一種基于透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥的自聚納米系統(tǒng)的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥自聚納米系統(tǒng)的制備方法，屬于有機合成領(lǐng)域或藥物制劑領(lǐng)域。包括藥物與連接臂的偶聯(lián)、透明質(zhì)酸及其銨鹽與連接臂偶聯(lián)、透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥合成?；谠撉八幍淖跃奂{米系統(tǒng)能在體內(nèi)達(dá)到長循環(huán)作用，并具有腫瘤主動靶向性，降低了藥物的毒副作用。
【專利說明】一種基于透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥的自聚納米系統(tǒng)的制 備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及有機合成領(lǐng)域或藥物制劑領(lǐng)域。具體涉及透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥 自聚納米系統(tǒng)的制備方法。包括抗腫瘤藥物與連接臂的偶聯(lián)、透明質(zhì)酸及其銨鹽與連接臂 偶聯(lián)、透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥合成。

【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸作為一種天然多糖，可以正常的被人體吸收、代謝，具有良好的生物相容 性，己作為多種藥物載體使用。透明質(zhì)酸良好的水溶性可以克服某些藥物載體溶解性差的 缺點，同時具有羥基、羧基等可修飾基團(tuán)便于進(jìn)行化學(xué)修飾且制備條件簡便溫和。在腫瘤表 面透明質(zhì)酸受體CD44和RHAMM有過量表達(dá)，透明質(zhì)酸與受體之間的特異性結(jié)合使透明質(zhì)酸 在作為藥物載體時具有靶向功能，有望提高藥物定向輸送能力。由CD44所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞 作用可以使前藥進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，以增加難溶性藥物的生物利用度。所以，采用透明質(zhì)酸作為 難溶性藥物的載體有望提高藥效。
[0003] 透明質(zhì)酸經(jīng)過二酰肼改性后形成HA-ADH衍生物，可以將藥物分子接到HA-ADH上， 生成HA鍵合藥物，透明質(zhì)酸可以提供新型藥物靶向和控制釋放的作用。這個過程一般是： 二酰肼和HA連接后，酰肼剩余NH 2可與HA分子中的其他羧基再連接，會發(fā)生分子內(nèi)或分子 間交聯(lián)，同時還有剩余冊12可以與藥物活性部位連接將藥物鍵合到透明質(zhì)酸上，或藥物也可 先與多酰肼連接，再與HA分子接枝，也可得到透明質(zhì)酸鍵合藥物體系。
[0004] 紫杉醇（Taxol)是由Wall等人于1963年從紅豆杉的樹皮中提取分離的，它是一 種具有促進(jìn)微管聚合的抗癌藥物，是目前應(yīng)用最為廣泛的抗腫瘤藥物之一。然而，紫杉醇雖 然有顯著的抗腫瘤作用，但存在難溶于水及半衰期短等特點?，F(xiàn)行臨床制劑中應(yīng)用聚氧乙 稀蓖麻油與無水乙醇（50 : 50, v/v)的混合液來穩(wěn)定紫杉醇，制備成注射劑給藥。然而采 用表面活性劑增溶的方法會產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，給紫杉醇的廣泛應(yīng)用帶來許多障礙。
[0005] 對紫杉醇進(jìn)行改進(jìn)制備前藥的研宄主要有兩類：一種是在原藥的基礎(chǔ)上對其分 子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，引入小分子基團(tuán)，目的是提高水溶性、降低藥物毒副作用；另一種改進(jìn)方 式是運用載體制備前藥，藥物為可逆性藥物衍生物，在穩(wěn)定性、選擇性、生物利用度以及降 低藥物毒副作用等一方面或多方面優(yōu)于原藥，形成藥物輸送系統(tǒng)（drug deliver system DDs)。與開發(fā)全新藥物相比，制備藥物輸送系統(tǒng)更為經(jīng)濟(jì)，目標(biāo)明確，成功率高，已成為新藥 研發(fā)的有效途徑之一。
[0006] 由于納米型載體在腫瘤治療過程中利用了腫瘤組織微環(huán)境的一些特殊性質(zhì)，能夠 將藥物運送到特定的位置同時產(chǎn)生較小的副作用。兩親聚合物分子由于具有親水端和疏水 端，在水中能夠自組裝形成疏水端在內(nèi)親水端在外的納米顆粒。以紫杉醇為模版藥物的自 組裝型透明質(zhì)酸-抗腫瘤藥物給藥系統(tǒng)，能夠選擇性的靶向腫瘤部位，改善化療藥物的體 內(nèi)藥動學(xué)特征，降低毒副作用，延長體內(nèi)滯留時間，提高抗腫瘤療效。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種以紫杉醇作為模版藥物的透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥自聚納 米系統(tǒng)的制備方法。目的在于提高紫杉醇的溶解度和生物利用度，并且實現(xiàn)其腫瘤靶向性。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案加以實現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明提供了一種以紫杉醇作為模版藥物的透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥，其結(jié)構(gòu) 如圖1所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了上述以紫杉醇作為模版藥物的透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥自聚 納米系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟：
[0011] (1)透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼（HA-ADH)的合成
[0012] 按摩爾的量計，將一定量透明質(zhì)酸溶于去離子水中，加入5當(dāng)量的己二酸二酰肼， 室溫攪拌均勻，用0. IM的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 75,加入1當(dāng)量的碳二亞胺鹽酸鹽（EDC .HCl)，每 隔5?IOmin用0. IM的鹽酸調(diào)節(jié)pH使其保持在4. 75左右，反應(yīng)2?4h，加0. lmol/L氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0終止反應(yīng)。將上述反應(yīng)液加入Mw3500的透析袋中，依次用0. Imol/ L的氯化鈉溶液、25%乙醇水溶液、純水透析完全，再用0. 22 μ m的醋酸纖維素膜過濾后凍 干即得透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼（HA-ADH)。
[0013] ⑵透明質(zhì)酸-紫杉醇（HA-PTX)的合成
[0014] 稱取一定量的HA-ADH，溶于pH6. 5的PBS溶液中，加入溶于DMF :水=2 : 1混合 溶劑的紫杉醇-N-羥基丁二酰亞胺酯（Taxol-NHS)，室溫攪拌1?2天。將上述反應(yīng)液加入 Mw3500的透析袋中分別用50%乙醇水溶液和純水透析完全，再用0. 22 μ m的醋酸纖維素膜 過濾后凍干即得透明質(zhì)酸-紫杉醇（HA-PTX)。
[0015] (3)透明質(zhì)酸-紫杉醇自聚納米粒子的制備
[0016] 稱取一定量HA-PTX，用去離子水溶解，探頭超聲5?10分鐘后，用0. 22 μ m的醋酸 纖維素膜過濾即得透明質(zhì)酸-紫杉醇自聚納米粒子。
[0017] 其中步驟1所述透明質(zhì)酸分子量為2000?40000 ;所述透明質(zhì)酸與紫杉醇的摩爾 比為I : 1?1 : 50。
[0018] 其中步驟1、2所述透析袋截留分子量為1000?4000 ;所述透析時間為1?3天。 其中步驟3所述溶劑為pHl. 0?9. 0的水性環(huán)境，探頭超聲功率為500?1000W，探頭超聲 時間為5?15分鐘。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1以紫杉醇為模版藥物的透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥自聚納米系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖
[0020] 圖 2Taxol-NHS 酯、HA-ADH 和 HA-PTX 的紅外譜圖
[0021] 圖3Taxo I-NHS酯核磁共振氫譜1H NMR
[0022] 圖4HA-ADH和HA-PTX的紫外吸收譜圖
[0023] 圖5自組裝型透明質(zhì)酸-紫杉醇膠束透射電子顯微鏡（TEM)成像圖
[0024] 圖6藥效學(xué)實驗?zāi)[瘤體積相對變化率經(jīng)時曲線

【具體實施方式】 [0025] 實施例1
[0026] N-羥基丁二酰亞胺二苯基磷酸鹽（SDPP)的合成
[0027] 稱取230mgN-羥基丁二酰亞胺溶于二氯甲烷，加入434 μ 1氯代磷酸二苯酯攪拌均 勻，再加入280 μ 1三乙胺，室溫攪拌12小時；將反應(yīng)液加入研缽，加乙醚研磨后用乙酸乙酯 溶解沉淀，分別用去離子水和飽和食鹽水洗滌反應(yīng)液，有機層置于無水硫酸鈉中干燥，減壓 除去有機相得SDPP。
[0028] 實施例2
[0029] 紫杉醇半琥珀酰鹽（PTX-semi)的合成
[0030] 稱取540mg紫杉醇和76mg 丁二酸酐溶于二氯甲烷中，加入513 μ 1無水吡啶，室溫 攪拌3天；反應(yīng)液真空濃縮后，采用柱層析法純化，洗脫劑為乙酸乙酯和正己烷（體積比為 I : 1 ?I : 3) 〇
[0031] 實施例3
[0032] 紫杉醇-N-羥基琥珀酰亞胺酯（Taxol-NHS)的合成
[0033] 稱取300mg紫杉醇半琥珀酰鹽和164mg N-羥基丁二酰亞胺二苯基磷酸鹽溶于乙 腈中，加入176 μ 1三乙胺，室溫攪拌24小時；反應(yīng)液真空濃縮后，采用柱層析法純化，洗脫 劑為乙酸乙酯和正己烷（體積比為I : 1?1 : 3)。
[0034] 經(jīng)核磁共振氫譜IH NMR和紅外FT-IR對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定：
[0035] 對氫譜結(jié)果進(jìn)行分析，丁二酰亞胺的兩個特征亞甲基峰在2. 33ppm處有一個dd 峰，丁二酸的兩個特征亞甲基峰在2. 12ppm處有一個dd峰；對紅外結(jié)果進(jìn)行分析，丁二酰亞 胺的兩個活潑羰基峰在1818. lcm'1786. 2CHT1處有吸收。以上結(jié)果證明了紫杉醇-N-羥基 琥珀酰亞胺酯的結(jié)構(gòu)。
[0036] 實施例4
[0037] 透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼（HA-ADH)的合成
[0038] 稱取45mg透明質(zhì)酸，用去離子水配制成3mg/ml的溶液，加入52mg己二酸二酰肼， 用〇· IM的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 75,再加入12mg碳二亞胺鹽酸鹽，保持ρΗ4· 75反應(yīng)24小時，加 入0. IM氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0終止反應(yīng)；將反應(yīng)液加入Mw3500的透析袋中，依次用 0. lmol/L的氯化鈉溶液、25%乙醇水溶液、純水透析完全，再用0. 22 μ m的醋酸纖維素膜過 濾后凍干即得。
[0039] 經(jīng)紫外UV和紅外FT-IR對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。
[0040] 實施例5
[0041] 透明質(zhì)酸-紫杉醇（HA-PTX)的合成
[0042] 稱取30mg透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼，溶于pH6. 5的PBS溶液中，得到濃度為Img/ ml的溶液，加入8mg溶于DMF :水=2 : 1混合溶劑中的紫杉醇-N-羥基琥珀酰亞胺酯，室 溫攪拌24小時；將上述反應(yīng)液加入Mw3500的透析袋中分別用50%乙醇水溶液和純水透析 完全，再用0. 22 μ m的醋酸纖維素膜過濾后凍干即得。
[0043] 經(jīng)紫外UV和紅外FT-IR對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。
[0044] 實施例6
[0045] 自聚型透明質(zhì)酸-紫杉醇納米系統(tǒng)的制備
[0046] 稱取5mg透明質(zhì)酸-紫杉醇，用去離子水配制成lmg/ml的溶液，探頭超聲 IOmin (功率100W，超3s停3s)，再用0. 22 μ m的醋酸纖維素膜過濾即得。
[0047] 經(jīng)透射電子顯微鏡（TEM)成像對其形態(tài)進(jìn)行驗證。
[0048] 實施例7
[0049] 自聚型透明質(zhì)酸-多西紫杉醇納米系統(tǒng)的制備
[0050] 稱取45mg透明質(zhì)酸，用去離子水配制成3mg/ml的溶液，加入52mg己二酸二酰肼， 用〇· IM的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 75,再加入12mg碳二亞胺鹽酸鹽，保持ρΗ4· 75反應(yīng)24小時，加 入0. IM氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0終止反應(yīng)；將反應(yīng)液加入Mw3500的透析袋中，依次用 0. lmol/L的氯化鈉溶液、25%乙醇水溶液、純水透析完全，再用0. 22 μ m的醋酸纖維素膜過 濾后凍干。稱取30mg透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼，溶于pH6. 5的PBS溶液中，得到濃度為Img/ ml的溶液，加入8mg溶于DMF :水=2 : 1混合溶劑中的多西紫杉醇-N-羥基琥珀酰亞胺 酯，室溫攪拌24小時；將上述反應(yīng)液加入Mw3500的透析袋中分別用50 %乙醇水溶液和純 水透析完全，再用〇. 22 μ m的醋酸纖維素膜過濾后凍干。稱取5mg透明質(zhì)酸-多西紫杉醇， 用去離子水配制成lmg/ml的溶液，探頭超聲IOmin (功率100W，超3s停3s)，再用0. 22 μπι 的醋酸纖維素膜過濾即得。
[0051] 實施例8
[0052] 藥動學(xué)實驗
[0053] 雄性SD大鼠6只，隨機分為兩組，分別尾靜脈注射透明質(zhì)酸-紫杉醇和紫杉醇注 射液，注射劑量5mg/kg，尾靜脈給藥后分別于0. 083、0. 25、0. 5、l、2、4、8、12h于眼眶靜脈叢 取血0. 5ml，置于蕩有肝素的離心管內(nèi)，5000r/min離心IOmin分離血漿。按血漿樣品處理 方法，HPLC測定并記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血藥濃度。
[0054] 計算得藥動學(xué)參數(shù)：
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥自聚納米系統(tǒng)，其特征在于，該前藥是在透明 質(zhì)酸骨架上合成連接臂，通過該連接臂與難溶性藥物偶聯(lián)，使其能在水中自組裝形成納米 粒子，并能靶向藥物至腫瘤組織的具有兩親性的透明質(zhì)酸衍生物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，難溶性藥物包括紫杉醇、多西紫杉醇、二胺環(huán)己烷鉑、甲氨蝶 呤、長春花堿、阿托伐他汀鈣、硝苯地平、奧美拉唑等。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，具有腫瘤靶向性的以紫杉醇為模版藥物的透明質(zhì)酸-難溶性 藥物前藥，其特征在于，結(jié)構(gòu)如下所示：
n = 5_30〇
4. 權(quán)利要求3所述以紫杉醇作為模版藥物的透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥自聚納米系統(tǒng) 的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： a、 按摩爾的量計，將一定量透明質(zhì)酸溶于去離子水中，加入5當(dāng)量的己二酸二酰肼，室 溫攪拌均勻，用0. IM的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 75,加入1當(dāng)量的碳二亞胺鹽酸鹽（EDC .HC1)，每 隔5-10min用0. IM的鹽酸調(diào)節(jié)pH使其保持在4. 75左右，反應(yīng)2-4h，加0. lmol/L氫氧化鈉 溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0終止反應(yīng)。將上述反應(yīng)液加入Mw3500的透析袋中，依次用0. lmol/L的 氯化鈉溶液、25%乙醇水溶液、純水透析完全，再用0. 22 ym的醋酸纖維素膜過濾后凍干即 得透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼（HA-ADH); b、 稱取一定量的HA-ADH，溶于pH6. 5的PBS溶液中，加入溶于DMF :水=2 : 1混合 溶劑的紫杉醇-N-羥基丁二酰亞胺酯（Taxol-NHS)，室溫攪拌1-2天，將上述反應(yīng)液加入 Mw3500的透析袋中分別用50%乙醇水溶液和純水透析完全，再用0. 22 y m的醋酸纖維素膜 過濾后凍干即得透明質(zhì)酸-紫杉醇（HA-PTX); c、 稱取一定量HA-PTX，用去離子水溶解，探頭超聲5-10分鐘后，用0. 22 y m的醋酸纖維 素膜過濾即得透明質(zhì)酸-紫杉醇自聚納米粒子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述以紫杉醇作為模版藥物的透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥自聚納米 系統(tǒng)的合成方法，其特征在于，所述透明質(zhì)酸分子量為2000-40000 ;所述透明質(zhì)酸與紫杉 醇的摩爾比為1 : 1-1 : 50。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述以紫杉醇作為模版藥物的透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥自聚納米 系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述透析袋截留分子量為1000-4000 ;所述透析時間為1-3 天。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述以紫杉醇作為模版藥物透明質(zhì)酸-難溶性藥物前藥自聚納 米系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所用溶劑為PHI. 0-9. O的水性環(huán)境，探頭超聲功率為 500-1000W，探頭超聲時間為5-15分鐘。
【文檔編號】A61K47/48GK104491875SQ201410809037
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】尹莉芳, 徐超然, 何偉, 秦超, 王柏 申請人:中國藥科大學(xué)