抑制ADAM17基因的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制ADAM17基因的siRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)一種化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子，是由如下A所示的siRNA分子中至少一條鏈經(jīng)過(guò)如下(1)-(13)所示的任意化學(xué)修飾后互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子。本發(fā)明公開(kāi)的siRNA可以作為關(guān)節(jié)炎及相關(guān)炎癥的治療藥物，可通過(guò)骨關(guān)節(jié)腔局部注射siRNA及其制劑抑制炎癥因子表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)節(jié)炎癥的治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】抑制ADAM17基因的s i RNA及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抑制ADAM17基因的SiRNA及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，目前尚缺乏有效治療 手段的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病變，迫切需要研宄出能有效防治骨關(guān)節(jié)炎的新方法。骨關(guān)節(jié)炎 臨床病理特征之一是軟骨破壞和hFLS細(xì)胞外基質(zhì)降解，而軟骨的破壞最終都來(lái)源于胞外 基質(zhì)的蛋白水解。因此多種蛋白水解酶活性增高引起繼發(fā)性軟骨外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM)的降解異常是軟骨退變的直接原因，最終導(dǎo)致覆蓋關(guān)節(jié)骨表面的軟骨破壞。白 介素-I(IL-I)和腫瘤壞死因子-a (TNF-α)都有促進(jìn)hFLS細(xì)胞分解代謝及降解細(xì)胞外基 質(zhì)的作用，有研宄表明在關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中發(fā)現(xiàn)高濃度的IL-I和TNF-α，它們被認(rèn)為 是在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的促炎細(xì)胞因子。
[0003] ADAM17(解聚素-金屬蛋白酶17)是ADAMs家族（解聚素和金屬蛋白酶）的一員， ADAMs家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)具有多種功能的細(xì)胞膜表面糖蛋白家族，它們共同參與細(xì) 胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)的黏連、細(xì)胞融合、胞外基質(zhì)的降解及信號(hào)傳導(dǎo)等多種生理過(guò)程，如 白細(xì)胞的迀移。除此之外，它們還參與了腫瘤形成、增殖及轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程。ADAM17將膜 結(jié)合型的TNF-α切斷，產(chǎn)生游離型的TNF-α，因此被稱作為T(mén)NF-α轉(zhuǎn)換酶（TACE)。游離 型的TNF-α引起炎癥性細(xì)胞因子的過(guò)量分泌、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的障礙等，導(dǎo)致 各種疾病，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、多發(fā)性硬化癥、急性感染病、哮 喘、特應(yīng)性皮炎、牛皮癬等。ADAM17除以TNF-α為底物外，巨噬細(xì)胞集落刺激因子或趨化 因子FKN也受ADAM17的調(diào)節(jié)。因此，認(rèn)為抑制ADAM17的化合物有望作為炎癥疾病的治療 藥。然而，金屬蛋白酶家族高度保守，開(kāi)發(fā)選擇性的小分子抑制劑已經(jīng)被證明具有非常大的 挑戰(zhàn)。先前使用更廣譜的金屬蛋白酶抑制劑的試驗(yàn)已經(jīng)被證明具有組織毒性，因此開(kāi)發(fā)高 度選擇性的ADAM17抑制劑（Moss，2008)是需要解決的問(wèn)題。
[0004] 1998年克雷格·梅洛和安德魯?法爾發(fā)現(xiàn)了基因沉默現(xiàn)象，隨后Tuschl和他的同 事在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)化學(xué)合成的19 一 25個(gè)堿基的小干擾RNA(SiRNA)，可特異高效的 沉默靶mRNA。從此siRNA被廣泛用于基因功能研宄，疾病治療。siRNA可特異的同序列互 補(bǔ)的靶mRNA結(jié)合，并使其降解。長(zhǎng)片段的雙鏈RNA被Dicer酶切割成21 - 23個(gè)堿基長(zhǎng)度 短片段RNA。兩條鏈中同靶mRNA結(jié)合的鏈稱為反義鏈，另一條鏈稱為正義鏈或信使鏈。體 外化學(xué)合成的siRNA進(jìn)入細(xì)胞后同樣發(fā)揮RNA干擾作用，而且有效降低了長(zhǎng)鏈RNA引起的 免疫反應(yīng)。但針對(duì)同一基因不同片段位置可設(shè)計(jì)出多種siRNA，沉默效果有明顯差異。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抑制ADAM17基因的SiRNA及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供一種化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子，是由如下A所示的siRNA分子中至 少一條鏈經(jīng)過(guò)如下（1)-(13)所示的任意化學(xué)修飾后互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子：
[0007] A、一種SiRNA分子，為如下1)或2)所示：
[0008] I) SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈和SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈 siRNA分子；
[0009] 2) SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈有60%以上同 源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子；
[0010] 或，SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈和與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有60%以上 同源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子；
[0011] 或，與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子；
[0012] (1)磷酸骨架的硫代磷酸修飾；
[0013] 所述硫代磷酸修飾為磷酸骨架的P-S鍵代替P-OH鍵；
[0014] (2)核糖或脫氧核糖的2' -甲氧基修飾；
[0015] (3)核糖或脫氧核糖的2' -氟修飾；
[0016] (4)鎖核酸修飾；
[0017] 所述鎖核酸修飾為核糖或脫氧核糖的2' -0位和4' -C位通過(guò)縮水作用形成環(huán) 狀結(jié)構(gòu)；
[0018] (5)開(kāi)環(huán)核酸修飾；
[0019] 所述開(kāi)環(huán)核酸修飾為核糖或脫氧核糖中2' -C和3' -C間的C-C鍵斷裂；
[0020] ⑶叼丨噪修飾；
[0021] 所述吲哚修飾為堿基被吲哚替代；
[0022] (7)堿基的5 -甲基胞嘧啶修飾；
[0023] (8)堿基的5-乙炔基尿嘧啶修飾；
[0024] (9)單鏈5'末端膽固醇修飾；
[0025] (10)單鏈3'末端半乳糖修飾；
[0026] (11)單鏈5'末端多肽修飾；
[0027] 所述多肽具體為從N端到C端的序列為Arg-Gly-Asp的多肽；
[0028] (12)單鏈5'末端磷酸化修飾；
[0029] (13)單鏈5'末端熒光標(biāo)記修飾；
[0030] 所述熒光標(biāo)記具體為Cy系列熒光標(biāo)記；
[0031] 所述與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子具體為SEQ ID No. 3所示的單鏈和SEQ ID No. 4所示的單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子。
[0032] 上述化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子中，所述化學(xué)修飾后互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子 的正義鏈和反義鏈分別具有如下Bl和Cl所示的序列：
[0033] Β1、5' -Γ -L' P' M' UCAUGUAUCUGAA P' Μ' M' dTdT-3' ；
[0034] Cl、5' -R' -Q' Q' L' UUCAGAUACAUGA Q' L' P' dTdT-3' ；
[0035] 所述K '為5 '末端膽固醇修飾；
[0036] 所述R'為無(wú)修飾或5'末端磷酸化修飾；
[0037] 所述dT為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸；
[0038] 所述L'、Μ'、P'和Q'分別為脫氧核糖的2' -甲氧基修飾的鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷 酸、脫氧核糖的2' -甲氧基修飾的腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖的2' -甲氧基修飾的 胞嘧啶脫氧核糖核苷酸和核糖的2' -甲氧基修飾的尿嘧啶核糖核苷酸；
[0039] 或，
[0040] 所述L'、M'、P'和Q'分別為鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷酸、腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、胞嘧 啶脫氧核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸；
[0041] 所述反義鏈為同ADAM17(解聚素-金屬蛋白酶17)mRNA結(jié)合的單鏈，所述正義鏈 為與所述反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的單鏈。
[0042] 一種SiRNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，為如下（1)或（2)所示：
[0043] (I) SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈和SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈 siRNA分子；
[0044] (2) SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈有60%以上 同源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子；
[0045] 或，SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈和與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有60%以上 同源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子；
[0046] 或，與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子；
[0047] 所述siRNA分子應(yīng)用于制備預(yù)防和/或治療炎癥的產(chǎn)品；
[0048] 所述炎癥具體為關(guān)節(jié)炎癥，再具體為骨關(guān)節(jié)炎。
[0049] 含有上述siRNA分子的載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0050] 所述載體為陽(yáng)離子脂質(zhì)體、殼聚糖納米粒、多肽、聚合物材料。
[0051] 上述siRNA分子中，所述與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有70%以上同源性的 RNA單鏈和與SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈 siRNA分子為SEQ ID No. 3所示的單鏈和SEQ ID No. 4所示的單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA 分子。
[0052] -種能產(chǎn)生上述siRNA分子的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0053] 上述DNA分子中，所述siRNA分子為SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈和SEQ ID No. 2 所不的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子；
[0054] 所述DNA分子為含有SEQ ID No. 5中自5'末端起第38-56位核苷酸的DNA分子， 具體為含有SEQ ID No. 5所示的DNA單鏈和SEQ ID No. 6所示的DNA單鏈互補(bǔ)而成的雙 鏈DNA的DNA分子，再具體為SEQ ID No. 5所示的DNA單鏈和SEQ ID No. 6所示的DNA單 鏈互補(bǔ)而成的雙鏈DNA的分子替換pGCsi-Hl/Neo的BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)間序列， pGCsi-Hl/Neo的其余序列不變得到的重組siRNA表達(dá)質(zhì)粒。
[0055] -種試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑盒包含上述任一所述的化學(xué)修飾的 雙鏈siRNA分子、上述任一所述的siRNA分子和/或上述任一所述的DNA分子；
[0056] 所述試劑盒還含有記載在可讀載體上的使用說(shuō)明，該使用說(shuō)明記載內(nèi)容如下：在 發(fā)生炎癥部位注射上述任一所述的化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子或其制劑、上述任一所述的 siRNA分子再經(jīng)化學(xué)修飾得到的siRNA分子或其制劑和/或上述任一所述的DNA分子產(chǎn)生 的RNA分子再經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾得到的雙鏈siRNA分子或其制劑。
[0057] 上述任一所述的化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子、上述任一所述的siRNA分子和/或 上述任一所述的DNA分子和/或上述試劑盒在制備預(yù)防和/或治療炎癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0058] 所述炎癥具體為關(guān)節(jié)炎癥，再具體為骨關(guān)節(jié)炎。
[0059] 上述任一所述的化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子、上述任一所述的siRNA分子和/或 上述任一所述的DNA分子和/或上述試劑盒在制備如下D1-D4任一所示的產(chǎn)品中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0060] D1、抑制關(guān)節(jié)表面纖維化的廣品；
[0061] D2、抑制軟骨侵蝕的產(chǎn)品；
[0062] D3、預(yù)防和/或治療滑膜炎的產(chǎn)品；
[0063] D4、保護(hù)軟骨和/或滑膜的產(chǎn)品。
[0064] 上述任一所述的化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子、上述任一所述的siRNA分子和/或 上述任一所述的DNA分子和/或上述試劑盒在制備如下E1-E6任一所示的產(chǎn)品中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0065] E1、預(yù)防和/或治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品；
[0066] E2、預(yù)防和/或治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的產(chǎn)品；
[0067] E3、預(yù)防和/或治療多發(fā)性硬化癥的產(chǎn)品；
[0068] E4、預(yù)防和/或治療急性感染病的產(chǎn)品；
[0069] E5、預(yù)防和/或治療特應(yīng)性皮炎的產(chǎn)品；
[0070] E6、預(yù)防和/或治療牛皮癬的產(chǎn)品。
[0071] 本發(fā)明提供的siRNA可以作為關(guān)節(jié)炎及相關(guān)炎癥的治療藥物，可通過(guò)骨關(guān)節(jié)腔局 部注射siRNA或其制劑抑制炎癥因子表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)節(jié)炎癥的治療。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0072] 圖1為抑制ADAM17基因的有效siRNA篩選。
[0073] 圖2為siRNA-AD-08免疫印跡實(shí)驗(yàn)。
[0074] 圖3為siRNA-AD-08下調(diào)炎癥因子。
[0075] 圖4為siRNA結(jié)構(gòu)對(duì)靶基因沉默效果的影響。
[0076] 圖5為硫代磷酸（P-S鍵）的修飾位置示意圖。
[0077] 圖6為化學(xué)修飾增強(qiáng)寡聚核酸血清穩(wěn)定性。
[0078] 圖7為大鼠組織病理切片分析。
[0079] 圖8為大鼠關(guān)節(jié)液炎癥因子含量。

【具體實(shí)施方式】
[0080] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0081] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0082] hFLS細(xì)胞（人成纖維樣滑膜細(xì)胞）為Cell Applications產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為 408_05aD
[0083] 293T細(xì)胞為ATCC產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為CRL-3216。
[0084] MCF-7細(xì)胞為ATCC產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為HTB-22。
[0085] Human IL-I β immunoassay檢測(cè)試劑盒為AssayPro產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為 EI2200-1。
[0086] pGCsi-Hl/Neo在文獻(xiàn)"季國(guó)忠，張發(fā)明，黃曙等.Smad4/DPC4基因小發(fā)夾RNA質(zhì)粒 表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定[J].醫(yī)學(xué)研宄生學(xué)報(bào)，2006，19(11) :973-977"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從 廣州市銳博生物科技有限公司獲得。
[0087] Lipofectamine2000 試劑盒為 Invitrogen 產(chǎn)品。
[0088] 雄性SD大鼠（220±20g)為廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心產(chǎn)品。
[0089] 下述實(shí)施例中的SiRNA均為雙鏈SiRNA分子，注射大鼠的各注射液的溶劑均為 PBS0
[0090] 實(shí)施例1、抑制ADAM17基因 mRNA表達(dá)的有效寡聚核酸的篩選
[0091] 一、進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì)以確定靶向于ADAM17的siRNA，并進(jìn)行生物信息篩選，確保 序列對(duì)于ADAM17序列是特異性的且對(duì)于來(lái)自任何其他基因的序列不是特異性的。靶序列 使用NCBI提供的BLAST搜索引擎相對(duì)于GenBank中的序列進(jìn)行核對(duì)，經(jīng)過(guò)初步實(shí)驗(yàn)篩選 出 8 個(gè)有效 siRNA，分別命名為 siRNA-AD-01、siRNA-AD-02、siRNA-AD-03、siRNA-AD-04、 siRNA-AD-05、siRNA-AD-06、siRNA-AD-07、siRNA-AD-08。以上 siRNA 為針對(duì) ADAM17 基因 序列不同位置設(shè)計(jì)的siRNA。
[0092] 二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0093] 實(shí)驗(yàn)分為 10 組，分別為 siRNA-AD-01 至 siRNA-AD-08 實(shí)驗(yàn)組，Notarget (NTC)為 陰性對(duì)照組、NC為空白對(duì)照組。
[0094] siRNA-AD-01至siRNA-AD-08實(shí)驗(yàn)組的設(shè)置方法如下：
[0095] 將hFLS細(xì)胞用0. 25 %的胰酶進(jìn)行消化，用DMEM培養(yǎng)基制成濃度為I X IO4個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液，將其接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔500ul，當(dāng)hFLS細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即 生長(zhǎng)達(dá)80%融合成片）時(shí)，按照Lipofectamine2000試劑盒的說(shuō)明書(shū)，將各個(gè)對(duì)應(yīng)的siRNA 按照50nM的終濃度轉(zhuǎn)染hFLS細(xì)胞。
[0096] No target (NTC)陰性對(duì)照組：將實(shí)驗(yàn)組的siRNA替換為隨機(jī)非特異siRNA，其余步 驟不變。其中，隨機(jī)非特異siRNA不是特異針對(duì)于靶基因（ADAM17基因）所設(shè)計(jì)的siRNA :
[0097] 正義鏈：5' -AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3' ；
[0098] 反義鏈：5' -GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3'。
[0099] NC空白對(duì)照組：不加 siRNA，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組一致。
[0100] 三、在轉(zhuǎn)染24h后收集各組hFLS細(xì)胞，于IOOOrpm離心5分鐘，去除上清，Trizol 法提取各組的RNA。
[0101] 四、將各組的RNA反轉(zhuǎn)錄為CDNA，以各組的CDNA為模板，以ADAM17-F1和 ADAM17-R1為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，以β -actin為內(nèi)參基因。
[0102] ADAM17-F1:5 ' -GGACCAGGGAGGGAAATA-3，
[0103] ADAM17-R1:3' -TTGCTGTGGACGACGTTG-5'
[0104] 圖1表明，經(jīng)過(guò)前期篩選獲得的8個(gè)有效siRNA中，siRNA-AD-08對(duì)ADAM17的沉 默效果最好，抑制了 86%的基因表達(dá)量。
[0105] 其中siRNA-AD-08正義鏈的序列如SEQ ID No. 1所示，反義鏈的序列如SEQ ID No. 2所示。
[0106] siRNA-AD-08 正義鏈：5,-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3'（SEQ ID No. I)
[0107] siRNA-AD-08 反義鏈：5, -UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3,（SEQ ID No. 2)
[0108] 五、Western blot 檢測(cè)
[0109] 取siRNA-AD-08實(shí)驗(yàn)組的hFLS細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2遍，倒 掉PBS，加入適量預(yù)冷的2XLysis Buffer，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，置于冰上充分裂解細(xì)胞 30min，于低溫離心機(jī)4°C，12000g，離心15min，取上清液，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，最 后將樣品蛋白的終濃度均調(diào)整為2 μ g/ μ 1，于_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩７謩e取12 μ g總蛋白 量的樣品，加入等體積的2X loading buffer上樣緩沖液。將二者充分混勻后，在沸水中煮 浴10分鐘，4°C存放備用。根據(jù)目的蛋白分子量大小配制相應(yīng)濃度的膠（10%的SDS-PAGE 分離膠和5 %的濃縮膠），等膠制備好后，將梳子拔去后用電泳緩沖液清洗上樣孔，將之前 準(zhǔn)備好的樣品上樣，每孔加入蛋白樣品，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，在4°C， 400mA恒流條件下電轉(zhuǎn)2小時(shí)，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后進(jìn)行顯色和曝光分析。
[0110] 同時(shí)以NC空白對(duì)照組和No target (NTC)陰性對(duì)照組進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。結(jié) 果如圖2所示。
[0111] 圖2中，Control為NC空白對(duì)照組，no target為No target (NTC)陰性對(duì)照組， siRNA 為 siRNA-AD-08 實(shí)驗(yàn)組。
[0112] 圖2表明，siRNA-AD-08顯著抑制了 ADAM17的蛋白表達(dá)，后續(xù)選用siRNA-AD-08做 進(jìn)一步的分析。
[0113] 實(shí)施例2、寡聚核酸對(duì)炎癥因子的抑制
[0114] 一、實(shí)驗(yàn)分為如下各組：
[0115] 1^1^-8丨1?隱-40-08實(shí)驗(yàn)組：原代培養(yǎng)1^1^細(xì)胞至6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度約50%時(shí)， 按照Lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，將siRNA-AD-08按照50nM的終濃度轉(zhuǎn)染hFLS細(xì) 胞。
[0116] MCF-7-siRNA-AD-08實(shí)驗(yàn)組：原代培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞至6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度約50% 時(shí)，按照Lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，將siRNA-AD-08按照50nM的終濃度轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞。
[0117] hFLS-No target (NTC)陰性對(duì)照組：將 hFLS-siRNA-AD-08 實(shí)驗(yàn)組的 siRNA 替換為 隨機(jī)非特異siRNA，其余步驟不變。其中，隨機(jī)非特異siRNA不是特異針對(duì)于靶基因（ADAM17 基因）所設(shè)計(jì)的siRNA :
[0118] 正義鏈：5' -AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3' ；
[0119] 反義鏈：5 ' -GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3 '。
[0120] MCF-7-No target (NTC)陰性對(duì)照組：將 MCF-7-siRNA-AD-08 實(shí)驗(yàn)組的 siRNA 替 換為隨機(jī)非特異siRNA，其余步驟不變。其中，隨機(jī)非特異siRNA不是特異針對(duì)于靶基因 (ADAM17基因）所設(shè)計(jì)的siRNA :
[0121] 正義鏈：5' -AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3' ；
[0122] 反義鏈：5' -GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3'。
[0123] hFLS-NC空白對(duì)照組：hFLS-siRNA-AD-08實(shí)驗(yàn)組中不加 siRNA，其余步驟與 hFLS-siRNA-AD-08 實(shí)驗(yàn)組一致。
[0124] MCF-7-NC空白對(duì)照組：MCF-7-siRNA-AD-08實(shí)驗(yàn)組中不加 siRNA，其余步驟與 MCF-7-siRNA-AD-08 實(shí)驗(yàn)組一致。
[0125] 二、轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，換無(wú)血清饑餓培養(yǎng)各組細(xì)胞24小時(shí)。
[0126] 三、在各組細(xì)胞中加入IL l-α，使其終濃度為l〇ng/ml，刺激24小時(shí)。
[0127] 四、提取各組細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以各組的cDNA為模板，分別以TNF-F和 TNF-R為引物，以cox2-F和cox2-R為引物，以IL-1I3-F和IL-Iii-R為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 定量PCR，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)TNF、C0X-2和IL-Ιβ基因的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參基因。
[0128] TNF-F: 5，-CGAGTGACAAGCCTGTAGCC-3，；
[0129] TNF-R: 5 ' -TGAAGAGGACCTGGGAGTAGAT-3 '。
[0130] cox2-F :5'-CAGGGTTGCTGGTGGTAGGA-3' ；
[0131] cox2-R :5'-GCATAAAGCGTTTGCGGTAC-3' 〇
[0132] IL-Iβ -F :5'-ACGAATCTCCGACCACCA-3' ；
[0133] IL-Iβ -R :5'-GGACCAGACATCACCAAGC-3'。
[0134] 結(jié)果如圖3中A所示。
[0135] 圖3Α中的NTC組均表示的是在之后的步驟中加入上述IL 1- α的NTC組。
[0136] 收集各組細(xì)胞的上清液，利用Human IL-I β immunoassay檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì) 胞IL-I β的分泌水平。
[0137] 其中，上述的NTC組又分別設(shè)如下各組：
[0138] hFLS-No target (NTC+)陰性對(duì)照組：hFLS-No target (NTC)陰性對(duì)照組在之后的 步驟中加入上述IL l-α。
[0139] hFLS-No target (NTC-)陰性對(duì)照組：hFLS-No target (NTC)陰性對(duì)照組在之后的 步驟中不加入上述IL l-α。
[0140] MCF-7-No target (NTC+)陰性對(duì)照組：MCF-7-No target (NTC)陰性對(duì)照組在之后 的步驟中加入上述IL l-α。
[0141] MCF-7-No target (NTC-)陰性對(duì)照組：MCF-7-No target (NTC)陰性對(duì)照組在之后 的步驟中不加入上述IL l-α。
[0142] 結(jié)果如圖3中B所示。
[0143] 圖3表明，分別與NTC或NTC+相比，siRNA-AD-08在MCF-7與hFLS細(xì)胞中均能有 效抑制C0X-2和IL-I β炎癥因子的基因表達(dá)量，并抑制IL-I β的分泌，其中在hFLS細(xì)胞 中對(duì)IL-I β的基因抑制率達(dá)到88%。在MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染siRNA-AD-08后TNF的基因表 達(dá)量高于NTC組，可能是由TNF的細(xì)胞功能比較復(fù)雜引起的。
[0144] 實(shí)施例3、同源寡聚核酸對(duì)ADAM17基因抑制效果的驗(yàn)證
[0145] 為驗(yàn)證同源比率對(duì)siRNA-AD-08抑ADAM17基因效果的影響，進(jìn)行以下三組實(shí)驗(yàn)：
[0146] 一、第一組實(shí)驗(yàn)
[0147] 第一組的 siRNA 反義鏈均為 "5' -UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3' "
[0148] ，正義鏈為"5' -GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3' "的同源序列，如表1所示。
[0149] 表1反義鏈組
[0150]

【權(quán)利要求】
1. 一種化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子，是由如下A所示的siRNA分子中至少一條鏈經(jīng)過(guò) 如下（1)-(13)所示的任意化學(xué)修飾后互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子： A、一種siRNA分子，為如下1)或2)所不： 1. SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈和SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA 分子； 2. SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈有60%以上同源性 的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子； 或，SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈和與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有60%以上同源 性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子； 或，與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1 所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子； (1) 磷酸骨架的硫代磷酸修飾； (2) 核糖或脫氧核糖的2' -甲氧基修飾； (3) 核糖或脫氧核糖的2' -氟修飾； (4) 鎖核酸修飾； (5) 開(kāi)環(huán)核酸修飾； (6) 吲哚修飾； (7) 堿基的5 -甲基胞嘧啶修飾； (8) 堿基的5-乙炔基尿嘧啶修飾； (9) 單鏈5'末端膽固醇修飾； (10) 單鏈3'末端半乳糖修飾； (11) 單鏈5'末端多肽修飾； (12) 單鏈5'末端磷酸化修飾； (13) 單鏈5'末端焚光標(biāo)記修飾。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子，其特征在于：所述化學(xué)修飾后 互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子的正義鏈和反義鏈分別具有如下B1和C1所示的序列： Bl、5' -K' -L' P' M' UCAUGUAUCUGAA P' M' M' dTdT-3' ； Cl、5，-R' -Q' Q' L' UUCAGAUACAUGA Q' L' P' dTdT-3' ； 所述K'為5'末端膽固醇修飾； 所述R'為無(wú)修飾或5'末端磷酸化修飾； 所述dT為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸； 所述L'、M'、P'和Q'分別為脫氧核糖的2' -甲氧基修飾的鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷酸、脫 氧核糖的2' -甲氧基修飾的腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖的2' -甲氧基修飾的胞嘧啶 脫氧核糖核苷酸和核糖的2' -甲氧基修飾的尿嘧啶核糖核苷酸； 或， 所述L'、M'、P'和Q'分別為鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷酸、腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、胞嘧啶脫 氧核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸。 3?-種siRNA分子，為如下⑴或⑵所不： (l)SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈和SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA 分子； (2) SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈有60%以上同源 性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子； 或，SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈和與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有60%以上同源 性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子； 或，與SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1 所示的RNA單鏈有70%以上同源性的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的siRNA分子，其特征在于：所述與SEQ ID No. 2所示的RNA單 鏈有70%以上同源性的RNA單鏈和與SEQ ID No. 1所示的RNA單鏈有70%以上同源性的 RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子為SEQ ID No. 3所示的單鏈和SEQ ID No. 4所示的單 鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子。
5. -種能產(chǎn)生權(quán)利要求3所述的siRNA分子的DNA分子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于：所述siRNA分子為SEQ ID No. 1所 示的RNA單鏈和SEQ ID No. 2所示的RNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈siRNA分子； 所述DNA分子為含有SEQ ID No. 5中自5'末端起第38-56位核苷酸的DNA分子，具體 為含有SEQ ID No. 5所示的DNA單鏈和SEQ ID No. 6所示的DNA單鏈互補(bǔ)而成的雙鏈DNA 的DNA分子，再具體為SEQ ID No. 5所示的DNA單鏈和SEQ ID No. 6所示的DNA單鏈互補(bǔ)而 成的雙鏈DNA的分子替換pGCsi-Hl/Neo的BamHI和Hindlll酶切位點(diǎn)間序列，pGCsi-Hl/ Neo的其余序列不變得到的重組siRNA表達(dá)質(zhì)粒。
7. -種試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求1或2所述的化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子、權(quán)利 要求3或4所述的siRNA分子和/或權(quán)利要求5或6所述的DNA分子。
8. 權(quán)利要求1或2所述的化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子、權(quán)利要求3或4所述的siRNA 分子和/或權(quán)利要求5或6所述的DNA分子和/或權(quán)利要求7所述的試劑盒在制備預(yù)防和 /或治療炎癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述炎癥具體為關(guān)節(jié)炎癥，再具體為骨關(guān)節(jié)炎。
9. 權(quán)利要求1或2所述的化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子、權(quán)利要求3或4所述的siRNA 分子和/或權(quán)利要求5或6所述的DNA分子和/或權(quán)利要求7所述的試劑盒在制備如下 D1-D4任一所示的產(chǎn)品中的應(yīng)用： D1、抑制關(guān)節(jié)表面纖維化的產(chǎn)品； D2、抑制軟骨侵蝕的產(chǎn)品； D3、預(yù)防和/或治療滑膜炎的產(chǎn)品； D4、保護(hù)軟骨和/或滑膜的產(chǎn)品。
10. 權(quán)利要求1或2所述的化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子、權(quán)利要求3或4所述的siRNA 分子和/或權(quán)利要求5或6所述的DNA分子和/或權(quán)利要求7所述的試劑盒在制備如下 E1-E6任一所示的產(chǎn)品中的應(yīng)用： E1、預(yù)防和/或治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品； E2、預(yù)防和/或治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的產(chǎn)品； E3、預(yù)防和/或治療多發(fā)性硬化癥的產(chǎn)品； E4、預(yù)防和/或治療急性感染病的產(chǎn)品； E5、預(yù)防和/或治療特應(yīng)性皮炎的產(chǎn)品； E6、預(yù)防和/或治療牛皮癬的產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】A61P19/04GK104498498SQ201410827650
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】張必良, 米其·托爾托雷, 王喆, 楊秀群, 王秋云 申請(qǐng)人:廣州市銳博生物科技有限公司, 中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院