一種云芝多糖提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種云芝多糖提取物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)深層發(fā)酵培養(yǎng)云芝菌絲體后，發(fā)酵產(chǎn)物分離出菌絲體和發(fā)酵液，菌絲體烘干，粉碎過(guò)篩脫脂干燥后，進(jìn)行熱水浸提并濃縮，得到浸提濃縮液；發(fā)酵液超濾去除小分子物質(zhì)后，濃縮，得到超濾濃縮液。超濾濃縮液和浸提濃縮液通過(guò)去蛋白、乙醇沉淀、雙氧水脫色，透析最后經(jīng)真空冷凍干燥，分別制得云芝胞內(nèi)多糖提取物和云芝胞外多糖提取物。本發(fā)明制備過(guò)程簡(jiǎn)單、可高效高質(zhì)大量生產(chǎn)，提取物對(duì)人體無(wú)毒害，具有良好降血脂的生理作用，可用于開發(fā)降血脂藥物或保健食品。
【專利說(shuō)明】一種云芝多糖提取物及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種云芝多糖提取物及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 通過(guò)液體深層發(fā)酵食藥用真菌菌絲體獲得發(fā)酵產(chǎn)物，一般可以分別提取菌絲體中 的胞內(nèi)多糖和發(fā)酵液中的胞外多糖。
[0003] 胡成旭等（2007)利用響應(yīng)面法研宄云芝菌絲體多糖的水提取工藝，求得最佳水 浸提條件為：提取溫度85°C，浸提時(shí)間105min，液料比27:1，云芝多糖的提取率為7. 27%。 Pan等（2010)等利用超聲輔助提取法研宄了云芝子實(shí)體多糖的最佳工藝參數(shù)，得出最佳的 超聲功率為30W，料液比為1:40,時(shí)間為8h，此條件下多糖的提取率可達(dá)到5. 95%。張桂 春等（2005)研宄了金頂側(cè)耳胞外多糖的最佳提取工藝是將母液濃縮到原體積的1/4,再用 75%的乙醇醇沉10h。王永敏等（2009)將蛹蟲草發(fā)酵清液濃縮至1/5后加3倍95%乙醇 沉淀12h，得多糖沉淀，并以Sevage法去除蛋白。Wang等（2011)將蛹蟲草發(fā)酵液濃縮，乙 醇沉淀多糖，用sevage法去蛋白，并透析冷凍干燥可得胞外粗多糖。Meng等（2010)等通過(guò) 響應(yīng)面法研宄羊肚菌深層培養(yǎng)的發(fā)酵液中胞外多糖的提取參數(shù)，包括發(fā)酵液的濃縮溫度， 乙醇沉淀時(shí)間及pH值。一方面利用子實(shí)體獲得多糖提取物，需耗費(fèi)大量資源，目前云芝子 實(shí)體生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，且產(chǎn)量有限，自然環(huán)境生長(zhǎng)采集的野生子實(shí)體數(shù)量稀少，用來(lái)提取多糖 成本高；另一方面利用半合成培養(yǎng)基深層發(fā)酵對(duì)所得的多糖成分影響較大，不利于分離純 化和生理功效鑒定。研宄發(fā)現(xiàn)，云芝多糖具有明顯免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、促進(jìn)受損肝細(xì) 胞恢復(fù)等作用，（鄭炯等，2007 ;王菲菲等，2012 ;Kang等，2013 ;梁語(yǔ)絲等，2014)，開發(fā)和利 用價(jià)值較大。目前云芝多糖提取物的生物活性或藥效的研宄大多在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng) 域。有關(guān)云芝液體深層發(fā)酵物降血脂作用的研宄尚未見到有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種云芝多糖提取 物的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的云芝多糖提取物，該云芝多 糖提取物培養(yǎng)簡(jiǎn)易高效、提取方法穩(wěn)定可靠、成本低。
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述云芝多糖提取物的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一種云芝多糖提取物的制備方法，包含如下步驟：
[0009] (1)云芝（Coriolus versicolor)液體深層發(fā)酵后，分離得到云芝菌絲體和發(fā)酵 液，其中，云芝菌絲體干燥粉碎并過(guò)篩后，脫脂，干燥，得到脫脂后的菌絲體；發(fā)酵液超濾去 除小分子物質(zhì)，得到云芝超濾液；
[0010] (2)熱水浸提脫脂后的菌絲體，得到含云芝胞內(nèi)多糖的浸提液；
[0011] (3)將步驟（1)得到的云芝超濾液和步驟（2)得到的浸提液分別濃縮，得到超濾濃 縮液和浸提濃縮液；
[0012] (4)將步驟（3)制備得到的超濾濃縮液和浸提濃縮液分別采用胰蛋白酶和Sevage 法去蛋白，得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞內(nèi)多糖提取液；
[0013] (5)用乙醇分別沉降步驟（4)得到的胞外多糖提取液和胞內(nèi)多糖提取液中的多 糖，然后離心分離得到沉淀，脫色透析干燥后，分別制得云芝胞內(nèi)提取物和云芝胞外多糖提 取物；
[0014] 步驟⑴中所述的干燥溫度優(yōu)選為50?55°C;所述的過(guò)篩篩目為14?40目；優(yōu) 選為40目；
[0015] 步驟（1)中所述的脫脂方法優(yōu)選為：菌絲體粉末與石油醚按體積比為1:2混勻，振 蕩或攪拌處理2?3d，脫去菌絲體中的脂質(zhì)，離心留沉淀；重復(fù)脫脂1?2次；
[0016] 步驟（1)中所述的超濾條件優(yōu)選為進(jìn)膜壓力為lObar，通量3?5L/min，物料溫度 22°C;所述的超濾優(yōu)選用1萬(wàn)分子量PS超濾膜超濾；
[0017] 步驟（2)中所述的熱水浸提的條件為：料液比為1:30,提取時(shí)間為2?3h，提取溫 度為90°C，提取次數(shù)為1?3次；
[0018] 步驟（2)中所述的熱水浸提的條件優(yōu)選為：料液比為1:30,提取時(shí)間為2h，提取溫 度為90°C，提取次數(shù)為2次；
[0019] 步驟（3)中所述的濃縮的溫度優(yōu)選為55°C?60°C ;優(yōu)選為60°C ;
[0020] 步驟（5)中所述的乙醇用量為多糖提取液體積的3?5倍；
[0021]步驟（5)中所述的沉降的溫度為0?25°C，沉降的時(shí)間為12?48h;
[0022] 步驟（5)中所述的脫色透析干燥的方法為：用水溶解沉淀并調(diào)節(jié)多糖溶液pH至 8. 0;然后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H202溶液，于50?55°C水浴保溫2?3h，對(duì)其進(jìn)行氧化 脫色處理；然后將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的透析袋中透析2?3d，每 8?10h更換一次水；對(duì)透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮，并真空冷凍干燥，獲得云芝多糖提取 物；所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H 202溶液的用量為每100mL多糖液滴加2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% 的H20 2溶液；
[0023] 步驟⑷中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步驟：
[0024] ①將步驟（3)制備得到的濃縮液分別調(diào)pH至8.0;然后將胰蛋白酶加入濃縮液中 充分混合并37°C振蕩30?60min，再水浴滅酶10?15min，冷卻至室溫；
[0025] ②去蛋白后的濃縮液加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液，劇烈振蕩30?40min; 然后離心，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液；
[0026] ③重復(fù)步驟②2?3次，得到去蛋白后的多糖提取液；
[0027] 步驟①所述的胰蛋白酶的初始濃度優(yōu)選為2% (W/V);所述的胰蛋白酶的用量為 濃縮液體積的（1:10)?（1:20);
[0028] 步驟①所述的滅酶溫度優(yōu)選為100°C ;
[0029] 步驟①所述的胰蛋白酶加入濃縮液充分混合的具體操作優(yōu)選為：配制2% (W/V) 的胰蛋白酶溶液，將步驟（3)制備得到的濃縮液調(diào)pH至8.0;然后將胰蛋白酶溶液和濃縮 液分別37°C水浴預(yù)熱10?15min，將預(yù)熱后的胰蛋白酶溶液和發(fā)酵濃縮液充分混合；
[0030] 步驟②所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的體積比為5:1 ;
[0031]步驟②所述的離心轉(zhuǎn)速為8000?lOOOOrpm，所述的離心時(shí)間為10?15min;
[0032] 步驟（1)中所述的云芝（Coriolus versicolor)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方法，優(yōu)選 包含如下步驟：
[0033] ( I )將云芝斜面母種活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至斜面固體培養(yǎng)基中，24?27°C培養(yǎng)10? 15d，直至菌絲鋪滿斜面為止，得到云芝斜面菌種；
[0034] ( II )從步驟（I )制備得到的云芝斜面菌種上挑取4?6菌塊，接種至200mL的 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后，在150rpm，27的條件下振蕩培養(yǎng) 6d，制得一級(jí)種子液；
[0035] (III)將步驟（II )制備得到的一級(jí)種子液轉(zhuǎn)入50L種子罐培養(yǎng)二級(jí)種子液，接種 量為7 %，培養(yǎng)溫度為27°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05?0. 07MPa，通氣量1. 5m3/h (V: V為 1:0. 6)，培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件溫度，轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通 氣量為12m3/h，培養(yǎng)3?5d;
[0036] 步驟（I )所述的斜面固體培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋 白胨 lg，（NH4)2S042g，MgS04 ? 7H20 lg，KH2P04lg，瓊脂 20g，加蒸餾水定容至 1000mL，pH 調(diào)至 6. 5；
[0037] 步驟（II )和（III)中用于一級(jí)種子液和二級(jí)種子液培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng) 基配方為：步驟（1)中所述的云芝液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖50g，NH 4N032g， KH2P042g，MgS0 4 ? 7H20 lg，維生素 &0? 05g，水 1000mL，pH 6. 5 ;
[0038] 一種云芝多糖提取物，根據(jù)上述制備方法制備得到；
[0039] 所述的云芝胞內(nèi)多糖提取物（IPCV)中總糖、還原糖、蛋白質(zhì)含量分別為 66. 58%?69. 53%，3. 14%?3. 74%，0. 36%?0? 40%;胞外多糖提取物（EPCV)中總糖、 還原糖、蛋白質(zhì)含量分別為63. 91%?64. 89%，3. 08%?3. 48%，0. 17%?0? 22%;
[0040] 所述的云芝多糖提取物具有良好的降血脂作用，顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，具 有抗動(dòng)脈粥樣硬化的能力，可作為生產(chǎn)云芝多糖提取物降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物與保 健食品開發(fā)的原料；
[0041] 所述的云芝胞內(nèi)多糖提取物在降血脂藥物與保健食品應(yīng)用中的使用劑量為50mg/ (kg ? d)，云芝胞外多糖提取物的使用劑量為200mg/ (kg ? d);
[0042] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0043] (1)本發(fā)明的云芝多糖提取物，采用中式發(fā)酵罐生產(chǎn)，從菌絲體中獲得云芝胞內(nèi)多 糖提取物，從發(fā)酵液中獲得胞外多糖提取物，不但制備過(guò)程簡(jiǎn)單，條件易控制，而且可大批 量工廠化生產(chǎn)。
[0044] (2)本發(fā)明使用葡萄糖和硝酸銨作為碳氮源的合成培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，不但培養(yǎng)基 成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，發(fā)酵效率高，而且多糖質(zhì)量穩(wěn)定、易于分離純化，特別重要的是發(fā)酵的 多糖測(cè)定不受培養(yǎng)基中糖含量的影響。
[0045] (3)使用不同云芝菌株液體發(fā)酵，多糖產(chǎn)率和活性有所差異。本發(fā)明采用的云芝菌 株，性狀優(yōu)良，適宜用于液體發(fā)酵產(chǎn)多糖，其產(chǎn)率高。
[0046] (4)本發(fā)明采用活化的斜面菌塊接種于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得一級(jí)種子液，可以縮 短液體種制備周期，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，而不需另外制備菌液。
[0047] (5)本發(fā)明所得胞外多糖提取物，來(lái)源于云芝液體深層發(fā)酵液，而且提取過(guò)程中安 全可控，具有對(duì)人體無(wú)毒害的優(yōu)點(diǎn)。
[0048] (6)本發(fā)明所得云芝胞內(nèi)多糖提取物溶解性好，胞外多糖提取物有少量難溶物，兩 者均具有良好的降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049] 圖1為云芝多糖提取物對(duì)小鼠血清TC的影響圖。
[0050] 圖2為云芝多糖提取物對(duì)小鼠血清TG的影響圖。
[0051] 圖3為云芝多糖提取物對(duì)小鼠血清LDL-C的影響圖。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0053] 實(shí)施例中涉及到的培養(yǎng)基配方：
[0054] 斜面固體培養(yǎng)基配方：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋白胨lg，（NH4)2S0 42g， MgS04 ? 7H20 lg，KH2P04lg，瓊脂 20g，加蒸餾水定容至 1000mL，pH 調(diào)至 6. 5 ;
[0055] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖50g，NH4N032g，KH2P0 42g，MgS04 ? 7H201g，維生素 E^O. 05g，水 1000mL，pH 6. 5;
[0056] 云芝（Coriolus versicolor)菌株由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供（張峰源， 張松，曾劍鋒.羅煒杰，云芝、靈芝和柱狀田頭菇胞外多糖對(duì)果蠅壽命的影響.生命科學(xué) 研宄，11 (2) : 130-133, 2007.);
[0057]實(shí)施例1
[0058] (1)云芝（Coriolus versicolor)經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體 深層發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌絲體和發(fā)酵液，具體方法如下：
[0059] ①斜面或平板菌種培養(yǎng)：將活化后的云芝斜面母種菌絲塊接入新的斜面固體培養(yǎng) 基中，24°C培養(yǎng)10d，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0060] ②一級(jí)液體菌種培養(yǎng)：取200mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500mL三角瓶，在121°C滅菌 20min，并接入4個(gè)黃豆大小的的云芝母種菌絲塊；室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后在 27°C，轉(zhuǎn)速150rpm，避光恒溫振蕩培養(yǎng)6天，得到一級(jí)種子液；
[0061] ③二級(jí)液體菌種培養(yǎng)：50L種子罐裝入液體發(fā)酵培養(yǎng)基35L，125°C滅菌20min ;冷 卻后接入2. 45L培養(yǎng)好的一級(jí)種子液，培養(yǎng)溫度為27°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05? 0. 07MPa，通氣量約1. 5m3/h(V:V為1:0. 6)培養(yǎng)3天，取樣觀察可發(fā)現(xiàn)到種子液清澈透亮， 菌絲體豐富，大小均勻。
[0062] ④液體深層發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的二級(jí)種子液轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條 件溫度，轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通氣量約為12m 3/h，培養(yǎng)4d;
[0063] (2)將發(fā)酵產(chǎn)物通過(guò)高速離心獲得菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)1萬(wàn)分子量PS超濾 膜超濾去除小分子物質(zhì)后，濃縮至20L，得到云芝超濾液，其中，超濾條件為：進(jìn)膜壓力約為 10bar，通量3L/min，物料溫度22°C。
[0064] (3)將云芝菌絲體55°C烘干粉碎過(guò)40目篩后，進(jìn)行脫脂處理（菌絲體粉末與石油 醚按體積比為1:2混勻，振蕩或攪拌處理3d，脫去菌絲體中的脂質(zhì)，離心留沉淀；重復(fù)脫脂2 次）并干燥；然后以料液比為1:30,提取時(shí)間為2h，提取溫度為90°C，提取次數(shù)為2次的工 藝參數(shù)熱水浸提胞內(nèi)多糖，獲得含有云芝胞內(nèi)多糖的浸提液；
[0065] (4)濃縮：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將步驟（2)得到的云芝超濾液和步驟（3)得到的浸提液 分別在60°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體積的1/10,得到超濾濃縮液和浸提濃縮液；
[0066] (5)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、離心：稱取2. 0g胰蛋白酶溶于100mL蒸餾水中， 再把1000mL的濃縮液調(diào)pH至8. 0,將酶液及濃縮液同時(shí)放入37°C水浴鍋中預(yù)熱lOmin，把 兩者充分混合，并振蕩保持30min后放入100°C水浴鍋中滅酶10min，冷卻至室溫；然后加 入0.2倍體積的氯仿正丁醇混合液（氯仿：正丁醇（V:V) = 5:1)，劇烈震蕩30min，然后 8000rpm離心10min，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液，此過(guò)程重復(fù)2次；
[0067] (6)在去蛋白后的多糖溶液中加入4倍體積的乙醇，放于4°C冰箱冷藏2d，待析出 粗多糖，離心得到沉淀；用少量蒸餾水溶解沉淀，調(diào)節(jié)多糖溶液pH至8. 0,然后滴加30%的 H202 (每100mL多糖液滴加2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H202溶液），在50°C下水浴保溫2h，對(duì)其 進(jìn)行脫色素處理；之后，將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的透析袋中以蒸餾 水透析約3d，每8h更換一次蒸餾水。最后，對(duì)透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮，并真空冷凍干 燥，獲得云芝胞內(nèi)和胞外多糖提取物（IPCV和EPCV)。
[0068] 云芝胞內(nèi)和胞外多糖提取物，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定含總糖分別為66. 58 %和 63. 91 %，經(jīng)DNS比色法測(cè)定含還原糖分別為3. 14%和3. 08%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測(cè)定含蛋白 分別為〇? 36%和0? 17%。
[0069] 實(shí)施例2
[0070] (1)云芝（Coriolus versicolor)經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體 深層發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌絲體和發(fā)酵液，具體方法件如下：
[0071] ①斜面或平板菌種培養(yǎng)：將活化后的云芝斜面母種菌絲塊接入新的斜面固體培養(yǎng) 基中，25°C培養(yǎng)12d，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0072] ②一級(jí)液體菌種培養(yǎng)：取200mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500mL三角瓶，在121°C滅菌 20min，并接入6個(gè)黃豆大小的的云芝母種菌絲塊；室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后在 27°C，轉(zhuǎn)速150rpm，避光恒溫振蕩培養(yǎng)6天，得到一級(jí)種子液；
[0073] ③二級(jí)液體菌種培養(yǎng)：50L種子罐裝入液體發(fā)酵培養(yǎng)基35L，125°C滅菌20min;冷 卻后接入2. 45L培養(yǎng)好的一級(jí)種子液，培養(yǎng)溫度為27°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05? 0. 07MPa，通氣量約1. 5m3/h(V:V為1:0. 6)培養(yǎng)3天，取樣觀察可發(fā)現(xiàn)到種子液清澈透亮， 菌絲體豐富，大小均勻。
[0074] ④液體深層發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的二級(jí)種子液轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條 件溫度，轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通氣量約為12m 3/h，培養(yǎng)5d;
[0075] (2)將發(fā)酵產(chǎn)物通過(guò)高速離心獲得菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)1萬(wàn)分子量PS超濾 膜超濾去除小分子物質(zhì)后，濃縮至20L，得到云芝超濾液，其中，超濾條件為：進(jìn)膜壓力約為 10bar，通量5L/min，物料溫度22°C。
[0076] (3)將云芝菌絲體50°C烘干粉碎過(guò)40目篩后，進(jìn)行脫脂處理（菌絲體粉末與石油 醚按體積比為1:2混勻，振蕩或攪拌處理3d，脫去菌絲體中的脂質(zhì)，離心留沉淀；重復(fù)脫脂2 次）并干燥；然后以料液比為1:30,提取時(shí)間為3h，提取溫度為90°C，提取次數(shù)為3次的工 藝參數(shù)熱水浸提胞內(nèi)多糖，獲得含有云芝胞內(nèi)多糖的浸提液；
[0077] (4)濃縮：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將步驟（2)得到的云芝超濾液和步驟（3)得到的浸提液 分別在60°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體積的1/7,得到超濾濃縮液和浸提濃縮液；
[0078] (5)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、離心：稱取2. 0g胰蛋白酶溶于100mL蒸餾水中， 再把1000mL的濃縮液調(diào)pH至8. 0,將酶液及濃縮液同時(shí)放入37°C水浴鍋中預(yù)熱12min，把 兩者充分混合，并振蕩保持40min后放入100°C水浴鍋中滅酶12min，冷卻至室溫；然后加 入0.2倍體積的氯仿正丁醇混合液（氯仿：正丁醇（V:V) = 5:1)，劇烈震蕩35min，然后 8500rpm離心12min，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液，此過(guò)程重復(fù)2次；
[0079] (6)在去蛋白后的多糖溶液中加入3倍體積的乙醇，置于25°C沉降ld，待析出粗 多糖，離心得到沉淀；用少量蒸餾水溶解沉淀，調(diào)節(jié)多糖溶液pH至8. 0,然后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為30 %的H202 (每100mL多糖液滴加2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的H202溶液），在55 °C下水浴保 溫3h，對(duì)其進(jìn)行脫色素處理；之后，將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的透析 袋中以蒸餾水透析約3d，每9h更換一次蒸餾水。最后，對(duì)透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮，并真 空冷凍干燥，獲得云芝胞內(nèi)和胞外多糖提取物（IPCV和EPCV)。
[0080] 云芝胞內(nèi)和胞外多糖提取物，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定含總糖68. 78%和64. 92%，經(jīng) DNS比色法測(cè)定含還原糖3. 60%和3. 32%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測(cè)定含蛋白0. 39%和0. 21%。
[0081] 實(shí)施例3
[0082] (1)云芝（Coriolus versicolor)經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體 深層發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌絲體和發(fā)酵液，具體方法件如下：
[0083] ①斜面或平板菌種培養(yǎng)：將活化后的云芝斜面母種菌絲塊接入新的斜面固體培養(yǎng) 基中，27°C培養(yǎng)15d，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0084] ②一級(jí)液體菌種培養(yǎng)：取200mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500mL三角瓶，在121°C滅菌 20min，并接入5個(gè)黃豆大小的的云芝母種菌絲塊；室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后在 27°C，轉(zhuǎn)速150rpm，避光恒溫振蕩培養(yǎng)6天，得到一級(jí)種子液；
[0085] ③二級(jí)液體菌種培養(yǎng)：50L種子罐裝入液體發(fā)酵培養(yǎng)基35L，125°C滅菌20min;冷 卻后接入2. 45L培養(yǎng)好的一級(jí)種子液，培養(yǎng)溫度為27°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05? 0. 07MPa，通氣量約1. 5m3/h(V:V為1:0. 6)培養(yǎng)3天，取樣觀察可發(fā)現(xiàn)到種子液清澈透亮， 菌絲體豐富，大小均勻。
[0086] ④液體深層發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的二級(jí)種子液轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條 件溫度，轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通氣量約為12m 3/h，培養(yǎng)3d;
[0087] (2)將發(fā)酵產(chǎn)物通過(guò)高速離心獲得菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)1萬(wàn)分子量PS超濾 膜超濾去除小分子物質(zhì)后，濃縮至20L，得到云芝超濾液，其中，超濾條件為：進(jìn)膜壓力約為 10bar，通量4L/min，物料溫度22°C。
[0088] (3)將云芝菌絲體55°C烘干粉碎過(guò)40目篩后，進(jìn)行脫脂處理（菌絲體粉末與石油 醚按體積比為1:2混勻，振蕩或攪拌處理2d，脫去菌絲體中的脂質(zhì)，離心留沉淀；重復(fù)脫脂1 次）并干燥；然后以料液比為1:30,提取時(shí)間為3h，提取溫度為90°C，提取次數(shù)為3次的工 藝參數(shù)熱水浸提胞內(nèi)多糖，獲得含有云芝胞內(nèi)多糖的浸提液；
[0089] (4)濃縮：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將步驟⑵得到的云芝超濾液和步驟⑶得到的浸提液 分別在55°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體積的1/5,得到超濾濃縮液和浸提濃縮液；
[0090] (5)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、離心：稱取2. 0g胰蛋白酶溶于100mL蒸餾水中， 再把1000mL的濃縮液調(diào)pH至8. 0,將酶液及濃縮液同時(shí)放入37°C水浴鍋中預(yù)熱15min，把 兩者充分混合，并振蕩保持60min后放入100°C水浴鍋中滅酶15min，冷卻至室溫；然后加 入0.2倍體積的氯仿正丁醇混合液（氯仿：正丁醇（V:V) = 5:1)，劇烈震蕩40min，然后 9000rpm離心15min，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液，此過(guò)程重復(fù)3次；
[0091] (6)在去蛋白后的多糖溶液中加入5倍體積的乙醇，置于8°C沉降12h，待析出粗 多糖，離心得到沉淀；用少量蒸餾水溶解沉淀，調(diào)節(jié)多糖溶液pH至8. 0,然后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為30 %的H202 (每1 OOmL多糖液滴加2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的H202溶液），在52 °C下水浴保 溫2. 5h，對(duì)其進(jìn)行脫色素處理；之后，將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的透 析袋中以蒸餾水透析約2d，每10h更換一次蒸餾水。最后，對(duì)透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮， 并真空冷凍干燥，獲得云芝胞內(nèi)和胞外多糖提取物（IPCV和EPCV)。
[0092] 云芝胞內(nèi)和胞外多糖提取物，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定含總糖69. 53%和64. 89%，經(jīng) DNS比色法測(cè)定含還原糖3. 74%和3. 48%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測(cè)定含蛋白0. 40%和0. 22%。
[0093] 實(shí)施例4
[0094] (1)云芝多糖提取物（實(shí)施例1制備得到）降血脂作用的實(shí)驗(yàn)（高劑量）
[0095] ①昆明種小鼠，SPF級(jí)別，雄性，體重18?22g，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可 證號(hào)4〇((粵）2011-0029 ;高脂飼料（配方為：10%豬油、1.0%膽固醇、0.3%膽鹽、88.7% 普通飼料），購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證號(hào)：SCK(粵）2008-0002。小鼠用普通 飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)4d后，根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組，高脂模型組，陽(yáng)性對(duì)照組（辛伐 他汀，lOmgAkg ? d))，200mgAkg ? d)多糖提取物高劑量組，每組小鼠數(shù)為10只。實(shí)驗(yàn)期間 小鼠自由飲水，定量給食。所有小鼠飼養(yǎng)于溫度為18?22°C，相對(duì)濕度為50%?60%，有 自然光照的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。除正常對(duì)照組小鼠給予普通飼料外，其他各實(shí)驗(yàn)組給予高脂 飼料，每只小鼠5g/d(后兩周增至6g/d)。采取預(yù)防模式給藥：即高脂飼料建模與給藥同時(shí) 進(jìn)行。每天上午定時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)處理組小鼠灌胃各藥物一次，每只小鼠灌胃量均為〇.5mL，正常 對(duì)照組和高脂模型組灌胃等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行28d。實(shí)驗(yàn)期間每周稱量一次體重，每 日觀察小鼠攝食，自主活動(dòng)情況。
[0096] ②最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，斷頸取血，分離得血清后分別檢測(cè)血脂 四項(xiàng)指標(biāo)TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。取血后迅速解剖小鼠，取其心臟，肝臟、腎臟、脾臟， 并計(jì)算心指數(shù)、肝指數(shù)、腎指數(shù)和脾指數(shù)（以臟器鮮重/體重表示）。
[0097] (2)云芝多糖提取物（實(shí)施例1制備得到）降血脂作用的實(shí)驗(yàn)（中劑量）
[0098] 方法同步驟（1)，其中，各處理組分別為正常對(duì)照組，高脂模型組，陽(yáng)性對(duì)照組（辛 伐他汀，l〇mg/(kg ? d))，100mg/(kg ? d)多糖提取物中劑量組，每組小鼠數(shù)為10只。
[0099] (3)云芝多糖提取物（實(shí)施例1制備得到）降血脂作用的實(shí)驗(yàn)（低劑量）
[0100] 方法同步驟（1)，其中，各處理組分別為正常對(duì)照組，高脂模型組，陽(yáng)性對(duì)照組（辛 伐他汀，l〇mg/ (kg ? d))，50mg/ (kg ? d)多糖提取物低劑量組，每組小鼠數(shù)為10只。②同步 驟⑴。
[0101] 上述（1)、⑵、（3)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1，表2和表3所示。
[0102] 由表1可知，小鼠攝食高脂飼料至最后一天，與正常對(duì)照組相比，高脂模型組小鼠 血清中TC的含量極顯著地升高了 104. 72% (P〈0. 01);由表2可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，相對(duì)正常 對(duì)照組，小鼠攝食高脂飼料使得其血清LDL-C、HDL-C和動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)AI極顯著地升高 285. 14%，56. 16%和44. 20% (P〈0. 01)，以上說(shuō)明攝入外源性高脂成分使得小鼠體內(nèi)脂質(zhì) 水平極顯著升高，是典型的脂質(zhì)代謝紊亂癥狀，這提示本實(shí)驗(yàn)小鼠高脂血癥模型已成功建 立。
[0103] 表1云芝多糖提取物對(duì)小鼠血清TC及TG水平的影響
[0104]

【權(quán)利要求】
1. 一種云芝多糖提取物的制備方法，其特征在于包含如下步驟： (1) 云芝（Coriolus versicolor)液體深層發(fā)酵后，分離得到云芝菌絲體和發(fā)酵液，其 中，云芝菌絲體干燥粉碎并過(guò)篩后，脫脂，干燥，得到脫脂后的菌絲體；發(fā)酵液超濾去除小分 子物質(zhì)，得到云芝超濾液； (2) 熱水浸提脫脂后的菌絲體，得到含云芝胞內(nèi)多糖的浸提液； (3) 將步驟（1)得到的云芝超濾液和步驟（2)得到的浸提液分別濃縮，得到超濾濃縮液 和浸提濃縮液； (4) 將步驟（3)制備得到的超濾濃縮液和浸提濃縮液分別采用胰蛋白酶和Sevage法去 蛋白，得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞內(nèi)多糖提取液； (5) 用乙醇分別沉降步驟（4)得到的胞外多糖提取液和胞內(nèi)多糖提取液中的多糖， 然后離心分離得到沉淀，脫色透析干燥后，分別制得云芝胞內(nèi)提取物和云芝胞外多糖提取 物； 步驟（4)中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步驟： ① 將步驟（3)制備得到的濃縮液分別調(diào)pH至8.0 ;然后將胰蛋白酶加入濃縮液中充分 混合并37°C振蕩30?60min，再水浴滅酶10?15min，冷卻至室溫； ② 去蛋白后的濃縮液加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液，劇烈振蕩30?40min ;然 后離心，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液； ③ 重復(fù)步驟②2?3次，得到去蛋白后的多糖提取液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（1)中所述的脫脂方法為：菌絲體粉末與石油醚按體積比為1:2混勻，振蕩或攪拌 處理2?3d，脫去菌絲體中的脂質(zhì)，離心留沉淀；重復(fù)脫脂1?2次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（1)中所述的超濾條件為進(jìn)膜壓力為l〇bar，通量3?5L/min，物料溫度22°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（2)中所述的熱水浸提的條件為：料液比為1:30,提取時(shí)間為2?3h，提取溫度為 90°C，提取次數(shù)為1?3次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（5)中所述的脫色透析干燥的方法為：用水溶解沉淀并調(diào)節(jié)多糖溶液pH至8. 0 ; 然后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H202溶液，于50?55°C水浴保溫2?3h，對(duì)其進(jìn)行氧化脫色 處理；然后將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的透析袋中透析2?3d，每8? l〇h更換一次水；對(duì)透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮，并真空冷凍干燥，獲得云芝多糖提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（1)中所述的云芝（Coriolus versicolor)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方法，優(yōu)選包含 如下步驟： (I )將云芝斜面母種活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至斜面固體培養(yǎng)基中，24?27°C培養(yǎng)10?15d， 直至菌絲鋪滿斜面為止，得到云芝斜面菌種； (II )從步驟（I )制備得到的云芝斜面菌種上挑取4?6菌塊，接種至200mL的液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中，室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后，在150rpm，27的條件下振蕩培養(yǎng)6d，制 得一級(jí)種子液； (Ill)將步驟（II )制備得到的一級(jí)種子液轉(zhuǎn)入50L種子罐培養(yǎng)二級(jí)種子液，接種量為 7%，培養(yǎng)溫度為27°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0? 05?0? 07MPa，通氣量1. 5m3/h，培養(yǎng)3d后 轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件溫度，轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通氣量為12m3/h，培 養(yǎng)3?5d〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的云芝多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（I )所述的斜面固體培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨lg， (NH4)2S042g，MgS04 ? 7H20 lg，KH2P04lg，瓊月旨 20g，加蒸餾水定容至 1000mL，pH 調(diào)至 6. 5。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的云芝多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（II )和（III)中用于一級(jí)種子液和二級(jí)種子液培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方 為：步驟（1)中所述的云芝液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖50g，NH4N032g，KH 2P042g， MgS04 ? 7H20 lg，維生素 &0? 05g，水 1000mL，pH 6. 5。
9. 一種云芝多糖提取物，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1?8任一項(xiàng)所述的制備方法制備 得到。
10. 權(quán)利要求9所述的云芝多糖提取物在制備降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物或保健食 品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/715GK104450826SQ201410857383
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】張松, 張命龍 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)