區(qū)域的核苷酸及氨基酸序列、抗體可變區(qū)核苷酸及氨基酸序 列，及其在抑制TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的用途。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)研究，包括全人源免疫型Fab噬菌 體抗體庫(kù)的構(gòu)建，抗TLR4特異性抗體的篩選、純化，抗TLR4全分子抗體IgG的制備、表達(dá)及 純化，抗TLR4全分子抗體IgG的特性分析，抗TLR4全分子抗體IgG對(duì)TNF- α表達(dá)的影響， 最終獲得了如下技術(shù)方案：
[0009] 一種全人源抗TLR4的抗體Fab，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中：
[0010] (1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或 多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；
[0011] 且（2)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，或者是該序列經(jīng)一 個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0012] 進(jìn)一步地，如上所述的全人源抗TLR4的抗體Fab，其中：所述的輕鏈可變區(qū)的抗原 互補(bǔ)區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示；所述的重鏈 可變區(qū)的抗原互補(bǔ)區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所 /Jn 〇
[0013] 另外，發(fā)明人通過(guò)對(duì)上述抗體Fab進(jìn)一步研究后獲得了 一種全人源抗TLR4的全分 子抗體IgG，該全分子抗體IgG包含輕鏈和重鏈，其中：所述的輕鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO. 11所示，所述的重鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO. 12所示。
[0014] 再進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種DNA分子，其編碼上述的全分子抗體IgG的重鏈 或/和輕鏈。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施例中，如上所述的DNA分子中，其編碼輕鏈可變區(qū) 的核酸序列為SEQ ID NO. 1所示,編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0016] 再進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含有上述的DNA分子 以及與該DNA分子操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
[0017] 再進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞被上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化， 從而可以表達(dá)出全人源抗TLR4的全分子抗體IgG。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞可以是被上述的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化的293Freestyle細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明人通過(guò)將得到的全分子抗體IgG用于對(duì)TNF- α表達(dá)的影響試驗(yàn)得出，該全 分子抗體IgG能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的NF- α的表達(dá)，小鼠體內(nèi)90min時(shí)TNF- α表達(dá)的 抑制率為81. 1%，120min時(shí)TNF-α表達(dá)抑制率高達(dá)89. 9%，因此其可以被用來(lái)制備抑制 TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的試劑或藥物。即，本能發(fā)明進(jìn)一步提供一種抑制TLR4介導(dǎo)的炎癥反 應(yīng)的藥物，其中：該藥物的活性成分為權(quán)利要求3所述的全分子抗體IgG。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用從重癥肝炎病患者全血淋巴細(xì)胞中分離抗體基因的 方法獲得一種抗體Fab，并采用基因工程技術(shù)表達(dá)FAB抗體技術(shù)，獲得的一組全人源抗TLR4 的全分子抗體IgG ;通過(guò)試驗(yàn)表明它能夠有效的阻斷LPS誘導(dǎo)的人PBMC細(xì)胞對(duì)TNF- α的 表達(dá)，抑制率高達(dá)89. 9%，因而為治療TLR4介導(dǎo)的內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)提供了可能，同時(shí)為其 他相關(guān)疾病的基因工程研究提供了技術(shù)儲(chǔ)備。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1 :抗TLR4全分子抗體IgG的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0021] 圖2 :抗TLR4全分子抗體IgG的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果；
[0022] 圖3 :抗TLR4全分子抗體IgG的IP檢測(cè)結(jié)果；
[0023] 圖4 :細(xì)胞水平上抗TLR4全分子抗體IgG對(duì)TNF- α表達(dá)的影響；
[0024] 圖5 :小鼠體內(nèi)抗TLR4全分子抗體IgG對(duì)TNF- α表達(dá)的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神下可以對(duì)技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修 改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 實(shí)施例1全人源免疫型Fab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建
[0027] 1)采集臨床確證為重癥肝炎病患者全血50份，分離淋巴細(xì)胞，使用 Trizol (Invitrogen Cat#10296_010)抽提總 RNA,米用 oligo(dT)20((Invitrogen Cat#18418-020)作為引物，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。
[0028] 2)使用人抗體可變區(qū)通用引物（見(jiàn)表1)分別擴(kuò)增抗體重、輕鏈可變區(qū)基因組。采 用Overlap PCR合成人Fab基因組。使用SfiI內(nèi)切酶（NEB Cat#R0123S)雙酶切消化表達(dá)載 體pComb3XSS。使用 T4DNA Ligase(NEB Cat#M0202S)將Fab 基因連接到線性化的 pComb3XSS 質(zhì)粒，完成重組。
[0029] 3)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLl-Blue，最終構(gòu)建了容量為5. 76X 109的全人源Fab 抗體庫(kù)。
[0030] 表1 :人抗體可變區(qū)通用引物
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 一種全人源抗TLR4的抗體Fab，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其特征在于： (1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè) 氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體； 且（2)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或 多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的全人源抗TLR4的抗體Fab，其特征在于：所述的輕鏈可變區(qū) 的抗原互補(bǔ)區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQ ID NO. 5，SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示；所述的 重鏈可變區(qū)的抗原互補(bǔ)區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQ ID NO. 8，SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10 所示。
3. -種全人源抗TLR4的全分子抗體IgG，包含輕鏈和重鏈，其特征在于：所述的輕鏈的 氨基酸序列為SEQ ID NO. 11所示，所述的重鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO. 12所示。
4. 一種DNA分子，其編碼權(quán)利要求3所述的全分子抗體IgG的重鏈或/和輕鏈。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于：其編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
6. -種表達(dá)載體，包含有權(quán)利要求4所述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的 表達(dá)調(diào)控序列。
7. -種宿主細(xì)胞，它被權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
8. 權(quán)利要求3所述的全分子抗體IgG在制備抑制TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的試劑或藥物 中的用途。
9. 一種抑制TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的藥物，其特征在于：該藥物的活性成分為權(quán)利要求 3所述的全分子抗體IgG。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK104403001SQ201410765623
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】唐奇, 熊四平, 朱進(jìn), 馮振卿, 汪茂榮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所