一種具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法，包括下述步驟:原料處理、超高壓處理、超聲波處理、褐藻酸鹽的去除、去除蛋白、干燥即得成品。經(jīng)試驗證明，所得到的海帶多糖具有很好的抗腫瘤活性。
【專利說明】一種具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多糖的提取方法，具體涉及一種從海帶中提取海帶多糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 海帶（(LaminariaJaponicaAresch)是褐藻門海帶目海帶科海帶屬的大型海 藻。海帶富含多種功能性成分，具有極高的食用和藥用價值。尤其是近幾年發(fā)現(xiàn)海帶多糖 具有多方面的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、降脂、降糖、抗氧化等。
[0003] 對于具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法也有很多學(xué)者進行了研究和探討，傳 統(tǒng)方法主要為酸提取法、堿提取法、酶提取法等。這些提取方法都存在一定的缺陷。酸提可 造成多糖水解堿提取法造成多糖生物活性降低。酶提取法耗時，工業(yè)生產(chǎn)需要使用的酶量 大，成本高。熱水提取醇沉的方法簡便，但是耗時耗能。如中國專利CN102367282B，公開一 種海帶多糖的制備方法：海帶粉碎后加水，調(diào)節(jié)pH值至1-4,在100-120°C下提取2-5小時， 過濾，得提取液，用含有鉀的堿調(diào)節(jié)提取液pH值至6. 3-7. 0將提取液濃縮至固形物含量為 35-48%的濃縮液，濃縮液中加入乙醇，混合均勻后在4°C下靜置4-12小時，過濾，得多糖沉 淀，冷凍干燥，得到海帶多糖。又中國專利CN102367283B，公開一種海帶多糖的制備方法： 海帶粉碎后加水，在l〇5_125°C下提取2-5小時，過濾，得提取液，將提取液濃縮至固形物含 量為35-45%的濃縮液，濃縮液中加入乙醇，混合均勻后在0-4°C下靜置4-12小時，過濾，得 多糖沉淀，冷凍干燥，得到所述海帶多糖。采用以上方法，得到的多糖含量比較低，而且整個 工序時間長。
[0004] 近年來，雖然國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對海帶多糖的提取分離純化進行了研究，并取得了 一定進展，但針對多糖的特定藥理活性，研究較少，這在一定程度上制約了海帶多糖的精深 加工與應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法。
[0006] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] -種具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法，包括下述步驟：
[0008] 1)原料處理：將海帶，粉碎或打碎；
[0009] 2)超高壓處理：粉碎或打碎后的海帶中加入40-60倍重量份的純凈水，壓力 350MPa，作用溫度70-85°C，超高壓處理2-5min，完成后過濾，收集濾液；
[0010] 3)超聲波處理：將步驟2)得到濾液，超聲波處理5-10min，作用溫度70-85°C，功 率為300W，完成后過濾，收集濾液；
[0011] 4)褐藻酸鹽的去除：用濃度為1. 5M的鹽酸溶液調(diào)節(jié)步驟3)得到濾液的pH值為 1. 2,在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心20min，收集上清液；
[0012]5)去除蛋白、干燥：步驟4)得到的上清液濃縮后，采用Sevag法去除蛋白，收集上 層溶液，經(jīng)冷凍干燥后得海帶多糖。
[0013] 本發(fā)明所述的海帶為新鮮或干制后的海帶。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0015] 1、本發(fā)明采用超高壓處理海帶原料，在預(yù)定壓力保持一段時間，使原料細胞內(nèi)外 壓力達到平衡（有效成分達到溶解平衡）后迅速卸壓，使細胞內(nèi)外滲透壓力差突然增大， 細胞內(nèi)的有效成分穿過細胞膜（細胞膜的結(jié)構(gòu)在超高壓下發(fā)生變化），轉(zhuǎn)移到細胞外的提 取液中，達到提取目標成分的目的。超高壓提取避免了因長時間高溫而引起的有效成分的 變化、損失以及生理活性的降低，同時因為超高壓是在密閉的環(huán)境下進行的，沒有溶劑的揮 發(fā)，不會對環(huán)境造成污染。是一種安全有效的提取活性物質(zhì)的方法。
[0016] 2、本發(fā)明在采用超高壓處理原料后，接著再采用超聲波提取，超聲波提取利用的 是強烈的機械剪切作用，促進多糖的溶出，本發(fā)明通過采用兩種提取方式的結(jié)合，一方面縮 短了提取時間，另一方面提高了產(chǎn)品得率，采用本發(fā)明的方法，多糖含量98. 5%以上，提取 率70%以上。
[0017] 3、本發(fā)明得到的海帶多糖含量高，具有很好的抗腫瘤活性，為制備抗腫瘤藥物提 供新的選擇。

【具體實施方式】
[0018] 下面以實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
[0019] 實施例1 :
[0020] 一種具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法，包括下述步驟：
[0021] 1)原料處理：將干制后的海帶10kg，粉碎；
[0022] 2)超高壓處理：粉碎后的海帶中加入400kg的純凈水，壓力350MPa，作用溫度 85°C，超高壓處理4min，完成后過濾，收集濾液；
[0023] 3)超聲波處理：將步驟2)得到濾液，超聲波處理lOmin，作用溫度85°C，功率為 300W，完成后過濾，收集濾液；
[0024] 4)褐藻酸鹽的去除：用濃度為1. 5M的鹽酸溶液調(diào)節(jié)步驟3)得到濾液的pH值為 1. 2,在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心20min，收集上清液；
[0025] 5)去除蛋白、干燥：步驟4)得到的上清液濃縮后，采用Sevag法去除蛋白，收集上 層溶液，經(jīng)冷凍干燥后得海帶多糖。
[0026] 實施例2 :
[0027] -種具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法，包括下述步驟：
[0028] 1)原料處理：將新鮮的海帶10kg，打碎；
[0029] 2)超高壓處理：打碎后的海帶中加入600kg的純凈水，壓力350MPa，作用溫度 80°C，超高壓處理2min，完成后過濾，收集濾液；
[0030] 3)超聲波處理：將步驟2)得到濾液，超聲波處理8min，作用溫度80°C，功率為 300W，完成后過濾，收集濾液；
[0031] 4)褐藻酸鹽的去除：用濃度為1. 5M的鹽酸溶液調(diào)節(jié)步驟3)得到濾液的pH值為 1. 2,在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心20min，收集上清液；
[0032]5)去除蛋白、干燥：步驟4)得到的上清液濃縮后，采用Sevag法去除蛋白，收集上 層溶液，經(jīng)冷凍干燥后得海帶多糖。
[0033]實施例3 :
[0034] 一種具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法，包括下述步驟：
[0035] 1)原料處理：將干制后的海帶10kg，粉碎；
[0036] 2)超高壓處理：粉碎后的海帶中加入500kg的純凈水，壓力350MPa，作用溫度 70°C，超高壓處理5min，完成后過濾，收集濾液；
[0037] 3)超聲波處理：將步驟2)得到濾液，超聲波處理5min，作用溫度70°C，功率為 300W，完成后過濾，收集濾液；
[0038] 4)褐藻酸鹽的去除：用濃度為1. 5M的鹽酸溶液調(diào)節(jié)步驟3)得到濾液的pH值為 1. 2,在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心20min，收集上清液；
[0039] 5)去除蛋白、干燥：步驟4)得到的上清液濃縮后，采用Sevag法去除蛋白，收集上 層溶液，經(jīng)冷凍干燥后得海帶多糖。
[0040] 實驗例：本發(fā)明得到的海帶多糖對癌細胞的抑制作用
[0041] 1、實驗材料：本發(fā)明實施例1、實施例2得到的海帶多糖。
[0042] 實驗地點：廣西桂林醫(yī)學(xué)院。
[0043] 2、腫瘤細胞株：人十二指腸腺癌細胞HuTu-80、人胃癌細胞MGC-803,用RPMI-1649 培養(yǎng)液，37°C，5%C02，相對濕度100%培養(yǎng)，貼壁細胞0. 25%胰蛋白酶消化傳代。
[0044] 3、方法MTT比色法測定提取物對腫瘤細胞生長的抑制作用。取對數(shù)生長期細胞， 用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液配制成細胞懸液，懸浮細胞1X105個/ml貼壁細胞0. 8X105個/ ml。懸浮細胞分別加入不同濃度實驗藥物后接種于96孔培養(yǎng)板中；貼壁細胞先接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔90yl，24h后分別加入不同濃度實驗藥物。終體積為每孔100yl且每組 設(shè)3個平行孔，共設(shè)4組：受試藥組T(培養(yǎng)液+細胞懸液+不同濃度受試藥）、陰性對照組 N(培養(yǎng)液+細胞懸液）、藥物顏色對照組TC(培養(yǎng)液+不同濃度受試藥）、空白對照組B(培 養(yǎng)液+生理鹽水）。受試藥濃度依次為10Ug/ml，30iig/ml，50iig/ml。置37°C，5%C02培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，向每孔加入MTT溶液10yl震蕩混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入SDS90yl終 止培養(yǎng)，37°C過夜，然后室溫下在微量振蕩器上震蕩lOmin，酶標儀測定570nm波長處的吸 光度（0D值），實驗重復(fù)3次。
[0045] 按以下公式計算生長抑制率：
[0046] 生長抑制率（％ ) = [ (N組0D均值-B組0D均值）-(T組0D均值-TC組0D均 值）]/[N組0D均值-B組0D均值]X100%。
[0047] 4、藥物對人十二指腸腺癌細胞HuTu-80、人胃癌細胞MGC-803的抑制率結(jié)果見表 1、表 2。
[0048] 表1 :對HuTu-80的抑制率結(jié)果
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法，其特征在于，包括下述步驟： 1) 原料處理：將海帶，粉碎或打碎； 2) 超高壓處理：粉碎或打碎后的海帶中加入40-60倍重量份的純凈水，壓力350MPa，作 用溫度70-85°C，超高壓處理2-5min，完成后過濾，收集濾液； 3) 超聲波處理：將步驟2)得到濾液，超聲波處理5-10min，作用溫度70-85°C，功率為 300W，完成后過濾，收集濾液； 4) 褐藻酸鹽的去除：用濃度為1. 5M的鹽酸溶液調(diào)節(jié)步驟3)得到濾液的pH值為1. 2， 在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心20min，收集上清液； 5) 去除蛋白、干燥：步驟4)得到的上清液濃縮后，采用Sevag法去除蛋白，收集上層溶 液，經(jīng)冷凍干燥后得海帶多糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的海帶多糖的提取方法，其特征在于：所述 的海帶為新鮮或干制后的海帶。
【文檔編號】A61K31/715GK104387497SQ201410795417
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】周冠旻 申請人:桂林市和胤祥新型材料有限公司