附加唾液酸化糖鏈的多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供附加有高均一性的唾液酸化糖鏈且具有干擾素β活性的多肽。所述附加糖鏈的多肽是在選自下述(1)至(4)：(1)由序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，(2)在由序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽中，刪除、置換或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的多肽，(3)為干擾素β的類似物的多肽，以及(4)相對(duì)于由序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有80％以上同源性的多肽，所構(gòu)成的組中的任一多肽中，有4至6處的氨基酸以附加糖鏈的氨基酸置換，且該糖鏈的非還原末端皆被唾液酸化的附加糖鏈的多肽。
【專利說(shuō)明】附加唾液酸化糖鏈的多肽

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于附加唾液酸化糖鏈的多肽。更具體而言，是關(guān)于附加有高均一性的 唾液酸化糖鏈且具有干擾素 β活性的多肽。

【背景技術(shù)】
[0002] 天然的人類干擾素 β (IFN-β)是由166個(gè)氨基酸殘基所構(gòu)成的糖蛋白質(zhì)。已知 干擾素 β屬于細(xì)胞激素（cytokine)家族，參與免疫調(diào)節(jié)作用、抗病毒活性、細(xì)胞增殖抑制 作用。此外，人類干擾素 β，于天然的氨基酸序列中的第17位、31位、141位具有3個(gè)Cys， 于第80位的Asn具有1個(gè)復(fù)合型之N連接型寡糖。此外，已知于第31位及第141位的Cys 處具有二硫鍵。
[0003] 作為藥物的干擾素 β利用細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制造，依使其表達(dá)的宿主的不同而分 類為IFN-P-Ia或IFN-β-lb。IFN-β-la，在使用中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢（CHO)細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng) 中表達(dá)，與天然干擾素 β同樣，為具有糖鏈的糖蛋白質(zhì)。另一方面，IFN-P-Ib在大腸桿菌 中表達(dá)，為不具有糖鏈的蛋白質(zhì)。
[0004] 已知IFN-β -la，與IFN-β -Ib相比，在免疫原性、抗病毒活性及抗腫瘤特性方面， 具有更強(qiáng)的效能。而且，已知在糖蛋白質(zhì)中所含的糖鏈結(jié)構(gòu)對(duì)于藥物動(dòng)力學(xué)具有強(qiáng)影響力。
[0005] 此外，已知若使聚乙二醇（PEG)等水溶性聚合物結(jié)合于蛋白質(zhì)，則將帶來(lái)蛋白質(zhì) 的物理穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、血漿中穩(wěn)定性的提高等效果。目前存在有關(guān)以PEG修飾的IFN- β 的報(bào)道，這些效果受到期待。例如，有關(guān)于對(duì)IFN-β -Ib的N末端施行PEG修飾而得到的 IFN- β復(fù)合物的報(bào)道（專利文獻(xiàn)1、2)。此外，也存在有關(guān)對(duì)IFN- β -Ia的N末端施行PEG 修飾而得到的IFN-β復(fù)合物的報(bào)道（專利文獻(xiàn)3)。這些修飾，雖然也許確實(shí)可賦予蛋白質(zhì) 上述穩(wěn)定性等，但另一方面擔(dān)心會(huì)使作為藥物的IFN-β的活性降低。例如，據(jù)報(bào)道在PEG 的分子量為2萬(wàn)以上的情況，活性急劇地降低（非專利文獻(xiàn)1)。
[0006] 考慮PEG修飾的上述擔(dān)心，而選擇縱使結(jié)合高分子量的PEG亦可維持IFN- β的活 性的位置，施行部位特異性PEG修飾的報(bào)道（專利文獻(xiàn)4)亦存在。但是，PEG是不存在于 活體內(nèi)的化合物，有關(guān)長(zhǎng)期施用PEG修飾IFN-β的情況的蓄積性、安全性、有效性尚未被充 分研究而未被確立。
[0007] 同時(shí)，亦存在有關(guān)部位特異性地施行糖鏈修飾而得到的IFN-β復(fù)合物的報(bào)道 (專利文獻(xiàn)5)。在專利文獻(xiàn)5中，對(duì)于天然型IFN-β的氨基酸序列，以使其具有共有序列 (Asn-X-Ser/Thr)的方式導(dǎo)入氨基酸突變，并使用CHO細(xì)胞來(lái)表達(dá)，其中該共有序列為N連 接型糖鏈的識(shí)別部位。但是，在該方法中，為了導(dǎo)入共有序列，在附加糖鏈的氨基酸以外之 處亦發(fā)生氨基酸突變。此外，已知在CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，一般會(huì)發(fā)生糖鏈的不均一性。
[0008] [先前技術(shù)文獻(xiàn)]
[0009] [專利文獻(xiàn)]
[0010] [專利文獻(xiàn)1]美國(guó)專利申請(qǐng)案公開(kāi)第2009/0214472號(hào)說(shuō)明書(shū)
[0011] [專利文獻(xiàn)2]美國(guó)專利第7829659號(hào)說(shuō)明書(shū)
[0012] [專利文獻(xiàn)3]美國(guó)專利第7446173號(hào)說(shuō)明書(shū)
[0013] [專利文獻(xiàn)4]國(guó)際公開(kāi)第2005/019260號(hào)
[0014] [專利文獻(xiàn)5]國(guó)際公開(kāi)第02/074806號(hào) [0015][非專利文獻(xiàn)]
[0016][非專利文獻(xiàn) 1]J. Control. Rel.第 88 卷，第 35-42 頁(yè)（2003)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017][發(fā)明所要解決的問(wèn)題]
[0018] 為了使干擾素 β的物理的穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、血漿中穩(wěn)定性等提高，如上述，存在 以PEG修飾干擾素 β的多肽的例子。但是，在以PEG修飾的情況中，如上述，干擾素 β作 為藥物的活性有時(shí)會(huì)降低。此外，由于PEG不是存在于活體內(nèi)的物質(zhì)，所以有在活體內(nèi)蓄積 而造成藥害的擔(dān)心。
[0019] 另一方面，亦存在以糖鏈修飾干擾素 β的多肽的例子。但是，例如，通過(guò)在CHO細(xì) 胞中的表達(dá)而制造附加糖鏈的干擾素 β的情況，如上述，已知在所附加的糖鏈的種類或附 加的位置方面發(fā)生不均一性。在糖鏈為不均一的情況中，作為醫(yī)藥品時(shí)，亦有可能造成各批 次間藥效上有所差異；此外，就天然型附加糖鏈的干擾素 β而言，有所謂血中滯留時(shí)間短 的缺點(diǎn)。
[0020] [用于解決問(wèn)題的手段]
[0021] 本發(fā)明的發(fā)明人等為了解決上述問(wèn)題而反復(fù)深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對(duì)于干擾素 β 的多肽，通過(guò)以其中的糖鏈的所有的非還原末端皆被唾液酸化的附加糖鏈的氨基酸，置換4 至6處的氨基酸，可得到與天然人類干擾素 β相比血中滯留性更為優(yōu)異，且抗腫瘤活性更 為優(yōu)異的附加糖鏈的多肽。
[0022] 亦即，在本發(fā)明的一方面中，是關(guān)于具有干擾素 β活性的附加糖鏈的多肽，其特 征為該附加糖鏈的多肽是在選自下述（1)至（4):
[0023] (1)由序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，
[0024] (2)在由序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽中，刪除、置換或附加1個(gè)或多 個(gè)氨基酸而成的多肽，
[0025] (3)為干擾素 β的類似物的多肽，以及
[0026] (4)相對(duì)于由序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，具有80%以上同源性 (homology)的多肽，
[0027] 所構(gòu)成的組中的任一多肽中，有4至6處的氨基酸以附加糖鏈的氨基酸置換，且該 糖鏈的所有的非還原末端皆被唾液酸化的附加糖鏈的多肽。
[0028] 在本發(fā)明的一方面中，該各附加糖鏈的氨基酸，可各自獨(dú)立地為附加糖鏈的Cys 或附加糖鏈的Asn。
[0029] 在本發(fā)明的一方面中，該各附加糖鏈的氨基酸中的糖鏈，皆可各自獨(dú)立地選自二 唾液酸糖鏈、三唾液酸糖鏈、及四唾液酸糖鏈所構(gòu)成的組。
[0030] 在本發(fā)明的一方面中，該各附加糖鏈的氨基酸中的糖鏈，皆可各自獨(dú)立地選自下 述式（1)、式（2)、式（3)及式（4)所構(gòu)成的組：
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 附加糖鏈的多肽，所述附加糖鏈的多肽具有干擾素0活性，其特征為所述附加糖鏈 的多肽是在選自由下述（1)至（4)所構(gòu)成的組中的任一多肽中，有4至6處的氨基酸以附 加糖鏈的氨基酸置換，且所述糖鏈的所有的非還原末端皆被唾液酸化的附加糖鏈的多肽： (1) 由序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽， (2) 在由序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽中，刪除、置換或附加1個(gè)或多個(gè)氨 基酸而成的多肽， ⑶為干擾素@的類似物的多肽，以及 ⑷相對(duì)于由序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，具有80%以上同源性的多肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基酸各自獨(dú)立地 為附加糖鏈的Cys或附加糖鏈的Asn。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基酸中的糖 鏈，皆各自獨(dú)立地選自二唾液酸糖鏈、三唾液酸糖鏈及四唾液酸糖鏈所構(gòu)成的組。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基酸 中的糖鏈，皆各自獨(dú)立地選自下述式（1)、式（2)、式（3)及式（4)所構(gòu)成的組：

5. 如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基酸 中的糖鏈皆相同。
6. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基 酸中的至少一個(gè)存在于序列編號(hào)1所示的氨基酸序列中，與選自第1位、3位、7位、24位、 25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、 70 位、75 位、79 位、99 位、103 位、106 位、107 位、109 位、112 位、115 位、123 位、130 位、136 位、139位及164位所構(gòu)成的組中的位置相當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 7. 如權(quán)利要求6所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基酸中的至少一 個(gè)存在于序列編號(hào)1所示的氨基酸序列中，與選自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、 107位、112位、123位、及第136位所構(gòu)成的組中的位置相當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 8. 如權(quán)利要求6所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基酸中的至少3個(gè) 存在于序列編號(hào)1所示的氨基酸序列中，與選自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、107 位、112位、123位及136位所構(gòu)成的組中的位置相當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 9. 如權(quán)利要求6所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基酸皆不存在于 序列編號(hào)1所示的氨基酸序列中，與第2位、5位、6位、9位、12位、13位、16位、19位、20位、 23位、27位、33位、37位、39位、40位、43位、53位、54位、55位、57位、58位、61位、62位、 64 位、65 位、68 位、69 位、73 位、78 位、83 位、86 位、87 位、90 位、93 位、94 位、100 位、124 位、 125 位、128 位、131 位、132 位、138 位、141 位、142 位、145 位、148 位、149 位、152 位、153 位、 156位、159位、160位或163位的位置相當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 10. 如權(quán)利要求6所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基酸皆存在于序 列編號(hào)1所示的氨基酸序列中，與選自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、 35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、 103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位及164位所構(gòu)成 的組中的位置相當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 11. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述附加糖鏈的多肽是 化學(xué)合成的。
12. 醫(yī)藥組合物，其特征為所述醫(yī)藥組合物包含： (1) 如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的附加糖鏈的多肽及/或其藥學(xué)上可接受的鹽； 以及 (2) 藥理學(xué)上可接受的載體。
13. 如權(quán)利要求12所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述醫(yī)藥組合物用于與干擾素 P相關(guān)的 疾病的治療或預(yù)防。
14. 如權(quán)利要求13所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述與干擾素 P相關(guān)的疾病選自腦腫瘤、 皮膚惡性黑色素瘤、B型慢性活動(dòng)性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性 肝硬化及多發(fā)性硬化癥所構(gòu)成的組。
【文檔編號(hào)】A61K38/00GK104334574SQ201480001384
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月29日
【發(fā)明者】大內(nèi)政輝, 西原三佳, 手塚克成, 前田政敏, 梶原康宏, 坂本泉 申請(qǐng)人:株式會(huì)社糖鎖工學(xué)研究所