本發(fā)明屬于天然藥物提取檢測(cè)領(lǐng)域。它涉及一種中藥的微量提取方法，具體地說(shuō)，它涉及由離子液體作為洗脫劑，結(jié)合微量基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)，用來(lái)提取中藥枳殼中黃酮類(lèi)有效成分的新方法。

背景技術(shù)：
枳殼(Fructusaurantii)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種或甜橙(CitrussinensisOsbeck)的干燥幼果。性溫，味苦、辛、酸，性微寒，歸脾胃經(jīng)。具有理氣寬中行滯消脹之功效，主治胸肋氣滯、脹滿(mǎn)疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停及胃下垂，脫肛，子宮脫垂等?，F(xiàn)代研究表明，枳殼中主要含有揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)成分。黃酮類(lèi)成分是評(píng)價(jià)枳殼飲片質(zhì)量的主要指標(biāo)，包括新圣草苷、異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及新枸桔苷等，其中又以新橙皮苷和柚皮苷含量最大。目前，對(duì)中藥進(jìn)行提取分析的方法層出不窮。通常采用的提取方法包括超聲回流法、索氏提取法等，這一類(lèi)方法存在的缺陷也是顯而易見(jiàn)：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用有毒害的有機(jī)溶劑且用量較大，提取所用時(shí)間漫長(zhǎng)，提取效率低下，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員身體有害，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，背離“綠色化學(xué)”的倡議。近年發(fā)展起來(lái)各種樣品預(yù)處理技術(shù)，固相萃取(Solid-PhaseExtraction，簡(jiǎn)稱(chēng)SPE)作為具有代表性的一種，廣泛地應(yīng)用在食品、環(huán)境、醫(yī)藥、化工、商檢等領(lǐng)域。隨著科技的發(fā)展，諸多建立在SPE基礎(chǔ)上的新型提取方法，也隨之應(yīng)運(yùn)而生?；|(zhì)固相分散萃取(MSPD)是建立在固相萃取基礎(chǔ)上的一種新型樣品處理技術(shù)，為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱門(mén)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的SPE不同，MSPD是將樣品與固相吸附劑直接混合研磨，將樣品研磨成為微小的碎片分散在固相吸附劑中，然后將此混合物填入固相萃取柱，用適當(dāng)?shù)娜軇⒛繕?biāo)化合物洗脫下來(lái)。當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道的基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)，特別是針對(duì)天然產(chǎn)物領(lǐng)域，其吸附劑的量、藥材用量和以及洗脫劑的用量較大，且為有毒害的有機(jī)溶劑，對(duì)操作員的身體有害，對(duì)環(huán)境又會(huì)造成污染。作為近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一的環(huán)境友好型溶劑——離子液體，是傳統(tǒng)有毒有機(jī)溶劑的理想替代品。目前，國(guó)內(nèi)外已有一些將離子液體用于萃取分離的報(bào)道。截止目前，以離子液體作為洗脫劑，并結(jié)合基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)，在中藥的活性成分提取檢測(cè)方面尚未見(jiàn)報(bào)道，該方法對(duì)于中藥枳殼的提取檢測(cè)這一研究領(lǐng)域更是一片空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于尋求一種比常規(guī)方法更加綠色環(huán)保的中藥提取檢測(cè)技術(shù)，使其應(yīng)用于枳殼藥材提取檢測(cè)。發(fā)明要點(diǎn)在于創(chuàng)造性地將離子液作為洗脫劑，應(yīng)用在基質(zhì)固相分散萃取領(lǐng)域。離子液作為基質(zhì)固相分散萃取的洗脫劑與基質(zhì)固相分散混合物中的目標(biāo)分子吸附結(jié)合，從而使得目標(biāo)分子從吸附劑中解吸出來(lái)，得到含有目標(biāo)分子的洗脫液。且本發(fā)明在一個(gè)微量體系中實(shí)施，所用藥材以及實(shí)驗(yàn)藥品試劑均在微克級(jí)別。另外，本實(shí)驗(yàn)所用的洗脫液為離子液的水溶液，相比藥典的提取方法使用甲醇作為提取液，本發(fā)明的有機(jī)溶劑使用量為零，使得本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)流程中不含任何有毒有害的有機(jī)溶劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作員和外界環(huán)境的毒害作用降低到零。本發(fā)明具體提供了一種以離子液體作為洗脫劑，結(jié)合基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)，提取微量中藥藥材中目標(biāo)分子的方法?？捎糜谔崛z測(cè)微量枳殼藥材中的黃酮類(lèi)有效成分。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種提取中藥枳殼中黃酮類(lèi)有效成分的方法，所述黃酮類(lèi)有效成分為新橙皮苷、柚皮苷中的一種或兩種，所述方法包括以下步驟：取枳殼藥材粉末和弗羅里硅土，以質(zhì)量比1:1～4混合，加入研缽中研磨，得研磨后的固體混合物；取固相萃取柱，固相萃取柱的底部加入篩板，將研磨后的固體混合物加入固相萃取柱中，填料填實(shí)后頂部再加入篩板，將填好的固相萃取柱置于固相萃取儀上，取洗脫劑，注入固相萃取柱內(nèi)，打開(kāi)固相萃取儀的抽氣泵，對(duì)固相萃取柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，洗脫結(jié)束后，將洗脫液渦旋、離心，取上層清液即為黃酮類(lèi)有效成分提取液；所述洗脫劑為濃度150～300mmol/L的離子液體水溶液；本發(fā)明所述離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、溴化1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸鹽、溴化1-己基-3-甲基咪唑或1-己基吡啶四氟硼酸鹽，優(yōu)選為1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽。本發(fā)明所述離子液均可于市場(chǎng)上直接購(gòu)買(mǎi)獲得，本發(fā)明實(shí)施例中所用的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽購(gòu)于AlfaAesar公司。本發(fā)明所述離子液體水溶液中離子液體的濃度為150～300mmol/L，優(yōu)選為250mmol/L。所述枳殼藥材粉末和弗羅里硅土的質(zhì)量比為1:1～4，優(yōu)選1:3。所述研磨的時(shí)間為0.5～1.25min，優(yōu)選為1min。本發(fā)明所述離子液體水溶液的體積用量?jī)?yōu)選以枳殼藥材粉末的質(zhì)量計(jì)為0.006～0.012mL/mg，優(yōu)選為0.008mL/mg。所述固相萃取柱有不同體積規(guī)格，根據(jù)枳殼藥材粉末和弗羅里硅土研磨后固體混合物的體積量來(lái)選擇合適體積的固相萃取柱即可，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所述離心優(yōu)選在13000rpmin離心5min。進(jìn)一步，本發(fā)明方法針對(duì)微量樣品，優(yōu)選按以下步驟操作：稱(chēng)取枳殼藥材粉末50mg，按照質(zhì)量比1:3稱(chēng)取弗羅里硅土150mg，加入研缽中研磨1min，得研磨后的固體混合物；取3mL規(guī)格固相萃取柱，底部加入篩板，將研磨后的固體混合物加入固相萃取柱中，填料填實(shí)后頂部再加入篩板，將填好的小柱置于固相萃取儀上，量取0.4mL的濃度250mmol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽的水溶液，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，洗脫結(jié)束后，將洗脫液渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min，取上層清液即為黃酮類(lèi)有效成分提取液。本發(fā)明可通過(guò)超高效液相色譜儀(UPLC)測(cè)定枳殼藥材中有效成分的含量來(lái)表征該基質(zhì)固相分散萃取方法的有效性。本發(fā)明制得的黃酮類(lèi)有效成分提取液可用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析，得到黃酮類(lèi)有效成分提取液的液相色譜圖；然后以新橙皮苷的對(duì)照品配制不同濃度的對(duì)照品溶液，按照黃酮類(lèi)有效成分提取液的同樣條件用超高效液相色譜儀檢測(cè)，獲得新橙皮苷對(duì)照品的液相色譜圖，以新橙皮苷對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以新橙皮苷對(duì)照品的液相色譜圖中色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，制作新橙皮苷素標(biāo)準(zhǔn)曲線，按同樣方法制作柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)黃酮類(lèi)有效成分提取液的液相色譜圖中各色譜峰的峰面積及各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到黃酮類(lèi)有效成分提取液中新橙皮苷、柚皮苷的含量，可相應(yīng)換算得到提取的新橙皮苷、柚皮苷相對(duì)于枳殼藥材粉末的含量。因此本發(fā)明方法可用于檢測(cè)微量的枳殼藥材粉末中的黃酮類(lèi)有效成分含量，具體的，所述方法為：稱(chēng)取枳殼藥材粉末50mg，按照質(zhì)量比1:3稱(chēng)取弗羅里硅土150mg，加入研缽中研磨1min，得研磨后的固體混合物；取3mL規(guī)格固相萃取柱，底部加入篩板，將研磨后的固體混合物加入固相萃取柱中，填料填實(shí)后頂部再加入篩板，將填好的小柱置于固相萃取儀上，量取0.4mL的濃度250mmol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽的水溶液，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，洗脫結(jié)束后，將洗脫液渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min，取上層清液即為黃酮類(lèi)有效成分提取液；黃酮類(lèi)有效成分提取液用超高效液相色譜儀采樣分析，得到黃酮類(lèi)有效成分提取液的液相色譜圖；然后以新橙皮苷的對(duì)照品配制不同濃度的對(duì)照品溶液，按照黃酮類(lèi)有效成分提取液的同樣條件用超高效液相色譜儀檢測(cè)，獲得新橙皮苷對(duì)照品的液相色譜圖，以新橙皮苷對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以新橙皮苷對(duì)照品的液相色譜圖中色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，制作新橙皮苷素標(biāo)準(zhǔn)曲線，按同樣方法制作柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)黃酮類(lèi)有效成分提取液的液相色譜圖中各色譜峰的峰面積及各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到黃酮類(lèi)有效成分提取液中新橙皮苷、柚皮苷的含量，可相應(yīng)換算得到提取的新橙皮苷、柚皮苷相對(duì)于枳殼藥材粉末的含量。本發(fā)明檢測(cè)微量的枳殼藥材粉末中的黃酮類(lèi)有效成分的檢測(cè)限可達(dá)新橙皮苷0.0499ng，柚皮苷0.0560ng，對(duì)微量樣品具有很好的提取檢測(cè)效果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1.本發(fā)明方法屬首次以離子液體作為洗脫劑應(yīng)用在基質(zhì)固相分散萃取領(lǐng)域，具有獨(dú)創(chuàng)性，在國(guó)內(nèi)外的期刊專(zhuān)利中，均未報(bào)道使用離子液體作為洗脫劑的案例，并且將該方案應(yīng)用到天然產(chǎn)物(中藥枳殼)的提取檢測(cè)中，亦屬首例。2.本方法采用了微量體系下進(jìn)行提取檢測(cè)，采用的藥材、吸附劑、洗脫劑的用量極低，且安全環(huán)保無(wú)污染。中國(guó)藥典常規(guī)的提取方法為：取本品粗粉約0.2g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1.5小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。相比藥典的提取方法，本發(fā)明的方法使用的有機(jī)溶劑為零，這就使得該技術(shù)方案對(duì)操作人員的毒害降低至零，對(duì)環(huán)境的污染也降低至零。并且本發(fā)明所得提取液中有效成分的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藥典的提取方法，提取效率更高。3.本發(fā)明所述的離子液體，具備一系列優(yōu)異突出的的物理化學(xué)性質(zhì)：首先是對(duì)人體和環(huán)境的無(wú)毒害、無(wú)污染，完全符合“綠色化學(xué)”所倡導(dǎo)的概念，且離子液本身化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性良好，對(duì)人體無(wú)毒、不污染環(huán)境，不燃，使得操作人員的實(shí)驗(yàn)環(huán)境安全可靠。4.本發(fā)明提供的操作環(huán)境安全，操作步驟簡(jiǎn)潔明了，實(shí)驗(yàn)效率高，操作人員無(wú)需專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)即可開(kāi)展操作。即本發(fā)明創(chuàng)造性地提供了一種中藥的微量提取方法，該方法采用離子液體作為洗脫劑，結(jié)合基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)，能高效、環(huán)保地提取和檢測(cè)枳殼藥材中的黃酮類(lèi)有效成分。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明基質(zhì)固相分散萃取方法的工藝流程圖。圖2為考察不同種類(lèi)離子液體的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖。圖中，1、2分別代表枳殼中的有效成分，分別為：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。A、B、C、D、E代表不同的離子液，分別為：A：溴化1-乙基-3-甲基咪唑、B：1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸鹽、C：溴化1-己基-3-甲基咪唑、D：1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、E：1-己基吡啶四氟硼酸鹽。圖3為考察不同濃度的離子液體水溶液的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖。圖中，1、2分別代表枳殼中的有效成分，分別為：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。圖中橫坐標(biāo)為離子液體水溶液的濃度，單位mM。圖4為考察不同體積離子液體水溶液的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖。圖中，1、2分別代表枳殼中的有效成分，分別為：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。圖中橫坐標(biāo)為離子液體水溶液的體積，單位mL。圖5為考察不同種類(lèi)吸附劑的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖。圖中，1、2分別代表枳殼中的有效成分，分別為：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。A、B、C、D代表不同種類(lèi)的吸附劑，分別為：A：弗羅里硅土、B：C18反向硅膠、C：硅膠、D：氧化鋁。圖6為考察藥材、弗羅里硅土在不同質(zhì)量比例條件下的的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖。圖中，1、2分別代表枳殼中的有效成分，分別為：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。圖中橫坐標(biāo)代表藥材、弗羅里硅土的質(zhì)量比。圖7為考察不同的研磨時(shí)間對(duì)基質(zhì)固相分散萃取效果影響的柱狀圖。圖中，1、2分別代表枳殼中的有效成分，分別為：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。圖中橫坐標(biāo)代表研磨時(shí)間，單位為min。圖8為本發(fā)明方法和藥典方法分別提取得到的提取液的液相色譜圖。圖中，1、2分別代表枳殼中的有效成分，分別為：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。A圖為參照藥典提取方法所得提取液的液相色譜圖、B圖為本發(fā)明方法提取得到的黃酮類(lèi)有效成分提取液的液相色譜圖。具體實(shí)施方式通過(guò)以下實(shí)例來(lái)對(duì)本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法進(jìn)行更為詳細(xì)的描述。由于其應(yīng)用范圍廣，故具體實(shí)施方案也多，下面將結(jié)合幾個(gè)實(shí)例的討論對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的闡述。但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。枳殼對(duì)照品溶液的制備方法具體步驟為：分別取新橙皮苷、柚皮苷的對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，混合置棕色量瓶中，加甲醇制成每lmL含新橙皮苷500μg、柚皮苷500μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。本發(fā)明實(shí)施例中所用的離子液體溴化1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸鹽、溴化1-己基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-己基吡啶四氟硼酸鹽購(gòu)于AlfaAesar公司。實(shí)施例1稱(chēng)取弗羅里硅土150mg、枳殼藥材粉末50mg各5份，分別加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物分別加入5支3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將所有填好的小柱置于固相萃取儀上。量取0.4mL不同種類(lèi)的離子液體水溶液，離子液體分別為溴化1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸鹽、溴化1-己基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-己基吡啶四氟硼酸鹽，上述5種離子液體水溶液的濃度均為250mM，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用分別用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液，即為黃酮類(lèi)有效成分提取液，分別取樣后，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。實(shí)施例所用儀器為WatersAcquityUplcH-Class。色譜柱：ACQUITYBEHC18，1.7μm，2.1×50mm(Waters)，檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm，柱溫：40℃，進(jìn)樣量：0.1μL，流速0.4mL/min，流動(dòng)相：A：0.1v％甲酸水，B：乙腈。梯度洗脫：0～2min，15％～20％B；2～4min，20％～30％B；4～6min，30％～50％B；6～8min，50％～100％B；8～9min，100％～100％B，9～10min，100％～15％B。后續(xù)實(shí)施例中的色譜條件均和實(shí)施例1相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1，表1中的數(shù)據(jù)為峰面積。表1.其中：A為溴化1-乙基-3-甲基咪唑、B為1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸鹽、C為溴化1-己基-3-甲基咪唑、D為1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、E為1-己基吡啶四氟硼酸鹽；1為新橙皮苷，2為柚皮苷。不同種類(lèi)離子液體的固相萃取效果柱狀圖如圖2所示。結(jié)果顯示，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽的效果最好，可能的原因是，相比其他種類(lèi)的離子液，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽這類(lèi)物質(zhì)對(duì)枳殼這兩類(lèi)活性成分作用力更強(qiáng)，反映在提取液外觀上，用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽作為洗脫劑的一組，顏色最深。實(shí)施例2稱(chēng)取弗羅里硅土150mg、枳殼藥材粉末50mg各4份，分別加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物分別加入4支3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將所有填好的小柱置于固相萃取儀上。量取0.4mL不同濃度(150mM、200mM、250mM、300mM)的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽水溶液，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液分別用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液裝樣，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表2，表2中的數(shù)據(jù)為峰面積。表2.其中：1為新橙皮苷，2為柚皮苷。不同的離子液體濃度的基質(zhì)固相分散萃取效果的柱狀圖如圖3所示。隨著離子液體濃度的增大，基質(zhì)固相萃取的效果逐步增大，直到離子液體濃度達(dá)到250mM時(shí)達(dá)到最佳，后隨著離子液體濃度的增大，萃取效果有下降趨勢(shì)，可能的原因是，離子液體濃度越大，對(duì)活性成分的吸附效果越明顯，但濃度過(guò)高會(huì)使得離子液體的水溶液粘度變大，不易被洗脫收集，最終影響了萃取效果，故250mM是最佳條件。實(shí)施例3稱(chēng)取弗羅里硅土150mg、枳殼藥材粉末50mg各4份，分別加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物分別加入4支3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將所有填好的小柱置于固相萃取儀上。量取不同體積(0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL)的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽水溶液，濃度250mM，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液裝樣，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表3，表3中的數(shù)據(jù)為峰面積。表3.其中：1為新橙皮苷，2為柚皮苷。不同體積離子液體水溶液的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，離子液體水溶液體積為0.3mL時(shí)，不能充分將固體混合物中的活性成分洗脫下來(lái)，但當(dāng)洗脫體積從0.4mL逐漸增大至0.5mL和0.6mL時(shí)，盡管能將混合固體充分洗脫，但由于用量過(guò)多，洗脫液濃度變稀，故最佳條件是0.4mL。實(shí)施例4稱(chēng)取150mg不同種類(lèi)的吸附劑(弗羅里硅土、C18反向硅膠、硅膠、氧化鋁)、以及枳殼藥材粉末50mg各4份，分別加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物分別加入4支3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將所有填好的小柱置于固相萃取儀上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽水溶液(濃度250mM)，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液裝樣，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表4，表4中的數(shù)據(jù)為峰面積。表4.其中，A為弗羅里硅土、B為C18反向硅膠、C為硅膠、D為氧化鋁；1為新橙皮苷，2為柚皮苷。不同種類(lèi)吸附劑的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖如圖5所示。結(jié)果顯示，吸附劑采用弗羅里硅土?xí)r，其萃取效果最佳，采用其他吸附劑所得洗脫液顏色較淺，色譜峰響應(yīng)也較低。且使用C18反向硅膠和硅膠作為吸附劑時(shí)，洗脫所耗時(shí)間僅為15s左右，使用氧化鋁時(shí)則洗脫時(shí)間為30s，洗脫時(shí)間過(guò)短將無(wú)法充分將活性成分洗脫下來(lái)。實(shí)施例5稱(chēng)取不同質(zhì)量(50mg、100mg、150mg、200mg)的弗羅里硅土，以及枳殼藥材粉末50mg各4份，分別加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物分別加入4支3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將所有填好的小柱置于固相萃取儀上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽水溶液(濃度250mM)，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液裝樣，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表5，表5中的數(shù)據(jù)為峰面積。表5.其中：1為新橙皮苷，2為柚皮苷。藥材和弗羅里硅土不同質(zhì)量比例對(duì)基質(zhì)固相分散萃取效果的影響見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，枳殼藥材:吸附劑的質(zhì)量比，從1:1變成1:2、1:3、1:4時(shí)，萃取效果先增大，后有減小趨勢(shì)。且4組的洗脫時(shí)間分別為3.5min、2min、60s、50s?？赡艿脑蚴俏絼┍旧頌楣腆w顆粒，中間有較多間隙，較少的吸附劑與藥材研磨后，藥渣能填充到吸附劑顆粒的縫隙中，使顆粒間的縫隙減少，加大了洗脫劑流過(guò)混合固體的阻力，使得洗脫時(shí)間變久，而由于吸附劑量較少，對(duì)活性成分的吸附也有限。隨著吸附劑量的增加，吸附劑顆粒之間的縫隙也逐漸增多，減少了洗脫劑流經(jīng)混合固體的阻力，減少了洗脫劑和混合固體的接觸時(shí)間，從而降低了萃取效果，故吸附劑的量過(guò)少和過(guò)多都會(huì)降低萃取效果，在一定范圍內(nèi)，增加吸附劑的用量，能夠更好地將枳殼藥材進(jìn)行研磨粉碎，將活性成分更好的吸附在吸附劑中，但過(guò)量加入的吸附劑同時(shí)也會(huì)對(duì)洗脫劑產(chǎn)生一定的吸附作用，使得洗脫劑在混合物中有較多的殘留，降低了萃取效果，故比例1:3是最佳條件。實(shí)施例6稱(chēng)取弗羅里硅土150mg、枳殼藥材粉末50mg各4份，分別加入研缽中研磨不同時(shí)間(0.5min、0.75min、1min、1.25min)。將混合均勻后的固體混合物分別加入4支3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將所有填好的小柱置于固相萃取儀上。量取不同體積0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽水溶液(濃度250mM)，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液裝樣，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表6，表6中的數(shù)據(jù)為峰面積。表6.其中：1為新橙皮苷，2為柚皮苷。不同研磨時(shí)間的基質(zhì)固相分散萃取效果柱狀圖如圖7所示。結(jié)果顯示，隨著研磨時(shí)間的增加，萃取效果先有增加趨勢(shì)并且在1min處達(dá)到最大值，后隨著研磨時(shí)間的增加，萃取效果有下降趨勢(shì)，可能的原因是，在一定范圍內(nèi)，研磨時(shí)間越充分，能使得吸附劑更好地吸收藥材粉末中的活性成分，但過(guò)度研磨，會(huì)導(dǎo)致吸附劑過(guò)量吸附藥材中的活性成分，使得洗脫變得困難，故最佳研磨時(shí)間是1min。。日內(nèi)精密度稱(chēng)取弗羅里硅土150mg、枳殼藥材粉末50mg，加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物加入3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將填好的小柱置于固相萃取儀上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽溶液水溶液(濃度250mM)，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液裝樣，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次。日間精密度稱(chēng)取弗羅里硅土150mg、枳殼藥材粉末50mg，加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物加入3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將填好的小柱置于固相萃取儀上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽溶液水溶液(濃度250mM)，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液裝樣，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。將該樣品連續(xù)進(jìn)樣3天，每天2次。日內(nèi)、日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總?cè)缦卤?：表7.其中：1為新橙皮苷，2為柚皮苷。重復(fù)性考察參照下列實(shí)驗(yàn)步驟，平行做5組，作為考察。稱(chēng)取弗羅里硅土150mg、枳殼藥材粉末50mg，加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物加入3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將填好的小柱置于固相萃取儀上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽溶液水溶液(濃度250mM)，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液裝樣，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。藥材含量測(cè)定稱(chēng)取弗羅里硅土150mg、枳殼藥材粉末50mg，加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物加入3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將填好的小柱置于固相萃取儀上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽溶液水溶液(濃度250mM)，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液，即為黃酮類(lèi)有效成分提取液，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。獲得提取液的液相色譜圖。圖8中B圖為黃酮類(lèi)有效成分提取液的液相色譜圖。圖中，1、2分別代表枳殼中不同的有效成分，分別為：1：新橙皮苷、2：柚皮苷，A圖為參照藥典提取方法所得提取液的液相色譜圖、B圖為本發(fā)明方法提取得到的黃酮類(lèi)有效成分提取液的液相色譜圖。以新橙皮苷、柚皮苷的對(duì)照品配制不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按同樣條件用超高效液相色譜檢測(cè)，獲得對(duì)照品溶液的色譜圖，以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液的色譜圖中色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，分別制作新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線和柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)提取液的液相色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到黃酮類(lèi)有效成分提取液中新橙皮苷、柚皮苷的含量，可相應(yīng)換算得到提取的新橙皮苷、柚皮苷相對(duì)于枳殼藥材粉末的含量，含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表9。2種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及檢測(cè)限和定量限如下表8所示：表8.其中：1為新橙皮苷，2為柚皮苷?；厥章蕦?shí)驗(yàn)稱(chēng)取弗羅里硅土150mg、枳殼藥材粉末50mg各2組，第一組加入新橙皮苷、柚皮苷的濃度各自均為50μg/mL的枳殼混標(biāo)10μL，第二組加入新橙皮苷、柚皮苷的濃度各自均為100μg/mL的枳殼混標(biāo)10μL，加入研缽中研磨1min。將混合均勻后的固體混合物分別加入3mL規(guī)格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入篩板，加入完畢后小柱的頂部再加入篩板。將填好的小柱置于固相萃取儀上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽溶液水溶液(濃度250mM)，注入小柱內(nèi)，啟動(dòng)固相萃取儀的抽氣泵(氣壓為-28.0bar)，對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用1.5mL規(guī)格離心管收集。洗脫結(jié)束后，將離心管內(nèi)液體渦旋10s后放入離心儀中，13000rpm離心5min。取上層清液裝樣，用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析。重復(fù)性、含量測(cè)定、回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總?cè)缦卤?：表9.其中：1為新橙皮苷，2為柚皮苷。結(jié)果表明，本發(fā)明方法的重復(fù)性良好，回收率高，檢測(cè)準(zhǔn)確性高。對(duì)照例：按照中國(guó)藥典中的提取方法為：取本品粗粉約0.2g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1.5小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。所得提取液用超高效液相色譜儀(UPLC)采樣分析，得到液相色譜圖(如圖8中A圖所示)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，可測(cè)得提取液中有效成分相對(duì)于陳皮藥材的含量為新橙皮苷57.5001mg/g，柚皮苷60.9046mg/g。而本申請(qǐng)方法制得的提取液中有效成分相對(duì)于陳皮藥材的含量為新橙皮苷123.4461mg/g，柚皮苷111.1667mg/g，提取得到的有效成分含量提高了2倍左右，提取效果優(yōu)秀。