相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求于2013年2月8日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)61/762,545的優(yōu)先權(quán)利益，其內(nèi)容以其整體引入本文作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及來(lái)自茶科(theacea)植物的生物活性組合物、其制備方法，以及這些組合物的用途。該生物活性組合物適合用于特別是飲料、功能性食品、營(yíng)養(yǎng)品、添加物等。發(fā)明背景茶科(茶植物)包括喬木或者灌木，含有約40個(gè)屬和600個(gè)種。山茶(camelliasinensis)在茶科占有獨(dú)一無(wú)二的地位，因?yàn)樵撎厥獾闹参镂锓N主要用作生產(chǎn)全部三種基本種類(lèi)的茶：綠茶、烏龍茶和紅茶的單一原料來(lái)源(在本文中統(tǒng)稱(chēng)為“茶植物”)。按照某些來(lái)源，還有第四種茶，即所謂的“白茶”，其唯一地產(chǎn)自茶植物的芽和尖。三種基本的茶形式是由加工程度確定，其涉及相同的幼嫩茶樹(shù)葉。將該樹(shù)葉采摘、分類(lèi)、洗凈，并在蒸煮或干燥前進(jìn)行不同的氧化。術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵”往往用于描述茶的加工，但是術(shù)語(yǔ)“氧化”對(duì)于所發(fā)生的化學(xué)轉(zhuǎn)化是更為準(zhǔn)確的描述。盡管在加工過(guò)程中有些不同，但一般而言綠茶的氧化程度最低，而紅茶最高。烏龍茶被認(rèn)為是部分氧化，因此處于綠茶和紅茶之間。關(guān)于加工方式，綠茶和白茶之間的差別很小(或者根本沒(méi)有差別)。綠茶是由蒸制和凋萎并隨后立即干燥的新鮮樹(shù)葉制備。紅茶是由凋萎并在滾筒中粉碎、隨后氧化數(shù)小時(shí)、然后干燥的樹(shù)葉制備。烏龍茶是由僅部分氧化、然后干燥的樹(shù)葉制備。世界上，茶是第二種(在水之后)最普遍消費(fèi)的液體，且在美國(guó)是第六種(在水、軟飲料、咖啡、啤酒和牛奶之后)最普遍消費(fèi)的液體。茶的消費(fèi)在世界范圍內(nèi)持續(xù)增加，特別是由于對(duì)該液體的健康益處的公眾認(rèn)知不斷提高。日益增多的出版物提示了茶及其成分的抗血管生成、抗細(xì)菌、抗致癌、抗炎、抗誘變、抗氧化、抗感染和解毒的特性。茶的一系列益處還包括降低罹患風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)、降低膽固醇水平和抗糖尿病特性。并非所有這些益處都被證實(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。盡管如此，非常廣泛的茶的益處反映了具有非常強(qiáng)大的生物活性物質(zhì)的獨(dú)特組成，其存在于新鮮植物樹(shù)葉中，并且在傳統(tǒng)的茶葉加工過(guò)程中存留。具體而言，已經(jīng)報(bào)道過(guò)在山茶(camelliasinensis)的新鮮樹(shù)葉中包含22.2％多酚類(lèi)、17.2％蛋白質(zhì)、4.3％咖啡因、27.0％粗纖維、0.5％淀粉、3.5％還原糖、6.5％果膠、2.0％醚提取物和5.6％灰分(duke,j.a.,handbookofenergycrops(1983),參見(jiàn)www.hort.purdue.edu/newcrop/dukeenergy/camellia_sinensis.html)。據(jù)報(bào)道，每100g葉中包含8.0gh2o、24.5g蛋白質(zhì)、2.8g脂肪、58.8g總碳水化合物、8.7g纖維、5.9g灰分、327mgca、313mgp、24.3mgfe、50mgna、2700μgβ-胡蘿卜素當(dāng)量、0.07mg硫胺、0.8mg核黃素、7.6mg煙酸和9mg抗壞血酸。另一項(xiàng)報(bào)告記錄了8.0gh2o、28.3g蛋白質(zhì)、4.8g脂肪、53.6g總碳水化合物、9.6g纖維、5.6g灰分、245mgca、415mgp、18.9mgfe、60mgna、8400μgβ-胡蘿卜素當(dāng)量、0.38mg硫胺、1.24mg核黃素、4.6mg煙酸和230mg抗壞血酸。而另一項(xiàng)報(bào)告給出8.1gh2o、24.1g蛋白質(zhì)、3.5g脂肪、59.0g總碳水化合物、9.7g纖維、5.3g灰分、320mgca、185mgp、31.6mgfe、8400μgβ-胡蘿卜素當(dāng)量、0.07mg硫胺、0.79mg核黃素、7.3mg煙酸和85mg抗壞血酸(j.a.duke和a.a.atchley,“proximateanalysis,”in:christie,b.r.(編輯)。thehandbookofplantscienceinagriculture,crcpress,inc.,bocaraton,fla.(1984))。該樹(shù)葉還包含胡蘿卜素、核黃素、煙酸、泛酸和抗壞血酸?？Х纫蚝枉焚|(zhì)屬于更有活性的組分(councilforscientificandindustrialresearch,1948-1976)。存在于新鮮樹(shù)葉中的抗壞血酸在制作紅茶過(guò)程中被破壞。產(chǎn)生蘋(píng)果酸和草酸，以及山奈酚、槲皮苷、茶堿、可可堿、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、樹(shù)膠、糊精類(lèi)和肌醇。揮發(fā)油(樹(shù)葉鮮重的0.007-0.014％)的主要成分是己烯醛、己烯醇和低級(jí)醛類(lèi)，丁醛、異丁醛、異戊醛，以及正己基、芐基和苯乙基醇類(lèi)，酚類(lèi)、甲酚、己酸、正辛醇、香葉醇、沉香醇、乙酰苯、苯甲醇和檸檬醛。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，新鮮茶葉含有異常高水平的多酚類(lèi)的黃酮醇組(兒茶素類(lèi))，其可以達(dá)到樹(shù)葉干物質(zhì)的30％。兒茶素類(lèi)主要包括(-)-表兒茶素、(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯、(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素和(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯。此外，還有茶中獨(dú)有的3-沒(méi)食子?；鼘幩?茶素)和獨(dú)有的氨基酸茶氨酸(5-n-乙基谷氨酰胺)(duke,j.a.,handbookofenergycrops(1983),參見(jiàn)www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/camellia_sinensis.html)。茶葉包含高水平的多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶。第一個(gè)酶催化兒茶素的有氧氧化，且該過(guò)程在樹(shù)葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性被破壞時(shí)開(kāi)始。酚氧化酶使得雙黃酮醇、茶黃素、表茶黃酸和茶紅素的產(chǎn)生，它們構(gòu)成了紅茶中可萃取物質(zhì)的最大部分。大部分這些化合物容易與咖啡因形成復(fù)合物，其在新鮮樹(shù)葉中具有顯著水平(干物質(zhì)的2-4％)。過(guò)氧化物酶在化合物與原花色素形成上述復(fù)合物中發(fā)揮重要作用。兒茶素醌類(lèi)還引發(fā)成百上千種在紅茶的芳香部分中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性化合物的形成。此外，發(fā)生由相對(duì)可溶的糖苷類(lèi)向較低溶解度的苷元的轉(zhuǎn)化。上述加工過(guò)程的全部復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)都是由樹(shù)葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞所引發(fā)，并隨氧化時(shí)間而加強(qiáng)。因此，通常經(jīng)過(guò)深度揉捻、切割和相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間氧化加工的紅茶成分與新鮮樹(shù)葉中的非常不同。盡管綠茶(和白茶)經(jīng)過(guò)最低程度的氧化加工，且其成分與新鮮樹(shù)葉中的更加近似，但是其具有非酶的和酶催化的變化，這在采摘后非常迅速地發(fā)生，并且在干燥階段期間產(chǎn)生了新的揮發(fā)性物質(zhì)。因此，即使相對(duì)柔和的綠茶加工仍會(huì)引發(fā)對(duì)原始新鮮植物成分的某些改變，并且可以降低新鮮的茶植物樹(shù)葉的治療價(jià)值和其它潛在益處。許多近期研究都清楚的證實(shí)茶的治療性益處按照以下次序降低：白茶>綠茶>烏龍茶>紅茶。因此，作為對(duì)傳統(tǒng)茶葉加工觀察的結(jié)果，新鮮茶植物的研究可以防止特定活性的降解。新鮮、柔嫩的山茶屬(camellia)樹(shù)葉包含大約80％的水。細(xì)胞的剛性細(xì)胞壁阻止了細(xì)胞的溶脹和脫水。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞引發(fā)了新鮮植物組織的脫水，并隨后依次發(fā)生不期望的物理化學(xué)和生物化學(xué)過(guò)程：滲透沖擊、區(qū)室結(jié)構(gòu)破壞以及酶破壞、水解及氧化、酚類(lèi)聚合、糖苷類(lèi)向苷元轉(zhuǎn)化、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物生成、異構(gòu)化和微生物污染。因此，新鮮的山茶包含了范圍非常廣泛的生物活性物質(zhì)，并且僅有其中的一部分在傳統(tǒng)萃取過(guò)程中被獲取。因此，僅有細(xì)胞壁、分解代謝物和穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物可以用開(kāi)水萃取以獲得茶飲料，或者用不同的溶劑萃取以獲得生物活性成分的有限部分(主要是多酚類(lèi)和黃酮類(lèi))。鑒于新鮮茶葉作為有價(jià)值的治療性和其它潛在有益的生物活性成分來(lái)源的可能性，需要對(duì)新鮮茶植物進(jìn)行探索以確定如何將其治療性和其它潛在有益的生物活性特性最大化。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及生物活性組合物。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物包含來(lái)自茶科植物的分離的生物活性部分。適合的生物活性部分可以非限定性地包含細(xì)胞壁部分、細(xì)胞壁部分的提取物、膜部分、膜部分的提取物、細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞質(zhì)部分的提取物、細(xì)胞汁液(celljuiceserum)和/或其組合。本發(fā)明還涉及適合于哺乳動(dòng)物局部應(yīng)用的生物活性局部制劑。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性局部制劑包含局部有效量的本發(fā)明的生物活性組合物。該生物活性局部制劑可以進(jìn)一步包含局部可接受的載體。本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物皮膚組織中抑制炎癥活性的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進(jìn)一步包括以抑制皮膚組織中炎癥活性有效的量將該生物活性組合物應(yīng)用于皮膚組織。本發(fā)明還涉及保護(hù)哺乳動(dòng)物皮膚組織避免紫外光誘發(fā)的損傷的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進(jìn)一步包括以降低紫外光誘發(fā)的皮膚組織損傷以及防止對(duì)皮膚組織的氧化損傷有效的量將該生物活性組合物應(yīng)用于皮膚組織。本發(fā)明還涉及使哺乳動(dòng)物的皮膚組織中皮膚病癥正常化的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進(jìn)一步包括以使皮膚組織中細(xì)胞病癥正?；行У牧繉⒃撋锘钚越M合物應(yīng)用于皮膚組織。本發(fā)明還涉及分離來(lái)自茶科植物的細(xì)胞汁(celljuice)中的生物活性部分的方法。該方法包括提供茶科植物。然后將該茶科植物分離為細(xì)胞汁液和細(xì)胞壁組分。隨后將細(xì)胞汁在有效獲得生物活性部分的條件下進(jìn)行處理。適合的生物活性部分非限定性地包括膜部分、膜部分的提取物、細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞質(zhì)部分的提取物和/或細(xì)胞汁液(celljuiceserum)。隨后將該生物活性部分從所處理的細(xì)胞汁中分離。本發(fā)明進(jìn)一步涉及按照該方法制備的分離的生物活性組合物。本發(fā)明還涉及分離來(lái)自茶科植物的細(xì)胞壁組分中的生物活性部分的方法。該方法包括提供茶科植物。隨后將該茶科植物分離成為細(xì)胞汁液和細(xì)胞壁組分。將細(xì)胞壁組分在有效獲得生物活性部分的條件下處理。隨后從處理過(guò)的細(xì)胞壁組分中分離生物活性部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及按照此方法制備的分離的生物活性部分。本發(fā)明用于彌補(bǔ)傳統(tǒng)茶葉加工方法的缺陷，特別是傳統(tǒng)茶葉加工方法不能保留廣譜的有效生物活性成分。如本發(fā)明所提供，與傳統(tǒng)茶葉加工的產(chǎn)品相比，對(duì)新鮮的山茶屬生物質(zhì)不經(jīng)發(fā)酵和過(guò)度加熱處理的加工方式可以獲得更加強(qiáng)大且多樣化的生物活性成分。本發(fā)明還涉及飲料、治療性飲料、功能性飲料等，其包含至少一種本發(fā)明的生物活性組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述飲料、治療性飲料、功能性飲料等包含分散在液體中的至少一種本發(fā)明的生物活性組合物。在特定的實(shí)施方案中，所述液體選自水、小杯飲料(shotdrink)、功能性飲料、綠茶、烏龍茶、紅茶、白茶、調(diào)味茶、軟飲料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精飲料、無(wú)酒精飲料、運(yùn)動(dòng)飲料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜飲料、蘋(píng)果酒和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充飲料。本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明的生物活性組合物的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明的生物活性組合物的功能性食品。本發(fā)明還涉及將來(lái)自茶科植物的至少一種生物活性組合物分散于液體中以制備飲料的裝置，所述裝置包括：包含半透膜的過(guò)濾包或袋；以及裝在該過(guò)濾包或袋中的至少一種本發(fā)明的生物活性組合物。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該液體選自水、小杯飲料、功能性飲料、綠茶、烏龍茶、紅茶、白茶、調(diào)味茶、軟飲料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精飲料、無(wú)酒精飲料、運(yùn)動(dòng)飲料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜飲料、蘋(píng)果酒和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充飲料。在特定的實(shí)施方案中，該飲料是治療性飲料。本發(fā)明還涉及制備飲料的方法，所述方法包括步驟：提供本發(fā)明所述的裝置、將該裝置與液體在有效將裝置中的至少一種生物活性組合物分散于液體中的條件下接觸，由此獲得包含所述至少一種生物活性組合物的飲料。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，將該裝置與液體在有效引起所述至少一種生物活性組合物中的低分子量和還原的、非氧化的組分分散于液體中的條件下接觸。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，該液體選自水、小杯飲料、功能性飲料、綠茶、烏龍茶、紅茶、白茶、調(diào)味茶、軟飲料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精飲料、無(wú)酒精飲料、運(yùn)動(dòng)飲料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜飲料、蘋(píng)果酒和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充飲料。在特定的實(shí)施方案中，該飲料是治療性飲料。本發(fā)明還涉及用于來(lái)自茶科植物的至少一種生物活性組合物的全身或局部施用的制劑，所述制劑包括：包含至少一種本發(fā)明的生物活性組合物的溶液、混懸液、分散劑、糊劑或干燥粉末。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該制劑包括用于與液體混合而產(chǎn)生功能性飲料的干燥粉末。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該制劑包括用于與液體混合而產(chǎn)生功能性飲料的至少一種生物活性組合物的濃縮溶液。根據(jù)本發(fā)明的許多方面，本文所提供的生物活性組合物可以用于粉末、濃縮物，和/或作為在任何液體、凝膠、洗劑、食品等中的成分的液體形式，用于個(gè)體(包括但不限于人和動(dòng)物)的任何口服、全身或局部應(yīng)用。在特定的實(shí)施方案中，該生物活性部分可以與任何熱的或冷卻的飲料組合使用，包括雞尾酒、無(wú)酒精飲料和本文所述或考慮到的任何其它液體。此外，在多項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物活性組合物可以與任何市售的飲料組合，包括但不限于基于茶的飲料、非基于茶的飲料、碳酸飲料、基于咖啡因的飲料、美容飲料、維生素水、小杯茶飲料(teashots)、健康飲料、小杯飲料(shots)、運(yùn)動(dòng)飲料和本文所述或考慮到的任何其它液體。本發(fā)明的生物活性部分還可以用作用于改善個(gè)體(包括但不限于人和動(dòng)物)皮膚、頭發(fā)和指甲的補(bǔ)充劑。本發(fā)明的生物活性部分還可以用作營(yíng)養(yǎng)品或其它膳食補(bǔ)充劑。附圖簡(jiǎn)述圖1是例證本發(fā)明的生物活性組合物的制備方法的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。圖2是顯示細(xì)胞壁部分的提取物與常規(guī)茶葉提取物(稀釋度1:1000)的紫外/可見(jiàn)光譜圖。圖3是顯示山茶屬生物活性組合物(稀釋度1:4000)的紫外/可見(jiàn)光譜圖。圖4是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的細(xì)胞壁部分的提取物和常規(guī)茶葉提取物的吸光度光譜圖。干物質(zhì)水平相同。圖5是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的山茶屬生物活性組合物的吸光度光譜圖。干物質(zhì)水平相同。圖6是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的山茶屬生物活性組合物和白茶提取物的吸光度光譜圖。圖7a是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的以稀釋溶液(1:200)的山茶屬膜部分的提取物的吸光度光譜圖。圖7b是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的以稀釋溶液(1:200)的山茶屬細(xì)胞汁液的吸光度光譜圖。圖8a是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的以稀釋溶液(1:200)的大麥(hordeumvulgare)的細(xì)胞汁液的吸光度光譜圖。圖8b是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的以稀釋溶液(1:200)的鼠尾草(salviaofficinalis)的細(xì)胞汁液的吸光度光譜圖。圖9是顯示廣譜紫外照射在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上的效果的圖。圖10是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的白茶提取物的廣譜紫外照射效果的圖。圖11是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的細(xì)胞壁部分提取物的廣譜紫外照射效果的圖。圖12是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的山茶屬膜部分的提取物的廣譜紫外照射效果的圖。圖13是顯示在測(cè)試基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上應(yīng)用的山茶屬細(xì)胞汁液的廣譜紫外照射效果的圖。圖14是顯示白茶提取物對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的mda-mb-435s細(xì)胞的效果的圖。圖15是顯示白茶提取物對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)的mcf-7細(xì)胞(對(duì)照)和在5ng/mltgf-β存在下培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的mcf-7細(xì)胞的效果的圖。圖16是顯示細(xì)胞壁部分的提取物對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的mda-mb-435s細(xì)胞的效果的圖。圖17是顯示細(xì)胞壁部分的提取物對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)的mcf-7細(xì)胞(對(duì)照)和在5ng/mltgf-β存在下培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的mcf-7細(xì)胞的效果的圖。圖18是顯示膜部分的提取物對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的mda-mb-435s細(xì)胞的效果的圖。圖19是顯示膜部分的提取物對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)的mcf-7細(xì)胞(對(duì)照)和在5ng/mltgf-β存在下培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的mcf-7細(xì)胞的效果的圖。圖20是顯示細(xì)胞汁液對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的mda-mb-435s細(xì)胞的效果的圖。圖21是顯示細(xì)胞汁液對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)的mcf-7細(xì)胞(對(duì)照)和在5ng/mltgf-β存在下培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的mcf-7細(xì)胞的效果的圖。圖22是顯示白茶提取物對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的效果的圖。圖23是顯示白茶提取物對(duì)在10nmpma存在下培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的效果的圖。圖24是顯示細(xì)胞壁部分的提取物對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的效果的圖。圖25是顯示細(xì)胞壁部分的提取物對(duì)在10nmpma存在下培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的效果的圖。圖26是顯示膜部分的提取物對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的效果的圖。圖27是顯示膜部分的提取物對(duì)在10nmpma存在下培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的效果的圖。圖28是顯示細(xì)胞汁液對(duì)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的效果的圖。圖29是顯示細(xì)胞汁液對(duì)在10nmpma存在下培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的效果的圖。圖30是顯示白茶提取物對(duì)pma刺激的monomac6細(xì)胞所分泌的mmp水平的影響的圖。圖31是顯示細(xì)胞壁部分的提取物對(duì)pma刺激的monomac6細(xì)胞所分泌的mmp水平的影響的圖。圖32是顯示膜部分的提取物對(duì)pma刺激的monomac6細(xì)胞所分泌的mmp水平的影響的圖。圖33是顯示細(xì)胞汁液對(duì)pma刺激的monomac6細(xì)胞所分泌的mmp水平的影響的圖。圖34是monomac6細(xì)胞暴露于白茶提取物48小時(shí)后收集的培養(yǎng)基以及從不存在10nmpma(u)或存在10nmpma(s)、但不存在山茶屬組合物的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞所收集的培養(yǎng)基的凝膠酶譜。圖35是monomac6細(xì)胞暴露于細(xì)胞壁部分的提取物48小時(shí)后收集的培養(yǎng)基以及從不存在10nmpma(u)或存在10nmpma(s)、但不存在山茶屬組合物的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞所收集的培養(yǎng)基的凝膠酶譜。圖36是monomac6細(xì)胞暴露于膜部分的提取物48小時(shí)后收集的培養(yǎng)基以及從不存在10nmpma(u)或存在10nmpma(s)、但不存在山茶屬組合物的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞所收集的培養(yǎng)基的凝膠酶譜。圖37是monomac6細(xì)胞暴露于細(xì)胞汁液48小時(shí)后收集的培養(yǎng)基以及從不存在10nmpma(u)或存在10nmpma(s)、但不存在山茶屬組合物的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞所收集的培養(yǎng)基的凝膠酶譜。圖38是比較白茶提取物(“wte”)和本發(fā)明的細(xì)胞壁部分提取物(“cwfe”)、膜部分提取物(“mfe”)和細(xì)胞汁液(“cjs”)中各種兒茶素類(lèi)含量的柱狀圖。圖39是顯示elsd絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于purecentiatm山茶、紅茶和綠茶的傳統(tǒng)制備物的保留時(shí)間的圖。圖40是顯示elsd相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于purecentiatm山茶、紅茶和綠茶的傳統(tǒng)制備物的保留時(shí)間的圖。圖41是purecentiatm山茶的lc-dad三維色譜圖。x軸：保留時(shí)間0～15min；y軸：波長(zhǎng)200～420nm；z軸：強(qiáng)度0～3400。圖42是紅茶傳統(tǒng)制備物的lc-dad三維色譜圖。x軸：保留時(shí)間0～15min；y軸：波長(zhǎng)200～420nm；z軸：強(qiáng)度0～580。圖43是綠茶傳統(tǒng)制備物的lc-dad三維色譜圖。x軸：保留時(shí)間0～15min；y軸：波長(zhǎng)200～420nm；z軸：強(qiáng)度0～580。圖44是顯示purecentiatm山茶、紅茶和綠茶的傳統(tǒng)制備物相對(duì)于市售的茶基飲料的相對(duì)orac活性的柱狀圖。x軸是相對(duì)orac活性，以倍數(shù)表示，最低活性的檢驗(yàn)物(飲料d)被視為1。圖45是顯示在orac實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)的含有0.5％山茶的精華膠(serumgel)和不含山茶的精華膠基質(zhì)的抗氧化劑活性的柱狀圖。這些制劑在進(jìn)行評(píng)價(jià)之前在室溫和45℃下保持2個(gè)月。以這些檢驗(yàn)物的相對(duì)orac活性％呈現(xiàn)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及生物活性組合物。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物包含來(lái)自茶科植物的分離的生物活性部分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離的生物活性部分”含義是包括從未經(jīng)任何傳統(tǒng)茶葉加工(例如加熱處理、氧化、發(fā)酵、干燥)的茶科植物(例如茶科植物的新鮮生物質(zhì))中分離的部分。適合的分離的生物活性部分包括但不限于細(xì)胞壁部分、細(xì)胞壁部分的提取物、膜部分、膜部分的提取物、細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞質(zhì)部分的提取物、細(xì)胞汁液，和/或其組合。本發(fā)明的生物活性組合物和生物活性部分可以具有不同的兒茶素譜和總的兒茶素含量，如下文所定義，且使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)兒茶素診斷方法進(jìn)行確定。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“兒茶素”一般是指全部的兒茶素類(lèi)，包括但不限于以下特定的兒茶素類(lèi)型：(i)(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素(參見(jiàn)cas編號(hào)970-74-1，其以其整體引入本文作為參考)；(ii)(+)-兒茶素(參見(jiàn)cas編號(hào)7295-85-4，其以其整體引入本文作為參考)；(iii)(-)-表兒茶素(參見(jiàn)cas編號(hào)490-46-0，其以其整體引入本文作為參考)；(iv)(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯(參見(jiàn)cas編號(hào)989-51-5，其以其整體引入本文作為參考)；(v)(-)-沒(méi)食子兒茶酸沒(méi)食子酸酯(參見(jiàn)cas編號(hào)4233-96-9，其以其整體引入本文作為參考)；和(vi)(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯(參見(jiàn)cas編號(hào)1257-08-5，其以其整體引入本文作為參考)?！翱們翰杷睾俊?如本文所用)是指包含于本發(fā)明的特定生物活性組合物或生物活性部分中的全部?jī)翰杷仡?lèi)的合并的含量水平，并不意味著限定于上文所列出的兒茶素特定類(lèi)型的含量水平。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“兒茶素含量譜”是用以描述包含于本發(fā)明的特定生物活性組合物或生物活性部分中的所選擇的兒茶素類(lèi)的量。在本發(fā)明的生物活性組合物的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述生物活性部分可以是細(xì)胞壁部分。在本發(fā)明的生物活性組合物的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述生物活性部分可以是細(xì)胞壁部分的提取物。在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞壁部分的提取物可以包含每克干物質(zhì)約2.1至約4.5毫克、特別是每克干物質(zhì)約2.6至約4.0毫克、且更加特別是每克干物質(zhì)約3.0至約3.6毫克總兒茶素含量。在另一項(xiàng)特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞壁部分的提取物可以具有如下兒茶素含量譜：(i)每克細(xì)胞壁部分的提取物干物質(zhì)約2.0至約3.0毫克(+)-兒茶素；(ii)每克細(xì)胞壁部分的提取物干物質(zhì)約0.005至約0.02毫克(-)-表兒茶素；(iii)每克細(xì)胞壁部分的提取物干物質(zhì)約0.005至約0.02毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯；且(iv)每克細(xì)胞壁部分的提取物干物質(zhì)約0.003至約0.01毫克(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯。更加特別地是，該細(xì)胞壁部分的提取物可以具有如下兒茶素含量譜：(i)每克細(xì)胞壁部分的提取物干物質(zhì)約2.2至約2.7毫克(+)-兒茶素；(ii)每克細(xì)胞壁部分的提取物干物質(zhì)約0.01至約0.015毫克(-)-表兒茶素；(iii)每克細(xì)胞壁部分的提取物干物質(zhì)約0.01至約0.015毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯；且(iv)每克細(xì)胞壁部分的提取物干物質(zhì)約0.005至約0.007毫克(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯。在本發(fā)明的生物活性組合物的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述生物活性部分可以是膜部分。在本發(fā)明的生物活性組合物的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述生物活性部分可以是膜部分的提取物。在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中，膜部分的提取物可以包含每克干物質(zhì)約15.0至約30.5毫克、特別是每克干物質(zhì)約18.0至約27.5毫克、且更加特別是每克干物質(zhì)約21.0至約24.5毫克總兒茶素含量。在另一項(xiàng)特定的實(shí)施方案中，膜部分的提取物可以具有如下兒茶素含量譜：(i)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約1.7至約3.3毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素；(ii)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約6.1至約10.2毫克(+)-兒茶素；(iii)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約0.3至約1.1毫克(-)-表兒茶素；(iv)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約6.2至約12.5毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯；(v)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約0.007至約0.03毫克(-)-沒(méi)食子兒茶酸沒(méi)食子酸酯；且(vi)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約1.3至約3.3毫克(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯。更加特別地是，該膜部分的提取物可以具有如下兒茶素含量譜：(i)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約2.0至約3.0毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素；(ii)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約7.0至約9.0毫克(+)-兒茶素；(iii)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約0.5至約0.9毫克(-)-表兒茶素；(iv)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約8.0至約10.0毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯；(v)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約0.01至約0.02毫克(-)-沒(méi)食子兒茶酸沒(méi)食子酸酯；且(vi)每克膜部分的提取物干物質(zhì)約1.8至約2.8毫克(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯。在本發(fā)明的生物活性組合物的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述生物活性部分可以是細(xì)胞質(zhì)部分。在本發(fā)明的生物活性組合物的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述生物活性部分可以是細(xì)胞質(zhì)部分的提取物。在本發(fā)明的生物活性組合物的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述生物活性部分可以是細(xì)胞汁液。在特定的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞汁液可以包含每克干物質(zhì)約8.0至約20.0毫克、特別是每克干物質(zhì)約10.0至約18.0毫克、且更加特別是每克干物質(zhì)約12.0至約16.0毫克總兒茶素含量。在另一項(xiàng)特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞汁液可以具有如下兒茶素含量譜：(i)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約2.1至約4.4毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素；(ii)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約4.2至約8.6毫克(+)-兒茶素；(iii)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約0.2至約2.0毫克(-)-表兒茶素；(iv)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約1.2至約3.2毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯；(v)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約0.01至約0.1毫克(-)-沒(méi)食子兒茶酸沒(méi)食子酸酯；且(vi)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約0.2至約1.3毫克(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯。更加特別地是，該細(xì)胞汁液可以具有如下兒茶素含量譜：(i)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約3.0至約3.5毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素；(ii)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約5.0至約7.0毫克(+)-兒茶素；(iii)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約0.7至約1.5毫克(-)-表兒茶素；(iv)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約1.7至約2.7毫克(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯；(v)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約0.03至約0.07毫克(-)-沒(méi)食子兒茶酸沒(méi)食子酸酯；且(vi)每克細(xì)胞汁液干物質(zhì)約0.5至約1.0毫克(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，茶科植物的新鮮生物質(zhì)可以用于分離本發(fā)明的生物活性組合物?？梢詮纳讲鑼俸?或柃屬的茶科植物獲得該新鮮生物質(zhì)。用于本發(fā)明的山茶屬的適合的物種包括但不限于山茶(camelliasinensis)、山茶(camelliajaponica)、滇山茶(camelliareticulate)和茶梅(camelliasasanqua)。用于本發(fā)明的柃屬的適合的物種包括但不限于夏威夷柃(euryasandwicensis)。本發(fā)明的生物活性組合物可以進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。適合的穩(wěn)定劑是本領(lǐng)域所通常使用的那些。特別適合的穩(wěn)定劑可以包括但不限于乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、聚合物基質(zhì)和/或其混合物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該生物活性部分可以對(duì)至少一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)活性。該調(diào)解活性可以包括例如細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性、細(xì)胞生長(zhǎng)刺激活性、酶分泌活性、酶抑制活性、抗氧化劑活性、uv-保護(hù)活性、抗炎活性、傷口愈合活性和/或這些活性的組合。關(guān)于細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性，該活性可以包括癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。能夠被本發(fā)明的生物活性部分抑制生長(zhǎng)的適合的癌癥細(xì)胞可以包括但不限于乳腺癌細(xì)胞和/或結(jié)腸癌細(xì)胞。所述細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性還可以包括白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。能夠被本發(fā)明的生物活性部分抑制生長(zhǎng)的適合的白血病細(xì)胞可以包括但不限于單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以在抑制不期望的皮膚細(xì)胞增殖過(guò)度或增殖低下和/或抑制不期望的皮膚細(xì)胞中失調(diào)的酶活性或酶分泌過(guò)程中是有效的。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物活性組合物可以進(jìn)一步包括本領(lǐng)域所通常使用的全身或局部施用的遞送系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及適合于哺乳動(dòng)物局部應(yīng)用的生物活性的局部制劑。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性局部制劑包含局部有效量的本發(fā)明的生物活性組合物。該生物活性局部制劑可以進(jìn)一步包含局部可接受的載體。適合的局部可接受的載體可以包括但不限于親水性霜基質(zhì)、親水性洗劑基質(zhì)、親水性表面活性劑基質(zhì)、親水性凝膠基質(zhì)、親水性溶液基質(zhì)、疏水性霜基質(zhì)、疏水性洗劑基質(zhì)、疏水性表面活性劑基質(zhì)、疏水性凝膠基質(zhì)和/或疏水性溶液基質(zhì)。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述生物活性組合物可以以生物活性局部制劑總重的0.001％至約90％的量存在。本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物的皮膚組織中抑制炎癥活性的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進(jìn)一步包括以在皮膚組織中抑制炎癥活性有效的量將該生物活性組合物應(yīng)用于皮膚組織。在該方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑(其適合的實(shí)例如本文所述)。在該方法的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含局部可接受的載體(其適合的實(shí)例如本文所述)。本發(fā)明還涉及保護(hù)哺乳動(dòng)物皮膚組織避免紫外光誘導(dǎo)的損害的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進(jìn)一步包括以減少皮膚組織紫外光誘導(dǎo)的損害并防止皮膚組織氧化損害的有效的量將該生物活性組合物應(yīng)用于皮膚組織。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該方法是用于保護(hù)皮膚組織避免由約320至約400納米范圍的紫外光引發(fā)的紫外光誘導(dǎo)的損害。在該方法的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑(其適合的實(shí)例如本文所述)。在該方法的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含局部可接受的載體(其適合的實(shí)例如本文所述)。本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物的皮膚組織中使皮膚病癥正常化的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進(jìn)一步包括以使皮膚組織中細(xì)胞病癥正?；挠行Я繉⒃撋锘钚越M合物應(yīng)用于皮膚組織。在該方法的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑(其適合的實(shí)例如本文所述)。在該方法的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含局部可接受的載體(其適合的實(shí)例如本文所述)。本發(fā)明還涉及分離來(lái)自茶科植物的細(xì)胞汁中的生物活性部分的方法。該方法包括提供茶科植物(例如以新鮮生物質(zhì)的形式)。用于該方法適合的茶科植物如上文所述。然后將該茶科植物(例如新鮮生物質(zhì))分離為細(xì)胞汁和細(xì)胞壁組分。隨后將該細(xì)胞汁在有效獲得生物活性部分的條件下處理。適合的生物活性部分包括但不限于膜部分、膜部分的提取物、細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞質(zhì)部分的提取物和/或細(xì)胞汁液。隨后從該處理過(guò)的細(xì)胞汁中分離生物活性部分。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，通過(guò)該方法產(chǎn)生的多種適合的生物活性部分如本文所述。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)該方法產(chǎn)生的分離的生物活性組合物。本發(fā)明還涉及分離來(lái)自茶科植物的細(xì)胞壁組分中生物活性部分的方法。該方法包括提供茶科植物(例如以新鮮生物質(zhì)的形式)。用于該方法適合的茶科植物如上文所述。然后將該茶科植物(例如新鮮生物質(zhì))分離為細(xì)胞汁和細(xì)胞壁組分。將該細(xì)胞壁組分在有效獲得生物活性部分的條件下處理。隨后從該處理過(guò)的細(xì)胞壁組分中分離生物活性部分。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，通過(guò)該方法產(chǎn)生的多種適合的生物活性部分如本文所述。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)該方法產(chǎn)生的分離的生物活性組合物。舉例而言，制備本發(fā)明的生物活性部分(如上文所述)的總體過(guò)程如圖1中所示意性地顯示。加工步驟的細(xì)節(jié)在實(shí)施例(下文)中進(jìn)一步描述。如圖1中所述，將茶科植物的新鮮生物質(zhì)10(例如新鮮植物生物質(zhì))進(jìn)行研磨、浸軟，并在有效破壞剛性細(xì)胞壁的條件下壓制20，因此獲得植物細(xì)胞汁30和細(xì)胞壁32。該新鮮生物質(zhì)10還用于常規(guī)茶葉加工22，以制備用于對(duì)照試驗(yàn)和評(píng)價(jià)的陽(yáng)性對(duì)照150。將細(xì)胞汁30經(jīng)聚沉作用40(例如微波處理)實(shí)現(xiàn)新鮮植物生物質(zhì)10的膜部分組分的定量聚沉。聚沉作用40足以使得聚沉的膜部分從細(xì)胞汁30的其它非聚沉組分中隨后分離。如圖1中所示，該分離的一項(xiàng)實(shí)施方案是通過(guò)冷卻并離心42，得到膜部分(沉淀)50和上清液60(其不含特定的葉綠體膜組分，例如葉綠素和磷脂類(lèi))。為了制備細(xì)胞壁部分的提取物(即組合物a110)，將細(xì)胞壁32干燥34(例如若干隨后的微波處理)，并隨后將該干燥物質(zhì)與水36在通常用于制備傳統(tǒng)茶葉的條件下混合(于85℃下在水中混合)。為了制備膜部分的提取物(即組合物b120)，將膜部分50與溶劑52混合，并隨后離心54，得到上清液56和組合物b120。為了制備細(xì)胞質(zhì)部分的提取物(即組合物c130)，將上清液60經(jīng)聚沉作用62(例如等電沉淀)并離心64，得到包含絕大部分可溶性細(xì)胞質(zhì)蛋白的細(xì)胞質(zhì)部分(沉淀)70。隨后將細(xì)胞質(zhì)部分(沉淀)70與溶劑72混合，然后經(jīng)離心74，得到上清液76及隨后的組合物c130。為了制備細(xì)胞汁液(即組合物d140)，將上清液60經(jīng)聚沉作用62(例如等電沉淀)并離心64，得到細(xì)胞汁液(上清液)66及隨后的組合物d140。新鮮生物質(zhì)10的傳統(tǒng)茶葉加工22是用于制備例如陽(yáng)性對(duì)照150(多種茶，包括例如白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶)。組合物a110、組合物b120、組合物c130、組合物d140和陽(yáng)性對(duì)照150隨后可用于過(guò)濾和檢驗(yàn)80。本發(fā)明還涉及用于選擇性地將生物活性組合物的低分子量和還原的、非氧化的組分分散于液體中的裝置。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該裝置包含本發(fā)明的生物活性組合物。該生物活性組合物可以包裝入過(guò)濾包中。適合的過(guò)濾包可以是選擇性地將生物活性組合物的低分子量和還原的、非氧化的組分有效分散于液體中的過(guò)濾包。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該包包含了將該包中生物活性組合物的低分子量和還原的、非氧化的組分分散入液體的選擇性膜，但該膜抑制高分子量和氧化的組分從該包中分散入液體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“低分子量和還原的、非氧化的組分”包含少于或等于約5,000道爾頓的本發(fā)明的生物活性組合物的組分。在該方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑(其適合的實(shí)例如本文所述)。在該方法的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含局部可接受的載體(其適合的實(shí)例如本文所述)。本發(fā)明還涉及制備包含低分子量和還原的、非氧化的生物活性組合物的治療性飲料的方法。該方法包括提供按照本發(fā)明方法制備的裝置。將該裝置與液體在有效引起生物活性組合物的低分子量和還原的、非氧化的組分分散入液體的條件下接觸。在該方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑(其適合的實(shí)例如本文所述)。在該方法的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該生物活性組合物可以進(jìn)一步包含局部可接受的載體(其適合的實(shí)例如本文所述)。用于該方法的適合的液體包括但不限于水。該水可以是熱的或冷的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及按照該方法制備的治療性飲料。實(shí)施例實(shí)施例1來(lái)自山茶植物的生物活性組合物的制備制備本發(fā)明生物活性組合物的方法的一項(xiàng)實(shí)施方案的概要如圖1中所示。下文是本發(fā)明方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中相關(guān)方面的描述。生物質(zhì)制備。采集足夠量的新鮮山茶屬(山茶)植物生物質(zhì)(僅帶芽的頂部幼嫩葉組織)，得到大約100kg干物質(zhì)。在新鮮生物質(zhì)中干物質(zhì)的水平經(jīng)計(jì)算為21.70％，需要采集大約461kg新鮮植物生物質(zhì)以獲得100kg干物質(zhì)。要注意維持該植物生物質(zhì)的固有水分含量，以避免由于水分流失造成的凋萎。以避免或者最小化切碎、搗碎和壓碎所收集的生物質(zhì)的方式進(jìn)行采集，以避免葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，其將觸發(fā)由酚氧化酶和過(guò)氧化物酶催化的內(nèi)源性酶促反應(yīng)。由于這些反應(yīng)將隨氧化時(shí)間而加劇，因此全部步驟都在可能的最短時(shí)間內(nèi)完成。例如，所采集的生物質(zhì)在剪切后不超過(guò)10分鐘交付加工。這樣可以將植物生物質(zhì)暴露于陽(yáng)光、高溫和其它不利環(huán)境因素的時(shí)間減到最低。在進(jìn)一步加工前進(jìn)行洗滌步驟，以除去植物中的土壤顆粒和其它碎屑。以≦1kg/cm2水壓在≦5分鐘內(nèi)洗滌所采集的植物來(lái)完成該洗滌步驟。水洗滌的殘余物不包含任何綠色或褐色色素，指示適合的水壓和洗滌時(shí)間。從洗滌后的植物生物質(zhì)中除去過(guò)量的水。植物生物質(zhì)的研磨、浸軟和壓制。采集后，收集并洗滌該植物生物質(zhì)，隨后將該植物研磨、浸軟并壓制以提取細(xì)胞內(nèi)容物(即植物細(xì)胞汁)，并將其從富含纖維的細(xì)胞壁部分(細(xì)胞壁部分)分離。使用具有10hp發(fā)動(dòng)機(jī)和一套過(guò)濾篩的錘式磨(modelvs35,vincentcorporation,fla.)研磨該生物質(zhì)，以在最短的時(shí)間內(nèi)和生物質(zhì)溫度未顯著升高的情況下獲得適當(dāng)小尺寸的植物組織顆粒。調(diào)整該錘式磨以生產(chǎn)在≦10秒處理過(guò)程中最大尺寸≦0.5厘米的浸軟后的植物顆粒。該生物質(zhì)溫度僅升高≦5℃。立即使用水平方向連續(xù)螺桿壓榨機(jī)(compactpress“cp-6”,vincentcorporation,fla.)以從植物中提取該植物細(xì)胞汁。該螺桿壓榨機(jī)的椎體壓力保持在24kg/cm2水平，螺桿速度12rpm，且溫度僅升高≦5℃。該處理獲得具有41.39％干物質(zhì)水平的185kg細(xì)胞壁部分和具有8.49％干物質(zhì)水平的276kg植物細(xì)胞汁。細(xì)胞壁部分的提取物的制備(組合物a)。將具有41.39％初始干物質(zhì)水平的細(xì)胞壁部分的等分試樣在微波罩組合(modelgh9115xe,whirlpool)中干燥30秒，并隨后冷卻30秒。重復(fù)該處理幾次直至細(xì)胞壁部分的干物質(zhì)水平達(dá)到96.52％。將66.01的溫度85℃的去離子水加入4.0kg的干燥的細(xì)胞壁部分中，并強(qiáng)烈震蕩5分鐘。這些條件與茶葉制備方法一致，其描述于d'amelio,f.s.,botanicals.aphytocosmeticdeskreference,bocaraton,london,newyork,washington,d.c.:crcpress,p.361(1999)，其以其整體引入本文作為參考(還參見(jiàn)在www.leaftea.com；www.divinitea.com；www.equatorcoffee.com中的討論，其以其整體引入本文作為參考)。將該混合物經(jīng)4層尼龍織物過(guò)濾，并隨后經(jīng)具有0.8μm孔徑的濾器過(guò)濾。所得細(xì)胞壁提取物的ph為5.24，且干物質(zhì)水平為0.84％。該提取物進(jìn)一步用于其活性檢測(cè)。從細(xì)胞汁中分離膜部分。具有8.49％干物質(zhì)水平的初始的植物細(xì)胞汁包含細(xì)小的纖維顆粒，將其通過(guò)經(jīng)四層尼龍織物過(guò)濾或者經(jīng)使用低速離心生物質(zhì)而除去。將該過(guò)濾后的細(xì)胞汁接受使用溫度探針控制的微波處理。該處理持續(xù)直至細(xì)胞汁溫度達(dá)到60℃。一旦引起聚沉作用，立即將所處理的細(xì)胞汁冷卻至40℃。使用在高于或等于3,000g離心大于或等于20分鐘，以完成從聚沉的細(xì)胞汁液中分離膜部分。獲得膜部分(沉淀)和細(xì)胞汁上清液，其包含細(xì)胞質(zhì)部分和細(xì)胞汁液部分(即低分子量的可溶性組分)。該具有32.89％干物質(zhì)水平的膜部分用于制備來(lái)自膜的生物活性組合物的提取物。細(xì)胞汁上清液用于進(jìn)一步處理以獲得細(xì)胞質(zhì)部分和細(xì)胞汁液。膜部分的提取物的制備(組合物b)。將一份膜部分(10.0kg)和兩份二甲基亞砜—(20.0kg)在室溫下混合1小時(shí)，并持續(xù)攪拌。隨后將該物質(zhì)在高于或等于4,000g下離心大于或等于45分鐘。棄去沉淀，并將上清經(jīng)具有0.8μm孔徑的濾器過(guò)濾。該濾液具有6.83％的干物質(zhì)水平—膜部分的提取物(組合物b)用于其活性的進(jìn)一步檢測(cè)。從細(xì)胞汁上清液中分離細(xì)胞質(zhì)部分。為了分離細(xì)胞質(zhì)部分，將該細(xì)胞汁上清液進(jìn)行等電沉淀。使用滴定法用5.0n鹽酸(hcl)將該細(xì)胞汁上清液的ph調(diào)至4.0，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)部分沉淀。通過(guò)在高于或等于3,000g下離心大于或等于20分鐘，將具有14.5％干物質(zhì)水平的沉淀的細(xì)胞質(zhì)部分從上清中分離。細(xì)胞質(zhì)部分的提取物的制備(組合物c)。將一份細(xì)胞質(zhì)部分(10.0kg)和兩份二甲基亞砜—(20.0kg)在室溫下混合1小時(shí)，并持續(xù)攪拌。隨后將該物質(zhì)在高于或等于4,000g下離心大于或等于45分鐘。棄去沉淀，并將上清經(jīng)具有0.8μm孔徑的濾器過(guò)濾。該濾液具有3.50％的干物質(zhì)水平—細(xì)胞質(zhì)部分的提取物(組合物c)，可用于其活性的進(jìn)一步檢測(cè)。細(xì)胞汁液的制備(組合物d)。分離細(xì)胞質(zhì)部分后，該上清包含懸浮的顆粒。為了分離出這些顆粒，將該上清在高于或等于7,500g下離心大于或等于30分鐘。將該透明上清—細(xì)胞汁液經(jīng)具有0.8μm孔徑的濾器過(guò)濾。該具有5.69％干物質(zhì)水平的濾液(組合物d)用于其活性的進(jìn)一步檢測(cè)。傳統(tǒng)茶提取物制備—對(duì)照。將用于制備組合物a、b、c和d的相同批次的新鮮山茶屬樹(shù)葉用于制備傳統(tǒng)白茶和紅茶。使用以下方法來(lái)制備白茶。將包含21.70％干物質(zhì)的新鮮生物質(zhì)在沸騰的水中放置20秒使內(nèi)源性酶—酚氧化酶和過(guò)氧化物酶失活。在該過(guò)程中，將該樹(shù)葉置于尼龍過(guò)濾袋中。然后，將該處理過(guò)的樹(shù)葉在微波中干燥30秒，并隨后冷卻30秒。重復(fù)該處理數(shù)次直至在生物質(zhì)中的干物質(zhì)水平達(dá)到93.74％。隨后將66.01的溫度85℃的去離子水加入4.0kg的干燥樹(shù)葉中，并高度震蕩5分鐘。這些條件與茶葉制備方法一致，其描述于d'amelio,f.s.,botanicals.aphytocosmeticdeskreference,bocaraton,london,newyork,washington,d.c.:crcpress,p.361(1999)，其以整體引入本文作為參考(參見(jiàn)www.leaftea.com；www.divinitea.com；www.equatorcoffee.com中的討論，其以整體引入本文作為參考)。將該混合物經(jīng)4層尼龍織物過(guò)濾，并隨后經(jīng)具有0.8μm孔徑的濾器過(guò)濾。所得細(xì)胞壁部分的提取物的ph為5.52，且干物質(zhì)水平為1.10％。該提取物進(jìn)一步用于其活性檢測(cè)。使用以下方法來(lái)制備紅茶。將該包含21.70％干物質(zhì)水平的新鮮生物質(zhì)保持在25℃，并周期性(1小時(shí)開(kāi)啟，1小時(shí)關(guān)閉)通風(fēng)直至干物質(zhì)水平達(dá)到35％。隨后將該樹(shù)葉研磨(粉碎)至具有2-3mm大小的顆粒。該方法導(dǎo)致生物質(zhì)的溫度升至大約30℃。將研磨后的生物質(zhì)以分層(2″高)的形式放置于塑料傳送帶上于25℃下發(fā)酵(氧化)持續(xù)90分鐘。將該發(fā)酵過(guò)的獲得褐色顏色的生物質(zhì)在130℃下干燥30分鐘以達(dá)到97.5％的干物質(zhì)水平。隨后將66.0l的溫度85℃的去離子水加入4.0kg的干燥樹(shù)葉中，并高度震蕩5分鐘。這些條件與茶葉制備方法一致，其描述于d'amelio,f.s.,botanicals.aphytocosmeticdeskreference,bocaraton,london,newyork,washington,d.c.:crcpress,p.361(1999)，其以整體引入本文作為參考(還參見(jiàn)在www.leaftea.com；www.divinitea.com；www.equatorcoffee.com中的討論，其以其整體引入本文作為參考)。將該混合物經(jīng)4層尼龍織物過(guò)濾，并隨后經(jīng)具有0.8μm孔徑的濾器過(guò)濾。所得細(xì)胞壁部分的提取物的ph為4.96，且干物質(zhì)水平為1.38％。該提取物進(jìn)一步用于其活性檢測(cè)。實(shí)施例2關(guān)于制備來(lái)自山茶(camelliasinensis)、山茶(camelliajaponica)、滇山茶(camelliareticulate)、茶梅(camelliasasanqua)和夏威夷柃(euryasandwicensis)的生物活性組合物的干物質(zhì)分布分析生物活性組合物制備過(guò)程中所收集的不同部分，并比較干物質(zhì)分布。表1顯示了茶植物分級(jí)分離產(chǎn)物中100kg干物質(zhì)的分布。已經(jīng)確定，本發(fā)明的方法使得提取產(chǎn)率轉(zhuǎn)化為初始生物質(zhì)干物質(zhì)的約20-30％范圍的植物細(xì)胞汁液。膜部分干物質(zhì)的產(chǎn)率是初始生物質(zhì)干物質(zhì)的5％至10％和細(xì)胞汁干物質(zhì)的25％至35％范圍。表1顯示細(xì)胞質(zhì)部分干物質(zhì)的產(chǎn)率不超過(guò)初始生物質(zhì)干物質(zhì)的1.0％及隨后細(xì)胞汁上清液干物質(zhì)的2.5％。大部分細(xì)胞汁上清液干物質(zhì)濃縮于細(xì)胞汁液中。細(xì)胞壁部分、膜部分和細(xì)胞質(zhì)部分用作制備其提取物的來(lái)源，其分類(lèi)為生物活性組合物。所述細(xì)胞汁液直接以其原樣用作不含外源性溶劑的后續(xù)生物活性組合物。表1—新鮮生物質(zhì)的分級(jí)分離產(chǎn)品中100kg干物質(zhì)的分布應(yīng)當(dāng)指出，三種所選物質(zhì)是存在于新鮮植物組織中的全部功能結(jié)構(gòu)的最多樣化的代表。僅有可溶性細(xì)胞汁液具有允許向通常所用的體外試驗(yàn)系統(tǒng)直接施用的理化特性。細(xì)胞壁部分、膜部分和細(xì)胞質(zhì)部分用作用溶劑提取的原料。由于細(xì)胞壁部分與傳統(tǒng)茶植物產(chǎn)品在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似，該部分用水提取提供了與傳統(tǒng)茶葉的最佳比較。膜部分用二甲基亞砜提取，其便于有效溶解在葉綠體和線粒體結(jié)構(gòu)中整合的親水和疏水性組分。細(xì)胞質(zhì)部分用水提取。細(xì)胞汁液以其原樣使用。表2顯示全部四種檢測(cè)的生物活性組合物的產(chǎn)率：來(lái)自100kg初始生物質(zhì)干物質(zhì)的細(xì)胞壁部分的提取物(組合物a)、膜部分的提取物(組合物b)、細(xì)胞質(zhì)部分的提取物(組合物c)、細(xì)胞汁液(組合物d)和對(duì)照—白茶提取物或紅茶提取物。表2—來(lái)自100kg初始生物質(zhì)的生物活性組合物的產(chǎn)率表2顯示來(lái)自100kg山茶干物質(zhì)的生物活性組合物a、b、c和d的總產(chǎn)率等于33.3％，其非常顯著地超過(guò)了傳統(tǒng)茶葉加工的產(chǎn)率—15.14...19.36％。實(shí)施例3組合物a(細(xì)胞壁部分的提取物)與傳統(tǒng)茶葉提取物的比較檢測(cè)從相同批次的新鮮山茶中獲得的生物活性組合物a和傳統(tǒng)白茶和紅茶提取物的多個(gè)參數(shù)，且這些參數(shù)隨后的結(jié)果如表3中所示(所用的試驗(yàn)方法如實(shí)施例9和20以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0175235中所述，其以其整體引入本文作為參考)。表3—生物活性組合物a與白茶和紅茶提取物的各種參數(shù)表3顯示，與傳統(tǒng)白茶和紅茶提取物相比，該細(xì)胞壁部分的提取物具有較低水平的干物質(zhì)、電解質(zhì)和溶解的固體。紫外/可見(jiàn)光光譜數(shù)據(jù)顯示細(xì)胞壁部分的提取物具有最高的光譜曲線下面積的特定數(shù)值，即該特定的山茶屬產(chǎn)品(組合物a)具有每單位干物質(zhì)最高水平的光學(xué)活性組分。此外，該細(xì)胞壁部分的提取物具有較低量的氧化還原電位，說(shuō)明該組合物比傳統(tǒng)白茶和紅茶提取物的氧化度低。該細(xì)胞壁部分的提取物證實(shí)具有過(guò)氧化物清除活性，導(dǎo)致在比白茶和紅茶提取物更低的濃度下對(duì)細(xì)胞色素c還原的50％的抑制率(icr50)。選擇定量描述分析(“qda”)試驗(yàn)方法基于顏色、香味和口感對(duì)茶葉進(jìn)行系統(tǒng)性的鑒定和量化，其決定了茶飲料的可接受性。qda方法雇用了訓(xùn)練過(guò)的一組專(zhuān)業(yè)品嘗者對(duì)茶飲料相對(duì)于已定義的參考標(biāo)準(zhǔn)就上述屬性進(jìn)行定量。茶的顏色、香味和口感的對(duì)比評(píng)價(jià)證實(shí)，細(xì)胞壁部分的提取物顯著超過(guò)了傳統(tǒng)茶的這些特征。因此，獲自新鮮山茶屬生物質(zhì)的未經(jīng)任何發(fā)酵(氧化)和加熱處理的細(xì)胞壁部分與其它全部茶不同(wilson等人編輯，tea:cultivationtoconsumption,london:chapmanhall(1992)，其以其整體引入本文作為參考)。此外，主要的山茶屬酶(酚氧化酶和過(guò)氧化物酶)始終保留于傳統(tǒng)茶葉內(nèi)。相反，本發(fā)明包括將山茶屬樹(shù)葉分離為細(xì)胞壁部分和富含這些酶的細(xì)胞汁，因此細(xì)胞壁部分不包含內(nèi)源性酚氧化酶和過(guò)氧化物酶。因此，細(xì)胞壁部分必須歸類(lèi)為具有與白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶根本上不同的新的茶類(lèi)。該新的細(xì)胞壁部分茶可以用于松散或小包或其它形式以制備種類(lèi)廣泛的飲品、飲料，以及營(yíng)養(yǎng)和功能性食品的添加物。實(shí)施例4用于不同應(yīng)用的生物活性組合物制備全部生物活性組合物都可以用作溶液、混懸液、分散液、糊劑或干燥粉末，整合到用于全身或局部施用的多種制劑中。組合物的溶解形式可以經(jīng)具有0.2μm孔徑的濾器過(guò)濾以完全去除未完全溶解的細(xì)小顆粒和內(nèi)源性微生物。滅菌過(guò)濾前后的生物活性組合物中干物質(zhì)水平如表4中所示。表4—在滅菌過(guò)濾之前(分子)和之后(分母)的生物活性組合物中的干物質(zhì)水平表4顯示在滅菌過(guò)濾后全部生物活性組合物中的干物質(zhì)水平降低。但是該降低未導(dǎo)致其生物活性的任何損失或顯著降低，且在2-14％范圍內(nèi)。因此，組合物的主要部分是以可溶性生物活性成分存在。新鮮山茶屬樹(shù)葉包含相對(duì)低分子量(還原的，非氧化的)的成分。由于在生產(chǎn)傳統(tǒng)茶葉中氧化和聚合作用，上述潛在成分轉(zhuǎn)化為具有相對(duì)低活性的高分子量物質(zhì)部分。本發(fā)明的生物活性組合物是不經(jīng)發(fā)酵(氧化)和過(guò)度熱處理而獲得。因此，這避免了新鮮植物活性的不可逆損失，其可以使用例如新茶葉包或類(lèi)似的遞送系統(tǒng)以最大效能進(jìn)行遞送。與傳統(tǒng)的紙質(zhì)茶葉包(其使得全部可溶性茶葉成分通過(guò)大的孔徑移動(dòng)至周?chē)乃?不同，該新茶葉包是用半透性膜制作。該包內(nèi)部裝有生物活性組合物，并且使得僅有低于某種膜截留值(例如5,000道爾頓)的分子量的成分透入周?chē)嘀?。具有較高分子量的成分保留在該包內(nèi)，因此未包含于該飲料內(nèi)。因此，具有高于某一水平分子量的成分的截留能夠制備不含氧化成分的飲料，因?yàn)榫哂懈哂谀骋凰椒肿恿康纳锘钚越M合物的全部氧化的成分保留于該包內(nèi)。該新茶葉包設(shè)計(jì)可以是基于角錐狀茶葉包構(gòu)造，其使用透析膜管(dialysismembranetube)。新茶葉包的設(shè)計(jì)還可以包含內(nèi)部裝有生物活性組合物的薄的塑料框架和兩個(gè)用半透性膜構(gòu)成的透明表面。具體的膜截留值的選擇是通過(guò)生物活性組合物的類(lèi)型而確定，但一般而言優(yōu)選使更高百分比的組合物干物質(zhì)釋放進(jìn)入周?chē)嗪洼^低的氧化還原電位的較高截留。實(shí)施例5來(lái)自細(xì)胞汁液的局部成分sf的制備。由于缺少穩(wěn)定性且顏色和氣味變差，細(xì)胞汁液(組合物d)無(wú)法用作局部產(chǎn)品的活性成分。所述方法使得對(duì)細(xì)胞汁液部分進(jìn)行精制以獲得穩(wěn)定和活性的局部成分sf(該方法與之前在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)出版號(hào)2003/0175235中所述類(lèi)似，其以其整體引入本文作為參考)。該細(xì)胞汁液的精制包含以下步驟：熱處理、冷卻、過(guò)濾并穩(wěn)定化。精制是在如實(shí)施例1中所述從細(xì)胞質(zhì)部分中分離細(xì)胞汁液之后立即進(jìn)行。將該細(xì)胞汁液暴露于使用溫度探針控制的微波處理中。繼續(xù)該處理直至細(xì)胞汁液的溫度達(dá)到99℃(需要90℃，如之前在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)出版號(hào)2003/0175235中所述，其以其整體引入本文作為參考)。一旦引起聚沉作用，將該處理過(guò)的細(xì)胞汁液立即冷卻至10℃。將該聚沉的細(xì)胞汁液經(jīng)具有0.8μm孔徑的濾器真空過(guò)濾(使用如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)出版號(hào)2003/0175235中所用的雙層whatman2號(hào)濾材，其以其整體引入本文作為參考)。棄去沉淀，并將所得細(xì)胞汁液濾液用于進(jìn)一步加工(即，穩(wěn)定化)。通過(guò)加入防腐劑來(lái)完成細(xì)胞汁液濾液的穩(wěn)定化(不需要外源性抗氧化劑，如以前如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)出版號(hào)2003/0175235中所述，其以其整體引入本文作為參考)，并孵育該混合物直至實(shí)現(xiàn)完全溶解。所用的防腐劑包括如下：0.1％山梨酸鉀、0.1％苯甲酸鈉、0.1％尼泊金甲酯鈉和0.1％檸檬酸。該制備方法使得產(chǎn)生16.3kg干物質(zhì)產(chǎn)率(或大約286升)的局部成分sf，其用于其理化性質(zhì)和生物活性特性的鑒定。用于局部成分sf的推薦儲(chǔ)存條件包括在密閉容器中于15℃-25℃之間的溫度下避光儲(chǔ)存。實(shí)施例6來(lái)自細(xì)胞汁液部分的局部成分sf的產(chǎn)品說(shuō)明按照如上文實(shí)施例5中所述的方法制備局部成分sf。對(duì)局部成分sf進(jìn)行分析以確定其多種物理化學(xué)、微生物、細(xì)胞毒性和生物活性特征，如下文所述。局部成分sf是澄清液體，其具有淺黃褐色顏色和淡的特征性氣味。載體介質(zhì)中不加入溶劑(即乙二醇、油或水)。表5總結(jié)了局部成分sf的物理和化學(xué)數(shù)據(jù)。表5—局部成分sf的物理和化學(xué)參數(shù)文獻(xiàn)：[1]handbookofchemistryandphysics，80thedition，crcpress，1999-2000，5-90；[2]handbookofchemistryandphysics，80thedition，crcpress，1999-2000，8-21，其整體引入本文作為參考。表6描述了局部成分sf相關(guān)的uv光譜數(shù)據(jù)。表6—局部成分sf(1:500稀釋)的紫外光譜按照以下方法(usp<61>)進(jìn)行的微生物分析證實(shí)局部成分sf包含每克樣品少于100個(gè)的菌落形成單位且無(wú)病原體(大腸桿菌、白色假絲酵母、假單胞菌屬物種和金黃色葡萄球菌)。該數(shù)據(jù)證實(shí)局部成分sf滿足了用于局部產(chǎn)品成分的工業(yè)要求。經(jīng)測(cè)定，當(dāng)在15-25℃之間的溫度下在避光的密閉容器中儲(chǔ)存時(shí)局部成分sf在至少12-18個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的(即保持物理和化學(xué)完整性)。局部成分sf是可生物降解的產(chǎn)品。在對(duì)照的臨床評(píng)價(jià)中，已證實(shí)了局部成分的生物活性，其在表7中總結(jié)。表7—局部成分sf的生物活性文獻(xiàn)：[1]cannel等人，plantamdeica54:10-14(1988)，其整體引入本文作為參考。表7顯示，證實(shí)了局部成分sf的過(guò)氧化物清除能力。在對(duì)照的臨床評(píng)價(jià)中，證實(shí)了局部成分sf具有在每ml69.5μg干物質(zhì)濃度下的細(xì)胞色素c還原的50％抑制率(icr50)。陽(yáng)性對(duì)照(迷迭香酸)的icr50＝26.5μg/ml。除了抗氧化劑特性以外，還證實(shí)局部成分sf對(duì)抗肽水解酶(例如彈性蛋白酶、明膠酶b或所謂的基質(zhì)金屬蛋白酶9(mmp-9)和胰蛋白酶)的抗蛋白水解活性。在這些酶中，唯一的位置屬于彈性蛋白酶和mmp-9，其在皮膚炎癥中協(xié)同性地作用并發(fā)揮非常重要的作用。應(yīng)當(dāng)注意地是，mmp-9和彈性蛋白酶均由白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)分泌，并且這些酶是在導(dǎo)致炎癥的最終通路中的關(guān)鍵酶。一般認(rèn)為，如果該制劑能夠同時(shí)抑制兩種酶(彈性蛋白酶和mmp-9)，那么就確定該制劑對(duì)治療炎癥過(guò)程非常有效。應(yīng)當(dāng)注意地是，皮膚衰老過(guò)程、曬傷、外傷和疤痕形成具有非常相同的炎癥機(jī)理，其同時(shí)涉及mmp-9和彈性蛋白酶。因此，能夠同時(shí)抑制兩種上述酶類(lèi)的局部成分sf具有非常廣泛的應(yīng)用，其中是炎癥損傷的是由于以下原因：a.這兩種酶能夠協(xié)同降解人體組織中細(xì)胞外基質(zhì)的全部組分；b.彈性蛋白酶可以使得身體對(duì)抗mmp-9的自身抑制性防護(hù)失活；且c.mmp-9可以使得身體對(duì)抗彈性蛋白酶的自身抑制性防護(hù)失活。局部成分sf的抗炎癥和抗氧化劑特性的組合提示了基于生物活性組合物d的親水性制劑能夠全身性地作用于非?；A(chǔ)的皮膚病癥問(wèn)題。實(shí)施例7來(lái)自膜部分的局部成分mf的制備新鮮獲得的膜部分是具有深色顏色和特定氣味的糊劑。該部分主要由葉綠體及其主要包含磷脂類(lèi)、膜蛋白質(zhì)類(lèi)、葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的組合物來(lái)代表。對(duì)膜部分的干燥導(dǎo)致作為局部成分的膜部分研究所需要的許多有價(jià)值的特性的不可逆的損失。不干燥的情況下，該不穩(wěn)定的膜部分迅速轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈和非特征性氣味的暗色的不可分散的不可溶密集物。作為結(jié)果，該物質(zhì)無(wú)法用作局部成分。下文所述的方法使得新鮮獲得的膜部分轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定且有活性的局部成分(該方法與以前在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)出版號(hào)2003/0175235中所述方法類(lèi)似，其以其整體引入本文作為參考)。按照如實(shí)施例1中所述方法從細(xì)胞汁中分離膜部分后立即將該膜部分穩(wěn)定化，并混入聚合物基質(zhì)中。為制備大約100克局部成分mf，將細(xì)胞膜部分通過(guò)將其與非離子型乳化劑聚山梨酯80(tween80)和抗氧化劑(tenox4)混合來(lái)穩(wěn)定化。具體而言，將20克新鮮膜部分與3.5克tween80和0.1克tenox4(丁羥茴醚和丁羥甲苯在油中的溶液)劇烈混合直至均質(zhì)，在攪拌過(guò)程中避免通氣。穩(wěn)定化后，將該膜部分混入聚合物基質(zhì)(即聚合物乳化劑、丙烯酸酯/c10-c30丙烯酸酯交聯(lián)聚合物)中。通過(guò)將0.9克pemulentr-2分散于69.2克溫?zé)岬娜ルx子水中并使用適度振蕩混合直至均勻(期間避免通風(fēng))來(lái)制備該聚合物基質(zhì)。在平行試驗(yàn)中，將5克甘油和1.0克phenonip(苯氧乙醇(和)羥苯甲酯(和)羥苯丁酯(和)羥苯乙酯(和)羥苯丙酯的混合物)在獨(dú)立的瓶中合并并混合至均勻。在適度振蕩下，將包含pemulen和甘油的各相與phenonip合并并混合直至均勻。為將該膜部分引入該聚合物基質(zhì)中，將包含膜部分、tween80和tenox4的相加入包含pemulen、甘油和phenonip的相中，并隨后在劇烈振蕩下混合，期間避免通氣。膜部分混合物的穩(wěn)定化是通過(guò)用18％氫氧化鈉(naoh)水溶液中和并劇烈混合以產(chǎn)生具有5.0±0.4的ph的均一系統(tǒng)來(lái)完成。該制備方法，其從100kg新鮮山茶屬生物質(zhì)(大約461kg具有21.7％干物質(zhì)的新鮮樹(shù)葉)開(kāi)始，產(chǎn)生局部成分mf的11.85kg的干物質(zhì)產(chǎn)率(或大約172升)，其用于其物理化學(xué)和生物活性特性的鑒定。局部成分mf的推薦儲(chǔ)存條件包括在2-8℃之間的溫度下儲(chǔ)存于避光的密閉容器中。實(shí)施例8來(lái)自膜部分的局部成分mf的產(chǎn)品說(shuō)明按照如上文實(shí)施例7中所述的方法制備局部成分mf。對(duì)局部成分sf進(jìn)行分析以確定其多種物理化學(xué)、微生物、細(xì)胞毒性和生物活性特征，如下文所述。局部成分mf是不透明的凝膠，其具有綠褐色顏色和淡的特征性氣味。使用天然細(xì)胞汁液組分與聚合物凝膠化來(lái)配制局部成分mf，以確保最高水平的純度均勻度、相容性、穩(wěn)定性、安全性和效能。表8總結(jié)了局部成分mf的物理和化學(xué)數(shù)據(jù)。表8-局部成分mf的物理和化學(xué)參數(shù)參數(shù)方法結(jié)果非揮發(fā)性殘余物(nvr)，％參見(jiàn)實(shí)施例20，“方法2”6.9比重，g/cm3usp<841>1.035粘度，cpsusp<911>18,700phusp<791>4.6總類(lèi)胡蘿卜素，％nvr參見(jiàn)實(shí)施例20，“方法4”0.36葉黃素，％nvr參見(jiàn)實(shí)施例20，“方法4”0.34表9總結(jié)了關(guān)于局部成分mf的l＊a＊b＊值。參數(shù)方法結(jié)果l*參見(jiàn)實(shí)施例20，“方法3”30.27a*-”-27.36b*-”-42.56微生物分析證實(shí)局部成分mf滿足了局部產(chǎn)品成分關(guān)于cfu和不含病原體(usp<61>)的工業(yè)要求。經(jīng)測(cè)定，當(dāng)在2-8℃之間的溫度下在避光的密閉容器中儲(chǔ)存時(shí)局部成分mf在至少12-18個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的(即保持物理和化學(xué)完整性)。局部成分mf是可生物降解的產(chǎn)品。在對(duì)照的臨床評(píng)價(jià)中，已證實(shí)了局部成分mf的彈性蛋白酶抑制活性和胰蛋白酶抑制活性。表10總結(jié)了局部成分mf的某些生物活性結(jié)果。表10活性方法ic50(μg/ml)彈性蛋白酶抑制(ic50)參見(jiàn)實(shí)施例20，“方法5”12.3mmp-9抑制(ic50)參見(jiàn)實(shí)施例20，“方法6”5.6胰蛋白酶抑制(ic50)參見(jiàn)文獻(xiàn)【1】3.8文獻(xiàn)：[1]cannel等人，plantamdeica54：10-14(1988)，其整體引入本文作為參考。表10顯示局部成分mf已證實(shí)具有與局部成分sf(參見(jiàn)實(shí)施例6)類(lèi)似的特性。盡管局部成分mf不具有過(guò)氧化物清除活性，但是已證實(shí)其比局部成分sf具有更高的特異性酶抑制活性。因此，基于生物活性組合物b的局部成分mf應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是廣泛應(yīng)用于皮膚病癥治療的有效的多相抗炎成分。實(shí)施例9來(lái)自山茶植物的生物活性組合物的光譜分析光譜分析介紹。紫外線(uv)輻射對(duì)人類(lèi)皮膚具有損害作用。短期影響包括曬黑和曬傷，而累積的uv暴露的長(zhǎng)期影響包括皮膚光老化和增加的罹患皮膚癌的風(fēng)險(xiǎn)。紫外線皮膚損害是由氧化損害所介導(dǎo)，許多具有抗氧化劑活性的植物提取物都顯示出作為保護(hù)劑的前景：葡萄籽提取物(carini等人，“protectiveeffectofprocyanidinesfromvitisviniferaseedsonuv-inducedphotodamage：invitroandinvivostudies，”proceedingsofthe19thifscccongress3：55-63(1996)，其以其整體引入本文作為參考)、番茄紅素(dimascio等人,“l(fā)ycopeneasthemostefficientbiologicalcarotenoidsingletoxygenquencher,”archivesofbiochemistryandbiophysics274:532-8(1989)；和ribaya-mercado等人,“skinlycopeneisdestroyedpreferentiallyoverβ-caroteneduringultravioletirradiationinhumans,”journalofnutrition125:1854-9(1995)，其以其整體引入本文作為參考)、水飛薊素(morazzoni等人,“silybummarianum(carduusmarianus),”fitoterapia66:3-42(1995)；katiyar等人,“protectiveeffectsofsilymarinagainstphotocarcinogenesisinamouseskinmodel,”journalofthenationalcancerinstitute89:556-66(1997)，其以其整體引入本文作為參考)，以及特別是與產(chǎn)自其它植物來(lái)源的提取物相比具有更高效能的綠茶提取物(katiyar等人,“protectionagainstultraviolet-bradiation-inducedlocalandsystemicsuppressionofcontacthypersensitivityandedemaresponsesinc3h/henmicebygreenteapolyphenols,”photochemistryandphotobiology62:855-61(1995)；ruch等人,“preventionofcytotoxicityandinhibitionofintercellularcommunicationbyantioxidantcatechinsisolatedfromchinesegreentea,”carcinogenesis10:1003-8(1989)；wang等人,“protectionagainstultravioletbradiation-inducedphotocarcinogenesisinhairlessmicebygreenteapolyphenols,”carcinogenesis12:1527-30(1991)，其以其整體引入本文作為參考)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，茶植物(山茶)的樹(shù)葉具有高含量的具有抗氧化劑活性的多酚類(lèi)，包括(-)-表兒茶素、(-)-表兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯、(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素和(-)表沒(méi)食子酸兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯。已經(jīng)顯示，綠茶提取物具有對(duì)抗過(guò)氧化氫和超氧化物自由基的抗氧化劑活性并防止氧化性細(xì)胞毒性。該提取物還能防止細(xì)胞間通訊的抑制，其是腫瘤發(fā)生的一種可能機(jī)制。在uv-誘導(dǎo)的免疫抑制和皮膚癌發(fā)生之間具有緊密的聯(lián)系，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)綠茶提取物能夠保護(hù)避免由uv-b輻射引起的炎癥和免疫抑制。在動(dòng)物模型中，經(jīng)在飲用水中口服提供或者局部應(yīng)用的綠茶提取物能夠保護(hù)避免uv-b-誘導(dǎo)的皮膚癌癥形成。這些結(jié)果表明口服綠茶提取物能夠有助于預(yù)防皮膚癌。盡管山茶屬產(chǎn)品的uv保護(hù)特性已經(jīng)確定，但是由于常規(guī)技術(shù)的局限，作為避免日光傷害的有效的皮膚保護(hù)來(lái)源的茶植物的更大潛力未被充分研究，常規(guī)技術(shù)導(dǎo)致集中限定于相對(duì)窄范圍的活性成分：主要是兒茶酚類(lèi)。本文所述的“新的”和“傳統(tǒng)”山茶屬產(chǎn)品之間的對(duì)比性u(píng)v保護(hù)特性研究目前已經(jīng)證實(shí)，“新鮮山茶屬分級(jí)分離法”的技術(shù)能夠獲得更加有效的產(chǎn)品。通過(guò)使用通常用以測(cè)定溶液光譜特性的方法以及體外日光防護(hù)系數(shù)(spf)來(lái)進(jìn)行比較。方法學(xué)a:紫外/可見(jiàn)光光譜。使用藥典標(biāo)準(zhǔn)的分光光度計(jì)ultrospec4300pro(amershambiosciences公司,白金漢郡,英國(guó))獲得山茶屬產(chǎn)品在200-450nm區(qū)域的紫外/可見(jiàn)光光譜。按照如usp<197>中所述的方法測(cè)定山茶屬產(chǎn)品在蒸餾水中稀釋后的光譜參數(shù)。方法學(xué)b:吸光度光譜。在250-450nm區(qū)域的山茶屬產(chǎn)品的吸收度光譜的獲得是使用uv-1000s透光度分析儀(labsphere,inc.,northsutton,n.h.)和檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)，其模擬人皮膚的表面特性。其同時(shí)具有最佳化的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組分，并且設(shè)計(jì)具有與人皮膚類(lèi)似的拓?fù)鋵W(xué)、ph、關(guān)鍵性的表面張力和離子強(qiáng)度。將山茶屬樣品均勻地覆蓋于預(yù)先脫水的基質(zhì)表面(應(yīng)用量＝2.0μl/平方厘米)。應(yīng)用后15分鐘后，經(jīng)五次(5)重復(fù)獲得起始吸光度光譜。隨后將應(yīng)用了產(chǎn)品的基質(zhì)用裝有300瓦氙燈的廣譜日光模擬器(model16s-300singleport,solarlightcompany,inc.,philadelphia,pa.)照射。劑量控制系統(tǒng)pma2100-dcs允許向樣品遞送劑量的精確控制。照射(照射量＝60焦耳/平方厘米)后立即進(jìn)行五次(5)重復(fù)測(cè)定相同位置的吸光度光譜。照射前后樣品的吸光度光譜用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣品。對(duì)下述按照上文實(shí)施例1中所述方法制備的生物活性組合物進(jìn)行評(píng)價(jià)：組合物a(包含0.84％干物質(zhì)的細(xì)胞壁部分的提取物)、組合物b(包含6.83％干物質(zhì)的膜部分的提取物)、組合物d(包含5.69％干物質(zhì)的細(xì)胞汁液)。包含1.10％干物質(zhì)的常規(guī)白茶提取物和包含1.38％干物質(zhì)的常規(guī)紅茶提取物用作對(duì)照。全部樣品都獲自在charlestonteaplantation,sc采集的同一批次的新鮮山茶屬。這些樣品不包含任何添加物。分析。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)全部山茶屬樣品都具有高的uv吸光度值，并因此將其用蒸餾水稀釋。稀釋過(guò)的山茶屬產(chǎn)品的uv-vis光譜如圖2和3中所示。全部液體樣品的光譜具有某些相似性。例如，峰的位置在相對(duì)狹窄的λmax1＝269-274nm和λmax2＝205-208nm范圍內(nèi)變化，其說(shuō)明在全部檢測(cè)樣品中芳香環(huán)和σ-π鍵共軛系統(tǒng)的存在。但是，各峰的峰值、各峰下面積和積分光譜曲線下總面積是不同的(表11)，其提示了檢測(cè)樣品具有不同的光學(xué)活性組分的組合物。表11—山茶屬產(chǎn)品的紫外/可見(jiàn)光譜的參數(shù)＊根據(jù)樣品的稀釋度對(duì)光譜曲線下面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。從200nm至450nm獲得的積分光譜曲線下面積的對(duì)比清楚地證實(shí)膜部分的提取物(組合物b)和細(xì)胞汁液(組合物d)具有更高的吸光度值(表11)。“光譜下面積:干物質(zhì)”比率指示樣品的特定吸光度值按照以下次序升高：紅茶提取物>白茶提取物>細(xì)胞壁部分的提取物>細(xì)胞汁液>膜部分的提取物(表12)。表12—山茶屬產(chǎn)品的所選擇的光譜特征基于吸光度值的比較，新的生物活性組合物顯示是比傳統(tǒng)白茶和紅茶提取物更加有效的對(duì)抗日光損害的皮膚保護(hù)劑。應(yīng)當(dāng)指出，使用涉及290nm至400nm區(qū)域的吸光度數(shù)據(jù)能夠較好地評(píng)估山茶屬產(chǎn)品的uv保護(hù)特性，因?yàn)樵撎囟ü庾V區(qū)域?qū)е聈v誘發(fā)的皮膚損害(sayre等人,“amethodforthedeterminationofuvaprotectionfornormalskin,”journalofamericanacademyofdermatology23:429-40(1990)，其以其整體引入本文作為參考)。盡管檢測(cè)的液體樣品在290-400nm區(qū)域的吸光度僅占總紫外/可見(jiàn)光吸光度的～10％，新的山茶屬組合物在上述光譜區(qū)域具有較高的吸光度。因此，與山茶屬樣品稀釋后溶液有關(guān)的數(shù)據(jù)提供了檢測(cè)產(chǎn)品的uv保護(hù)效能的初始評(píng)估，其使用檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)做進(jìn)一步評(píng)價(jià)。結(jié)果如圖4-13中所示。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，新的山茶屬組合物和傳統(tǒng)白茶和紅茶提取物即使在其以不同濃度(干物質(zhì)水平一致)應(yīng)用于基質(zhì)后仍具有不同的光譜特征(圖4和5)。應(yīng)用在檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)上的山茶屬樣品的光譜包含四個(gè)至兩個(gè)特征峰，其具有不同的峰值(表13)。表13—在檢測(cè)基質(zhì)上應(yīng)用的山茶屬產(chǎn)品的吸光度光譜的參數(shù)應(yīng)當(dāng)指出，在溶液中的山茶屬產(chǎn)品的特征峰參數(shù)(表11)與應(yīng)用于檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的山茶屬產(chǎn)品的特征性峰參數(shù)(表13)相比非常不同。如對(duì)照試驗(yàn)所示，在表面的較低的ph水平(～5.5)不能負(fù)責(zé)上述差異，這可能是山茶屬產(chǎn)品和用于制備檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的成分之間化學(xué)相互作用的結(jié)果。因此，同時(shí)包含蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組分的檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)可能與山茶屬酚類(lèi)組分發(fā)生化學(xué)上的相互作用。應(yīng)當(dāng)注意，全部生物活性組合物以及傳統(tǒng)茶葉提取物都觀察到檢測(cè)產(chǎn)品的光譜特性的變化。還對(duì)新的山茶屬組合物和傳統(tǒng)山茶屬產(chǎn)品的光譜進(jìn)行比較，把檢測(cè)樣品的不同干物質(zhì)含量也考慮進(jìn)去。以相等體積應(yīng)用于檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的山茶屬產(chǎn)品的吸光度光譜如圖6所示。盡管細(xì)胞壁部分的提取物和白茶提取物之間具有某些相似性，但是第一種產(chǎn)品在250-280nm和近uv區(qū)域具有更高的吸光度。應(yīng)當(dāng)注意，更高的吸光度不與干物質(zhì)水平相對(duì)應(yīng)，與細(xì)胞壁部分的提取物(0.84％)相比，在白茶提取物(1.10％)中干物質(zhì)水平更高。這提示了這兩種樣品的組成是不同的，且細(xì)胞壁部分的提取物還具有更低的導(dǎo)電率，其包含具有高吸光度的更多非解離的光學(xué)活性成分(如表3中數(shù)據(jù)所示)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)膜部分的提取物(組合物b)和細(xì)胞汁液(組合物d)的光譜與細(xì)胞壁部分的提取物(組合物a)和白茶提取物的光譜不同。因此，膜部分的提取物和細(xì)胞汁液的光譜再次說(shuō)明這些產(chǎn)品具有比白茶提取物和細(xì)胞壁部分的提取物不同的組成。同時(shí)，該光譜數(shù)據(jù)提示膜部分的提取物和細(xì)胞汁液的組成是不同的。例如，膜部分的提取物具有在260nm、286nm和394nm的三個(gè)特征峰。細(xì)胞汁液光譜包含在260nm和286nm的兩個(gè)峰。這兩個(gè)光譜的對(duì)比說(shuō)明膜部分的提取物具有比細(xì)胞汁液高大約兩倍的消光率(extinction)，但干物質(zhì)水平的差異僅～1％。因此，四種檢測(cè)的山茶屬產(chǎn)品含有顯著不同的在250-450nm區(qū)域是光學(xué)活性的組分的組合物。與山茶屬產(chǎn)品的定量比較有關(guān)的數(shù)據(jù)如表14中所示。表14—在檢測(cè)基質(zhì)上應(yīng)用的山茶屬產(chǎn)品的所選擇的參數(shù)表14顯示在250-450nm區(qū)域和290-400nm區(qū)域樣品的吸光度按照以下次序升高：白茶提取物>細(xì)胞壁部分的提取物>細(xì)胞汁液>膜部分的提取物。該次序與在稀釋溶液中檢測(cè)的山茶屬產(chǎn)品的特定吸光度值的次序完全一致。當(dāng)檢測(cè)樣品應(yīng)用于檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)時(shí)，在250-400nm區(qū)域的吸光度對(duì)250-450nm光譜吸光度的貢獻(xiàn)達(dá)到～55-60％。應(yīng)當(dāng)注意，在稀釋的溶液中新的山茶屬組合物與其應(yīng)用于檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)后的光譜顯著不同。對(duì)于膜部分的提取物和細(xì)胞汁液而言這些差異既是定量又是定性的。因此，在溶液中膜部分的提取物在250nm至450nm范圍的峰在274nm。當(dāng)應(yīng)用于檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)時(shí)，相同的膜部分的提取物在上述波長(zhǎng)未顯示任何特征峰，而是在260nm和286nm具有兩個(gè)特征峰(圖7a)。在細(xì)胞汁液中觀察到在光譜性質(zhì)中近似的圖案，盡管應(yīng)用于檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的樣品中檢測(cè)出在～360nm的另外的吸光度，但是該現(xiàn)象在相同組合物的溶液中的紫外/可見(jiàn)光光譜中沒(méi)有記錄(圖7b)。應(yīng)當(dāng)指出，上述光譜之間的差異可能是新的山茶屬組合物和包含蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組分的檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的表面(其模擬人皮膚)之間化學(xué)相互作用的結(jié)果。這些相互作用導(dǎo)致造成uv照射損害作用的光譜區(qū)域中的吸光度劇烈升高，即新的山茶屬組合物具有顯著的uv保護(hù)效能。用大麥(hordeumvulgare)(圖8a)和鼠尾草(salviaofficinalis)(圖8b)的細(xì)胞汁液的對(duì)照試驗(yàn)顯示，在溶液中和將其應(yīng)用于檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)后的相同樣品的光譜差異在除山茶屬之外的其它植物來(lái)源中未觀察到。因此，在應(yīng)用于檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)后的山茶屬產(chǎn)品中的光譜變化說(shuō)明該特定的相互作用僅在新的山茶屬產(chǎn)品與模擬人皮膚的基質(zhì)之間發(fā)生。用預(yù)先水化的基質(zhì)的對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)照射后檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的吸光度、特別是在260-330nm范圍內(nèi)顯著降低(圖9)。該作用反映出經(jīng)高劑量廣譜日光照射的未受保護(hù)的基質(zhì)的相對(duì)低的光照穩(wěn)定性。對(duì)應(yīng)用白茶提取物的基質(zhì)的照射引發(fā)了吸光度光譜中的變化(圖10)，其與未受保護(hù)的檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的光譜變化類(lèi)似。當(dāng)消除基質(zhì)的影響時(shí)，未照射和照射過(guò)的樣品的光譜指示某些相似性，但是不能證實(shí)具有完全一致的表現(xiàn)。例如，在290-310nm范圍的吸光度降低而且在360nm的寬峰開(kāi)始形成。對(duì)細(xì)胞壁部分的提取物的照射(圖11)導(dǎo)致吸光度光譜、特別是在消除(扣除)基質(zhì)影響后所得到的曲線的類(lèi)似變化。盡管白茶提取物和細(xì)胞壁部分的提取物的組成不同，其光譜中由照射引起的改變模式是非常近似的。應(yīng)當(dāng)注意，白茶和細(xì)胞壁部分的提取物都不能完全保護(hù)基質(zhì)避免照射的破壞性作用，因此，檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的吸光度與該基質(zhì)完全不被保護(hù)時(shí)的情況下降低程度幾乎一樣(圖9)。這在250nm-330nm范圍尤其明顯，但在更長(zhǎng)的波長(zhǎng)觀察到吸光度的某些升高。對(duì)膜部分的提取物的照射對(duì)其吸光度光譜產(chǎn)生非常不同的影響(圖12)。例如，照射在250-285nm光譜范圍未引起任何改變。如所討論，該光譜的特定范圍受到被照射過(guò)的檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的破壞的顯著影響，并且因此對(duì)光譜的對(duì)比提示了基質(zhì)的破壞完全被存在于其表面的膜部分的提取物阻止。然而，記錄到在膜部分的提取物光譜中的某些變化。例如，在290-320nm范圍的吸光度輕微降低，且伴隨在較長(zhǎng)波長(zhǎng)下吸光度的細(xì)微升高。應(yīng)當(dāng)特別指出，已經(jīng)證實(shí)膜部分的提取物對(duì)于在260nm和280nm具有特征峰的核酸和芳香氨基酸的光譜范圍內(nèi)非常有效。因此，膜部分的提取物的作用使得該產(chǎn)品用于局部應(yīng)用的保護(hù)性u(píng)v保護(hù)成分。照射后，證實(shí)細(xì)胞汁液部分在其吸光度光譜中的某些改變(圖13)。一般而言，這些改變可以描述為在250-340nm范圍內(nèi)吸光度的輕微降低和在340-450nm范圍內(nèi)吸光度的輕微降低。應(yīng)當(dāng)注意，消除由檢測(cè)基質(zhì)(imstestinggroup,milford,conn.)的光破壞所提供的可能影響(參見(jiàn)未經(jīng)照射的細(xì)胞汁液部分的初始光譜上方光譜的紅色曲線)清楚地表明基質(zhì)被在其表面應(yīng)用的細(xì)胞汁液部分有效地保護(hù)。觀察及結(jié)論。上述結(jié)果清楚地顯示最佳傳統(tǒng)山茶屬產(chǎn)品—白茶提取物—提供了對(duì)抗uv照射的破壞作用相對(duì)弱的保護(hù)作用。細(xì)胞壁部分的提取物證實(shí)具有與白茶提取物類(lèi)似的特性，但是膜部分的提取物和細(xì)胞汁液具有更加有效的uv保護(hù)特性。發(fā)現(xiàn)山茶屬產(chǎn)品的uv保護(hù)特性按照如下次序升高：白茶提取物＝細(xì)胞壁部分的提取物>細(xì)胞汁液>膜部分的提取物。應(yīng)當(dāng)注意，山茶屬產(chǎn)品的光譜特性和uv照射后這些特性變化的圖形為白茶提取物(對(duì)照)、細(xì)胞壁部分的提取物、膜部分的提取物和細(xì)胞汁液中組分的組成都不相同和表現(xiàn)出的獨(dú)特活性提供了有力的證據(jù)。這是關(guān)于新的山茶屬組合物的特別益處，其中上文所述的uv活性不能因?yàn)槠浯嬖谟诎撞杼崛∥锒鴼w功于多酚類(lèi)。實(shí)施例10山茶屬產(chǎn)品的對(duì)比評(píng)價(jià)：概述實(shí)施例10至19描述了與試驗(yàn)相關(guān)的方法、結(jié)果和分析，所述試驗(yàn)是用于評(píng)價(jià)與由來(lái)自本發(fā)明的山茶的生物活性組合物調(diào)節(jié)細(xì)胞功能相關(guān)的生物活性范圍。首要目的是評(píng)價(jià)獲自本發(fā)明方法的產(chǎn)品的生物活性范圍，并且與通過(guò)常規(guī)(傳統(tǒng))茶葉技術(shù)所獲得的最佳產(chǎn)品(白茶提取物，其作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行研究并與以下本發(fā)明的生物活性組合物比較)進(jìn)行活性比較：(1)新鮮樹(shù)葉的細(xì)胞壁部分的提取物(組合物a，如本文所述)；(2)膜部分的提取物(組合物b，如本文所述)；和(3)細(xì)胞汁液(組合物d，如本文所述)。進(jìn)行評(píng)價(jià)這些山茶屬生物活性組合物對(duì)三種人細(xì)胞系生長(zhǎng)模式的影響的試驗(yàn)：具有單核細(xì)胞性白血病特征的髓細(xì)胞系(monomac6)以及兩種具有體內(nèi)惡性腫瘤早期階段特征的乳腺癌細(xì)胞系(mcf-7)和具有晚期癌特征的更加高侵襲性、轉(zhuǎn)移性和雌激素不敏感的細(xì)胞系(mda-mb-435s)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的白茶提取物證實(shí)具有對(duì)一些腫瘤細(xì)胞代謝活性的某種抑制性作用。但是，該抑制的程度對(duì)檢測(cè)細(xì)胞的全部類(lèi)型而言不顯著，并且即使檢測(cè)到該抑制作用，其通常不是完全的而是微弱或中度的。細(xì)胞壁部分的提取物證實(shí)具有與白茶提取物類(lèi)似的那些特性。值得注意地是，兩種細(xì)胞汁衍生物(膜部分的提取物和細(xì)胞汁液)對(duì)于在存在或不存在不同刺激物下培養(yǎng)的全部檢測(cè)細(xì)胞系都是更有效的代謝功能的抑制劑。例如，膜部分的提取物清楚地證實(shí)了更高的抑制效能，且其作用能夠在0.001％劑量下可靠地檢測(cè)。細(xì)胞汁液證實(shí)了復(fù)雜的響應(yīng)：較低劑量下刺激和高劑量下抑制。應(yīng)當(dāng)注意，并非誘導(dǎo)壞死性細(xì)胞溶解，膜部分的提取物和細(xì)胞汁液表現(xiàn)出開(kāi)啟了腫瘤細(xì)胞中的程序性細(xì)胞死亡或凋亡細(xì)胞死亡的通路。該試驗(yàn)數(shù)據(jù)指示該通路歸因于線粒體功能喪失，并且可能需要接觸24-48小時(shí)來(lái)檢測(cè)。作為與生物活性組合物接觸的后果，全部檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞系(mcf-7，人乳腺癌早期模型；mda-mb-435s，乳腺癌晚期模型；和monomac6，單核細(xì)胞性白血病模型)的代謝功能被膜部分的提取物最有效地抑制，抑制效力較差且更具選擇性的是細(xì)胞汁液。值得注意地是，白茶提取物和細(xì)胞壁部分的提取物證實(shí)是無(wú)活性的或者比上述組合物b和d的活性低很多。該趨勢(shì)在不同條件下檢測(cè)的細(xì)胞中已經(jīng)清楚地證實(shí)，所述條件是指：在不存在或存在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子情況下的mcf-7細(xì)胞、mda-mb-435s細(xì)胞以及刺激和未被刺激的單核細(xì)胞monomac6細(xì)胞。這些結(jié)果提供了本發(fā)明方法顯著提升山茶屬植物效能并產(chǎn)生證實(shí)具有活性的令人印象深刻的新產(chǎn)品能力的有力證據(jù)，所述活性即使是在傳統(tǒng)茶葉技術(shù)的最佳產(chǎn)品中也未確認(rèn)過(guò)。本發(fā)明的山茶屬部分對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的蛋白水解活性的作用對(duì)炎癥組織損傷以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移都具有意義。因此，乳腺癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞可以清楚地建議作為本發(fā)明生物活性組合物的預(yù)期靶點(diǎn)，最值得注意的是膜部分的提取物。應(yīng)當(dāng)注意，之前已經(jīng)顯示結(jié)腸癌來(lái)源的細(xì)胞系colo205釋放顯著水平的mmp-2，其隨后被也由該細(xì)胞分泌的類(lèi)胰蛋白酶活化?；趍onomac6細(xì)胞的結(jié)果，這也是本發(fā)明山茶屬組分的潛在靶點(diǎn)之一。通過(guò)這些研究得出結(jié)論，從新鮮山茶屬中分離的本發(fā)明的生物活性組合物具有令人印象深刻的導(dǎo)致調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞功能的活性。已經(jīng)觀察到的作用可以在從個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品到營(yíng)養(yǎng)制品和潛在藥物的范圍內(nèi)具有有價(jià)值的應(yīng)用。還應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明的非常有效的生物活性組合物不是單一純化的組分，而是分離的組分的復(fù)合物。膜部分的提取物(組合物b)和細(xì)胞汁液(組合物d)的進(jìn)一步分級(jí)分離可以獲得對(duì)于天然藥物不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)而言的極為有效的成分。實(shí)施例11山茶屬產(chǎn)品的對(duì)比評(píng)價(jià)：待檢測(cè)的組合物。以下生物活性組合物用于實(shí)施例10至19中所述的試驗(yàn)：(1)陽(yáng)性對(duì)照：按照實(shí)施例1和4中所述方法制備的白茶提取物。(2)組合物a：按照實(shí)施例1和4中所述方法制備的山茶屬的新鮮樹(shù)葉的細(xì)胞壁部分的提取物(3)組合物b：獲自按照實(shí)施例1和4中所述方法制備的山茶屬的新鮮加工過(guò)的樹(shù)葉的膜部分的提取物。(4)組合物d：獲自按照實(shí)施例1和4中所述方法制備的山茶屬的新鮮加工過(guò)的樹(shù)葉的細(xì)胞汁液。上述產(chǎn)品都獲自制備傳統(tǒng)白茶提取物和本發(fā)明的三種“平行”產(chǎn)品(組合物a、b和d)的同一批次的新鮮山茶屬。在文獻(xiàn)中有許多報(bào)道，其提示山茶屬樹(shù)葉的提取物具有一系列生物活性，主要?dú)w因于在處理過(guò)程中形成的多酚類(lèi)單寧的有效濃度。這些多酚類(lèi)以及聚合的單寧例如表沒(méi)食子酸兒茶素-3-o-沒(méi)食子酸酯(egcg)的低分子量前體已經(jīng)報(bào)道顯示出有效的抗氧化劑活性。越來(lái)越多的出版物提出了從山茶屬的干燥樹(shù)葉中制備的茶葉的不僅抗氧化劑，還有抗血管生成、抗菌、抗腫瘤、抗炎癥、抗誘變、防腐和解毒特性。并非全部上述特性都已經(jīng)證實(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義的效益。僅有其中部分已經(jīng)使用多種試驗(yàn)系統(tǒng)在綜合性研究中確認(rèn)。如以往參考文獻(xiàn)所述，應(yīng)當(dāng)指出，根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)使用本發(fā)明的技術(shù)從許多新鮮植物來(lái)源(而非山茶屬)中分離生物活性組合物，使用如以前美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)出版號(hào)2003/0175235(其以其整體引入本文作為參考)中所述的許多參數(shù)證實(shí)，此類(lèi)組合物比從同樣的干燥植物中分離的傳統(tǒng)產(chǎn)品更加有效。例如，使用本發(fā)明的方法從其它類(lèi)型植物(紫花苜蓿、大麥、薰衣草花、金盞草成藥和藥用鼠尾草)中制備的組合物的幾種令人印象深刻的生物活性已被確定并評(píng)價(jià)，包括高的抗彈性蛋白酶和抗明膠酶b(mmp-9)活性、新的中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)的調(diào)節(jié)以及針對(duì)活性氧物質(zhì)的顯著的過(guò)氧化物清除活性，這些活性不可能僅歸功于多酚類(lèi)的混合物。因此，特別感興趣地是探尋更加綜合的方法來(lái)比較活性范圍，其能夠?qū)⒈景l(fā)明的山茶屬組合物中檢測(cè)到的活性范圍與使用常規(guī)(傳統(tǒng))山茶屬技術(shù)從相同干燥植物中獲得的提取物中存在的活性進(jìn)行比較。因此，已經(jīng)對(duì)從新鮮采集的山茶屬的樹(shù)葉制備的細(xì)胞壁部分的提取物(組合物a)、膜部分的提取物(組合物b)和細(xì)胞汁液(組合物d)對(duì)活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)進(jìn)行了分析。已將這些組合物與從干燥的山茶屬樹(shù)葉中制備的傳統(tǒng)白茶提取物進(jìn)行比較。應(yīng)當(dāng)注意，按照傳統(tǒng)山茶屬產(chǎn)品的多項(xiàng)研究，白茶提取物證實(shí)具有更高的特定活性，并因此選擇此種制劑作為與本發(fā)明的新的山茶屬產(chǎn)品比較的代表性的陽(yáng)性參考對(duì)照。實(shí)施例12山茶屬產(chǎn)品的對(duì)比評(píng)價(jià)：細(xì)胞系選擇的原理作為細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的檢測(cè)系統(tǒng)，使用兩種作為腫瘤細(xì)胞模型的人乳腺癌來(lái)源的細(xì)胞系(mcf-7和mda-mb-435s)和用作炎癥細(xì)胞模型的人單核細(xì)胞樣細(xì)胞系(monomac6)。上述細(xì)胞系如實(shí)施例21中所述。mcf-7作為早期或較少去分化乳腺癌的模型。該細(xì)胞系仍保留雌激素敏感性，并且具有相對(duì)低的侵襲表現(xiàn)型；其轉(zhuǎn)移至免疫缺陷動(dòng)物模型的能力非常一般。在之前的研究中，mcf-7細(xì)胞系已經(jīng)顯示對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(tgf-β)表現(xiàn)出特征性響應(yīng)：在tgf-β的存在下孵育24小時(shí)后，該細(xì)胞分泌蛋白水解酶類(lèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)家族和促血管生成因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)(兩種提高的侵襲和轉(zhuǎn)移效能的不同標(biāo)記)的水平升高。對(duì)tgf-β的響應(yīng)是腫瘤和部分腫瘤細(xì)胞系的標(biāo)志，與生長(zhǎng)停止相反，其是在正常細(xì)胞中由生長(zhǎng)因子誘發(fā)。為了評(píng)價(jià)本發(fā)明的生物活性組合物，將不存在和存在tgf-β情況下培養(yǎng)的mcf-7細(xì)胞用作靶點(diǎn)。mda-mb-435s細(xì)胞系具有更高的侵襲、轉(zhuǎn)移和雌激素不敏感性。該人癌來(lái)源的細(xì)胞系還顯示對(duì)tgf-β的敏感性，但即使在不含生長(zhǎng)因子的情況下，其自發(fā)地釋放比mcf-7更高水平的mmp和vegf，與其用作更晚期癌模型一致。在本評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，僅檢測(cè)生物活性組合物對(duì)不含tgf-β情況下培養(yǎng)的mda-mb-435s細(xì)胞的作用。人單核細(xì)胞樣細(xì)胞系(monomac6)表達(dá)許多與休眠的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞一致的那些生物標(biāo)記物，并與人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞一樣對(duì)促炎癥活化刺激物例如咐拜十四烷酯(pma)有響應(yīng)。檢測(cè)生物活性組合物對(duì)不包含和包含pma情況下培養(yǎng)的作為休眠和活化的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞模型的monomac6細(xì)胞的作用。因此，上述所選擇的細(xì)胞系組合為評(píng)價(jià)山茶屬生物活性組合物的抗腫瘤和抗炎癥效能提供了可靠的基礎(chǔ)。與單一試驗(yàn)靶點(diǎn)的響應(yīng)或?qū)δ撤N刺激物具有類(lèi)似敏感性或類(lèi)似響應(yīng)的靶點(diǎn)的響應(yīng)所進(jìn)行的研究相比，用許多功能性探針進(jìn)行的所選擇細(xì)胞的平行試驗(yàn)可以提供獲得更多關(guān)于產(chǎn)品活性及其作用機(jī)制的有價(jià)值的結(jié)論的機(jī)會(huì)。實(shí)施例13山茶屬生物活性組合物的對(duì)比評(píng)價(jià)：試驗(yàn)選擇的原理基于兩個(gè)生存力試驗(yàn)和細(xì)胞功能探針的初始評(píng)價(jià)(參見(jiàn)實(shí)施例20，“方法8”)。第一個(gè)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞溶質(zhì)酶、乳酸脫氫酶的水平，當(dāng)細(xì)胞裂解時(shí)其釋放入細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。該細(xì)胞膜完整性的喪失在常規(guī)情況下為認(rèn)為是壞死細(xì)胞死亡的信號(hào)，并反映了細(xì)胞毒特性。第二個(gè)試驗(yàn)檢測(cè)線粒體脫氫酶活性，如四唑鹽還原為其有色的甲臜所反映。當(dāng)mts試劑(四唑鹽)應(yīng)用于活的細(xì)胞時(shí)，其轉(zhuǎn)化為深度著色的化合物(甲臜)。線粒體脫氫酶活性的喪失還可以與細(xì)胞死亡相關(guān)，但通常是程序性細(xì)胞死亡、或細(xì)胞凋亡的通路的早期步驟的標(biāo)志物，其中在細(xì)胞核已經(jīng)濃縮且線粒體停止功能后細(xì)胞膜完整性一般保留完好。乳酸脫氫酶的泄露指示了與細(xì)胞溶解相關(guān)的生存力完全喪失，而四唑鹽還原減少指示了線粒體活性的喪失，但不是必須有不可逆的細(xì)胞膜完整性或生存力的喪失。作為額外的細(xì)胞功能探針，已經(jīng)檢測(cè)了山茶屬生物活性組合物對(duì)由monomac6細(xì)胞系分泌的蛋白酶水平的作用(參見(jiàn)實(shí)施例20，“方法9”)。在之前用該細(xì)胞系的研究中，觀察到用pma孵育后，monomac6細(xì)胞分泌兩種所謂的溶解明膠的基質(zhì)金屬蛋白酶mmp-2(明膠酶a)和mmp-9(明膠酶b)。這些mmp還由許多腫瘤及其周?chē)拈g質(zhì)分泌，并且涉及炎癥組織損傷以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。之前還顯示某些開(kāi)發(fā)為抗炎和抗腫瘤的藥物除任何對(duì)mmp的蛋白水解活性的任何直接抑制以外還表現(xiàn)出降低由細(xì)胞產(chǎn)生的mmp水平(已經(jīng)研究的藥物已知減少炎癥性組織破壞以及腫瘤細(xì)胞系侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物)。這些研究的目的是評(píng)價(jià)本發(fā)明的山茶屬生物活性組合物可能具有降低由活化的monomac6細(xì)胞釋放的mmp水平的類(lèi)似能力的可能性。因此，所選擇的試驗(yàn)使人們能夠可靠地評(píng)價(jià)廣泛的代謝過(guò)程，并有效地獲得重要數(shù)據(jù)，其可能揭示由某些山茶屬生物活性組合物所觸發(fā)的作用機(jī)制。實(shí)施例14山茶屬產(chǎn)品的對(duì)比評(píng)價(jià)：山茶屬生物活性組合物對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞系的作用在這些研究的自始至終，僅通過(guò)四唑鹽mts還原為其甲臜的試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)線粒體功能。應(yīng)當(dāng)注意地是，更高濃度的本發(fā)明的山茶屬生物活性組合物已被觀察到具有在不存在任何活的細(xì)胞情況下直接還原mts的內(nèi)在能力，并且在本文所報(bào)道的全部結(jié)果中，該在不含細(xì)胞情況下甲臜的本底形成已經(jīng)從在細(xì)胞存在下所觀察到的還原酶活性水平中扣除。圖14至21說(shuō)明，在不存在和存在5ng/mltgf-β下培養(yǎng)的mcf-7細(xì)胞和僅在不包含tgf-β情況下培養(yǎng)的mda-mb-435s細(xì)胞在加入四種在0.01％或0.02％至0.0001％范圍(w/v，培養(yǎng)基中的終濃度，基于山茶屬組合物中的固體干重)內(nèi)各自不同劑量的山茶屬組合物后24小時(shí)和48小時(shí)的還原酶活性的量級(jí)。實(shí)施例15山茶屬生物活性組合物的對(duì)比評(píng)價(jià)：mcf-7細(xì)胞。在不包含tgf-β的情況下，最高檢測(cè)濃度(0.01％)的組合物a和白茶提取物(陽(yáng)性對(duì)照)對(duì)由mcf-7細(xì)胞引起的mts還原具有顯著作用。在該濃度下與山茶屬組合物a接觸24小時(shí)后具有顯著但不完全的還原酶活性抑制(～50-70％抑制率)。暴露于白茶提取物中24小時(shí)后檢測(cè)到類(lèi)似的還原酶活性抑制。相反，從山茶屬細(xì)胞汁制備的兩種山茶屬生物活性組合物(膜部分的提取物和細(xì)胞汁液)在不含tgf-β的mcf-7細(xì)胞中是更有效的還原酶活性抑制劑。膜部分的提取物(組合物b)除了某種程度上效能更強(qiáng)以外在劑量依賴(lài)方面與白茶提取物類(lèi)似，在最高測(cè)試劑量0.01％下產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上地完全抑制。細(xì)胞汁液(組合物d)也在0.01％下產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上地完全抑制，但在0.0025％的較低劑量下，有一些刺激還原酶活性的證據(jù)。組合物d的較低劑量沒(méi)有顯著作用。當(dāng)將mcf-7細(xì)胞在生長(zhǎng)因子tgf-β的存在下培養(yǎng)時(shí)，其對(duì)山茶屬組合物的敏感性顯著改變。暴露于細(xì)胞壁部分的提取物和白茶提取物24小時(shí)或48小時(shí)后，除了在最高劑量(0.01％)的白茶提取物中低于20％的中度抑制外，以任何劑量對(duì)還原酶活性都無(wú)刺激或抑制作用的證據(jù)。相反，將用tgf-β處理過(guò)的mcf-7細(xì)胞與膜部分的提取物以0.02％劑量接觸24小時(shí)導(dǎo)致還原酶活性的70％的抑制率，且48小時(shí)后，還原酶活性實(shí)質(zhì)上完全抑制。在較低劑量的膜部分的提取物下24小時(shí)后檢測(cè)到更弱的抑制率，但是在48小時(shí)后，檢測(cè)到還原酶活性顯著活化。接觸48小時(shí)后檢測(cè)到在低劑量的細(xì)胞汁液下獲得還原酶活性的同樣活化以及在最高劑量(0.02％)下的顯著抑制，但是該組合物在更有限的24小時(shí)接觸后無(wú)論劑量大小都僅對(duì)tgf-β處理過(guò)的mcf-7細(xì)胞的還原酶活性具有最小的作用。在評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，即使與最高劑量的任何山茶屬組合物接觸24小時(shí)都未能檢測(cè)到乳酸脫氫酶顯著釋放到mcf-7細(xì)胞的培養(yǎng)基中。這表明，這些細(xì)胞中線粒體功能的喪失不伴隨細(xì)胞的壞死性溶胞作用。如果所述細(xì)胞實(shí)際是在接觸的頭48小時(shí)過(guò)程中死亡，其更加可能是程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡通路已經(jīng)啟動(dòng)。該結(jié)論通過(guò)光學(xué)顯微觀察被證實(shí)，其顯示存在一些細(xì)胞的圓化(rounding)，但是在接觸過(guò)程中未形成細(xì)胞碎片或膜碎片。因此，顯示出線粒體功能的抑制是全部測(cè)試的山茶屬產(chǎn)品的主要作用模式，其沒(méi)有證實(shí)通過(guò)所釋放的乳酸脫氫酶水平表明的具有細(xì)胞毒或壞死作用。實(shí)施例16山茶屬生物活性組合物的對(duì)比評(píng)價(jià)：mda-mb-435s細(xì)胞。mda-mb-435s細(xì)胞對(duì)山茶屬組合物的響應(yīng)模式與mcf-7(其中最有效的組合物是組合物b和d)類(lèi)似，膜部分的提取物(組合物b)顯示比細(xì)胞汁液(組合物d)某種程度更高的效能。僅有膜部分的提取物在僅接觸24小時(shí)后產(chǎn)生顯著的還原酶活性抑制作用。在最高劑量0.01％下抑制率達(dá)到對(duì)照還原酶數(shù)值的-70％，即使在可標(biāo)記濃度的最低劑量—0.0001％下仍然可以可靠地檢測(cè)到-10％的中度抑制率。其它檢測(cè)組合物在接觸24小時(shí)后僅有中度抑制率，且僅在較高檢測(cè)劑量下。接觸48小時(shí)后，還原酶活性在各種所述組合物存在下以劑量依賴(lài)的形式被抑制，但是在所述組合物的最高劑量下都未能達(dá)到接近100％抑制的效能，除了膜部分的提取物以外。該組合物在0.001％下接觸48小時(shí)后抑制還原酶活性-50％。白茶提取物和細(xì)胞壁部分的提取物在接觸48小時(shí)后也對(duì)mda-mb-435s細(xì)胞具有顯著的抑制活性，其實(shí)際上高于細(xì)胞汁液。不論接觸期多長(zhǎng)，任何所述制劑的劑量都不會(huì)引發(fā)該細(xì)胞系中還原酶活性的活化。應(yīng)當(dāng)注意，在僅24小時(shí)后很少能觀察到對(duì)mda-mb-435s細(xì)胞系的高度侵襲、轉(zhuǎn)移和雌激素不敏感的任何影響。實(shí)施例17山茶屬生物活性組合物的對(duì)比評(píng)價(jià)：山茶屬組合物對(duì)單核細(xì)胞樣細(xì)胞的作用線粒體脫氫酶活性：乳腺癌細(xì)胞系的初步研究顯示的某些趨勢(shì)證實(shí)與monomac6細(xì)胞對(duì)四種檢測(cè)的山茶屬組合物的響應(yīng)一致。與細(xì)胞壁部分的提取物(組合物a)和白茶提取物(陽(yáng)性對(duì)照)相比，膜部分的提取物(組合物b)和細(xì)胞汁液(組合物d)對(duì)炎癥細(xì)胞系中的mts還原酶活性是更有效的抑制劑，膜部分的提取物(組合物b)明顯具有最強(qiáng)的抑制效力。對(duì)未受刺激的和用10nmpma刺激的細(xì)胞中的mts還原酶的作用進(jìn)行檢測(cè)，并評(píng)價(jià)與山茶屬組合物接觸24和48小時(shí)后的還原酶活性。這些組合物對(duì)monomac6細(xì)胞中還原酶活性的作用如圖22至33所示。在與pma-刺激后的細(xì)胞接觸48小時(shí)后，白茶提取物顯示出對(duì)還原酶活性微弱但劑量依賴(lài)性的抑制；無(wú)論在不含pma情況下接觸的劑量還是時(shí)長(zhǎng)如何，還原酶活性都無(wú)顯著損失，并且以任何劑量與pma處理過(guò)的細(xì)胞接觸24小時(shí)后都無(wú)任何作用。無(wú)論接觸的劑量還是時(shí)間以及所述細(xì)胞是否用pma刺激過(guò)，細(xì)胞壁部分提取物對(duì)monomac6細(xì)胞都無(wú)作用。新鮮山茶屬樹(shù)葉的細(xì)胞汁液在接觸24或48小時(shí)后以劑量依賴(lài)的方式中度地抑制未刺激的monomac6細(xì)胞。在0.01％(w/v，在培養(yǎng)基中的終濃度，基于起始制劑中固體的干重量)的最高劑量下的最大抑制率僅為對(duì)照物活性的～20-30％。僅以最高劑量的組合物d(0.01％)且僅在接觸48小時(shí)后，對(duì)pma-刺激后細(xì)胞的抑制率才達(dá)到對(duì)照物活性的50％。新鮮采集的山茶屬的膜部分提取物(組合物b)證實(shí)在抑制monomac6細(xì)胞還原酶活性中是所檢測(cè)制劑中最有效的，如其對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞系一樣。pma刺激的作用或與組合物接觸的持續(xù)時(shí)間對(duì)抑制作用的影響微不足道，其在存在或不存在pma的情況下都是劑量依賴(lài)性的，并且在接觸24小時(shí)或48小時(shí)后大致相同。在0.02％的最高劑量下還原酶活性在pma存在下被抑制-70％且在不含pma情況下被抑制-80-90％，而在0.001％劑量下可以可靠地檢測(cè)到較低的抑制水平(-15％)。未進(jìn)行細(xì)胞溶質(zhì)酶類(lèi)釋放的檢測(cè)以確定還原酶活性的損失不與壞死的細(xì)胞溶解相關(guān)，但是通過(guò)對(duì)與0.02％的任何生物活性組合物接觸48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡檢查沒(méi)有見(jiàn)到膜碎片的證據(jù)。此外，如下文所示，在mts還原被顯著減弱的條件下所述細(xì)胞顯示仍然能夠分泌至少一種mmp。這些結(jié)果提示，在這些細(xì)胞以及乳腺腫瘤細(xì)胞系中還原酶活性損失是與線粒體功能的相對(duì)選擇性的損失相關(guān)，并且可以反映出程序性細(xì)胞死亡或凋亡通路的開(kāi)啟。mmp的分泌。已經(jīng)使用兩種不同的分析方法來(lái)檢測(cè)由monomac6細(xì)胞釋放的兩種明膠酶類(lèi)mmp-2(明膠酶a)和mmp-9(明膠酶b)的水平。這些mmp已顯示與炎癥性組織損害以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。所用的mmp-2和mmp-9的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisas)首先用于評(píng)估在10nmpma和不同劑量的三種山茶屬生物活性組合物和陽(yáng)性對(duì)照的存在下培養(yǎng)48小時(shí)的monomac6細(xì)胞的培養(yǎng)基中這兩種酶的總水平。該細(xì)胞系在其未受刺激時(shí)僅分泌mmp-2，但在其活化時(shí)同時(shí)分泌mmp-2和mmp-9。(24小時(shí)后mmp的釋放水平通常太低而不能可靠地檢測(cè))。elisa檢測(cè)結(jié)果如圖34至37所示。如細(xì)胞壁部分提取物和白茶提取物對(duì)monomac6細(xì)胞的mts還原所觀察到的作用，以任何劑量的這些提取物對(duì)所分泌的mmp-2和mmp-9水平都無(wú)顯著改變。在膜部分提取物和細(xì)胞汁液的最高劑量(0.01％w/v)下，觀察到mmp-2的水平降低，在此劑量下膜部分提取物表現(xiàn)出最強(qiáng)的效能。應(yīng)當(dāng)注意，在下一個(gè)最高劑量的組合物b(0.001％)和組合物d(0.002％)下觀察到mmp-2釋放的明顯的輕微刺激。該刺激是在類(lèi)似劑量的此類(lèi)組合物存在下tgf-β處理后的mcf-7細(xì)胞中mts還原酶活性刺激的暗示。由elisa檢測(cè)的劑量依賴(lài)性的mmp-2水平的降低不與膜提取部分和細(xì)胞汁液對(duì)mmp-9水平的影響平行。這些水平在較高劑量下升高(由細(xì)胞汁液引起的明顯顯著)，但是在較低檢測(cè)劑量下無(wú)變化。由與僅24小時(shí)就產(chǎn)生mts還原酶活性顯著抑制的山茶屬制劑的劑量接觸48小時(shí)的monomac6細(xì)胞分泌的mmp-9水平的未變化或升高的檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)了與山茶屬的膜部分提取物或細(xì)胞汁液接觸的monomac6細(xì)胞中線粒體功能的損失不反映出壞死性細(xì)胞溶解，在此情況下mmp分泌將突然停止。作為山茶屬組合物影響monomac6細(xì)胞的mmp分泌的進(jìn)一步證據(jù)，使用明膠酶譜法來(lái)檢測(cè)如上文elisa檢測(cè)所述方法收集的培養(yǎng)基。在該方法中，首先將所述培養(yǎng)基在明膠浸透的聚丙烯酰胺凝膠中在十二烷基硫酸鈉的存在下電泳(sds-page)，以將蛋白質(zhì)按照分子量分離。隨后，將sds從凝膠中洗出，使得任何酶類(lèi)的至少一部分存在以進(jìn)行復(fù)性，并將該凝膠在培養(yǎng)基中孵育，其將mmp活性最大化。mmp溶解明膠，無(wú)論其存在于哪里。用蛋白質(zhì)染色將凝膠塊中未消化的明膠可視化以后，掃描該凝膠，mmp顯示為相對(duì)于染色后背景的亮區(qū)。此處提供的是負(fù)像，因此mmp相對(duì)于亮色背景為暗區(qū)。應(yīng)當(dāng)注意地是，mmp是作為無(wú)活性的前體由大部分細(xì)胞分泌，其隨后在細(xì)胞外活化。但是，由于在酶譜法中所用的變性和復(fù)性次序，即使無(wú)活性的mmp的前體形式仍然具有溶解明膠的活性并產(chǎn)生亮區(qū)。圖34至37顯示了monomac6細(xì)胞與不同的山茶屬生物活性組合物接觸48小時(shí)后收集的培養(yǎng)基以及從不存在(u)或存在(s)10nmpma、但是不存在山茶屬組合物情況下培養(yǎng)的細(xì)胞中收集的培養(yǎng)基的明膠酶譜的負(fù)像。僅用制劑的最低劑量(0.0001％,“l(fā)o”)和最高劑量(0.01％,“hi”)來(lái)評(píng)價(jià)組合物a和陽(yáng)性對(duì)照的作用，而組合物b和d的作用還在0.001％的中間劑量(“med”)進(jìn)行評(píng)價(jià)。從四個(gè)平板可以顯而易見(jiàn)，在不含pma情況下monomac6細(xì)胞僅釋放mmp-2(～67kd)，并且該酶主要以前體形式發(fā)現(xiàn)。用10nmpma處理導(dǎo)致誘導(dǎo)mmp-9的分泌(～92kd)，以及將顯著水平的兩種mmp的前體形式轉(zhuǎn)化為其略低分子量的活性形式的進(jìn)一步蛋白水解活性。與elisa結(jié)果一致，與細(xì)胞壁部分和白茶提取物接觸的pma-刺激的monomac6細(xì)胞經(jīng)明膠酶譜法顯影對(duì)兩種mmp的前體或活化形式水平均無(wú)可檢測(cè)到的作用。相反，經(jīng)明膠酶譜法顯影，與最高劑量的組合物b或d接觸導(dǎo)致mmp-2水平的顯著減少，但是對(duì)mmp-9的水平無(wú)明顯改變。mmp-9的前體和活性形式的出現(xiàn)，以及對(duì)應(yīng)于在從用最高劑量組合物b和d處理過(guò)的細(xì)胞中收集的培養(yǎng)基中見(jiàn)到的mmp-2活性形式的微弱但是可識(shí)別的條帶，提示了在這些培養(yǎng)的細(xì)胞中這些組合物主要作用于mmp-2釋放的調(diào)節(jié)，而不涉及對(duì)mmp活化機(jī)制的額外作用。實(shí)施例18山茶屬生物組合物的對(duì)比評(píng)價(jià)：結(jié)論概述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)指出山茶屬生物活性組合物觸發(fā)mts還原酶活性的劑量依賴(lài)性損失，其一般而言歸因于線粒體功能的損失。該抑制作用需要至少接觸48小時(shí)才能檢測(cè)到，并且至少在前24小時(shí)無(wú)可檢測(cè)到的細(xì)胞溶質(zhì)酶類(lèi)的釋放，提示了生物活性組合物并非引發(fā)了壞死性細(xì)胞溶解，而是開(kāi)啟了腫瘤細(xì)胞中的程序性或細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡的通路。mcf-7細(xì)胞和mda-mb-435s細(xì)胞響應(yīng)的時(shí)間-及劑量-依賴(lài)性的差異以及mcf-7細(xì)胞的tgf-β處理的作用，全部都指出更加侵襲性和轉(zhuǎn)移性的表型對(duì)白茶提取物、細(xì)胞壁提取物都具有一定程度增加的抗性，而在某種程度上還有細(xì)胞汁液，其證實(shí)在接觸的前24小時(shí)內(nèi)具有相對(duì)中度的還原酶活性損失。但是，膜部分提取物由其在tgf-β-處理過(guò)的mcf-7細(xì)胞以及mda-mb-435s細(xì)胞中在24小時(shí)內(nèi)抑制mts還原酶活性的能力證實(shí)了其更強(qiáng)效能的傾向。所檢測(cè)的山茶屬生物活性組合物對(duì)monomac6細(xì)胞系(人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞模型)的作用與在乳腺腫瘤細(xì)胞系中觀察到的作用具有某種相似性。根據(jù)在乳腺腫瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的不存在以及在monomac6細(xì)胞的培養(yǎng)基中存在mmp-9分泌的正常至升高水平，可以總結(jié)出即使在最高檢測(cè)劑量下(0.01％w/v)這些組合物也不會(huì)引起壞死性細(xì)胞溶解。然而，兩種生物活性組合物(膜部分提取物和細(xì)胞汁液)引起線粒體還原酶活性的劑量依賴(lài)性抑制，其反映了monomac6細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞凋亡通路的開(kāi)啟。此外，這些炎癥細(xì)胞與膜部分提取物和細(xì)胞汁液接觸導(dǎo)致明膠分解酶mmp-2(明膠酶a)水平的選擇性降低。明膠酶譜法顯示“前體形式”或酶原活化機(jī)制不受山茶屬生物活性組合物影響，因此在培養(yǎng)基中mmp-2水平的降低反映出蛋白水解破壞增強(qiáng)是非常不可能的。因此，全部檢測(cè)細(xì)胞系(即人乳腺癌早期階段模型、晚期乳腺癌細(xì)胞模型和單核細(xì)胞性白血病模型)的代謝活性都被膜部分提取物(組合物b)和細(xì)胞汁液(組合物d)(大部分情況下)有效地抑制。值得注意地是，茶的細(xì)胞壁提取物(組合物a)和白茶提取物(陽(yáng)性對(duì)照)被證實(shí)無(wú)活性或者比上述組合物b和d的效能低很多。在不存在和存在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子情況下所有檢測(cè)的mcf-7人癌細(xì)胞、mda-mb-435s晚期人乳腺癌細(xì)胞和刺激和未刺激的單核細(xì)胞樣monomac6細(xì)胞都清楚地證實(shí)了該傾向。與生物活性山茶屬組合物檢測(cè)和評(píng)價(jià)的概述相關(guān)的數(shù)據(jù)如表15中所示。表15—生物活性山茶屬組合物的檢測(cè)和評(píng)價(jià)的概述表15顯示山茶屬制劑以劑量依賴(lài)的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的能力按如下次序升高：白茶提取物＝細(xì)胞壁部分提取物>細(xì)胞汁液>膜部分提取物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，通過(guò)將新鮮植物組織加工成細(xì)胞汁衍生的膜部分提取物(組合物b)和細(xì)胞汁液(組合物d)而制備的新的生物活性山茶屬組合物不會(huì)觸發(fā)任何對(duì)細(xì)胞的徹底的壞死性毒性。因此，本發(fā)明的技術(shù)顯示了顯著提升山茶屬生物活性組合物效能的能力，以及制備令人印象非常深刻的證實(shí)對(duì)活的人細(xì)胞具有按常規(guī)山茶屬技術(shù)生產(chǎn)的最佳產(chǎn)品(例如白茶提取物)所無(wú)法證實(shí)的活性的新產(chǎn)品的能力。實(shí)施例19山茶屬生物活性組合物的對(duì)比評(píng)價(jià)：未來(lái)研究的意義本發(fā)明的山茶屬生物活性組合物對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的蛋白水解活性的作用對(duì)于炎癥性組織損害以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移具有意義。因此，可以清楚地建議乳腺癌細(xì)胞和單核細(xì)胞性白血病作為本發(fā)明的山茶屬生物活性組合物(最值得注意地是組合物b(膜部分提取物))的預(yù)期靶點(diǎn)。以前已經(jīng)顯示，結(jié)腸癌來(lái)源的細(xì)胞系colo205釋放顯著水平的mmp-2，其隨后被也由該細(xì)胞分泌的類(lèi)胰蛋白酶活化。基于monomac6細(xì)胞的結(jié)果，該類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞是本發(fā)明的山茶屬生物活性組合物的許多潛在靶點(diǎn)之一。從這些研究中，可以確定從本發(fā)明的新鮮山茶屬中分離的生物活性組合物具有顯著的活性，其導(dǎo)致關(guān)鍵細(xì)胞功能的令人印象深刻的調(diào)整。已觀察到的作用對(duì)于從個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品乃至營(yíng)養(yǎng)品和潛在藥物來(lái)說(shuō)具有有價(jià)值的應(yīng)用。實(shí)施例20用于確定生物活性組合物的某些特性的方法以下是用于確定生物活性組合物的某些特性的不同方法。這些方法在上述實(shí)施例中用作參考。下文所述的“檢測(cè)產(chǎn)品”或“檢測(cè)樣品”是指生物活性組合物。方法1：測(cè)定固體含量的方法。測(cè)定固體含量的方法包括將所測(cè)試生物活性組合物在水浴中于100℃下蒸發(fā)直至水全部蒸發(fā)，將樣品于105℃下在烤箱中儲(chǔ)存3小時(shí)，冷卻至室溫，并立即測(cè)定裝有固體物質(zhì)的容器重量。方法2：測(cè)定不揮發(fā)殘余物的方法。測(cè)定不揮發(fā)殘余物的方法包括將測(cè)試生物活性組合物在105℃下在烤箱中儲(chǔ)存5小時(shí)，冷卻，并立即測(cè)定裝有固體物質(zhì)的容器重量。方法3：測(cè)定l＊a＊b＊值的方法。測(cè)定l＊a＊b＊值的方法是使用hunterlabscan固定幾何比色計(jì)用0°/45°的檢測(cè)幾何學(xué)測(cè)定l＊a＊b＊值。使用帶有朝上視窗的標(biāo)準(zhǔn)照明d65。將裝有所試驗(yàn)生物活性組合物的容器置于視窗上，并通過(guò)底部檢測(cè)。使用以下cielab等式：c*＝(a*2+b*2)1/2de*＝[(dl)2+(da*)2+(db*)2]1/2dh＝[(de*)2-(dl*)2-(dc*)2]1/2方法4：測(cè)定總類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)含量和葉黃素含量的方法。將試驗(yàn)生物活性組合物用丙酮提取。勻漿化并真空過(guò)濾后，將全部提取物用30％氫氧化鉀在甲醇中的溶液皂化。用石油醚將類(lèi)胡蘿卜素從生物活性組合物這連續(xù)提取。額外處理后并在乙醇中再次溶解，全部樣品在446nm下檢測(cè)。為了檢測(cè)葉黃素含量，來(lái)自各個(gè)樣品提取物的額外干燥樣品用于高效液相色譜(“hplc”)分析。將該干燥樣品再次溶于mtbe和甲醇中。使用裝有(250×4.60mmi.d.)5μmc18柱的反相hplc系統(tǒng)。葉黃素的鑒定是通過(guò)可靠標(biāo)準(zhǔn)的聯(lián)合色譜法來(lái)確定。葉黃素在乙醇中的摩爾吸光系數(shù)是144,800cm-1mol-1。方法5：測(cè)定彈性蛋白酶抑制活性的方法。使用試劑盒來(lái)測(cè)定試驗(yàn)生物活性組合物的彈性蛋白酶的抑制活性，該試劑盒使用了中性白細(xì)胞彈性蛋白酶(由“elastinproducts”生產(chǎn)的純化的酶制劑)和由“sigma”生產(chǎn)的合成肽可溶性底物甲氧基琥珀?；?ala-ala-pro-val-對(duì)硝基苯胺。底物的酶裂解導(dǎo)致產(chǎn)生隨時(shí)間黃色增強(qiáng)(405nm)；通過(guò)增加包含抑制活性的試驗(yàn)生物活性組合物的濃度使顏色產(chǎn)生的速率降低。抑制作用的濃度依賴(lài)性分析使得抑制活性的效能可以定量，表示為需要達(dá)到50％抑制率的每個(gè)測(cè)試生物活性組合物的干物質(zhì)的濃度(ic50)，而且還提供了與抑制模式相關(guān)的信息。為了測(cè)定ic50，彈性蛋白酶的濃度為2.5μg/ml且底物的濃度為150μm。為了測(cè)定ki，底物的濃度為100μm和200μm。方法6：測(cè)定明膠酶b(mmp-9)抑制活性的方法。在洗去其它蛋白酶以后，使用能夠在多孔微量培養(yǎng)板上通過(guò)免疫識(shí)別特異性地捕獲明膠酶b的市售的分布試驗(yàn)(由“amershampharmacia”生產(chǎn)的mmp-9活性elisa)。通過(guò)明膠酶b的低分子量合成底物：apma的水解，在405nm下檢測(cè)酶活性。該抑制的濃度依賴(lài)性分析用于測(cè)定所檢測(cè)的生物活性組合物干物質(zhì)的效能。方法7：測(cè)定超氧化物清除活性的方法。使用黃嘌呤氧化酶(由“sigma”生產(chǎn)的純化的酶制劑)的酶系統(tǒng)用于以高產(chǎn)率和可控的方式產(chǎn)生超氧負(fù)離子。通過(guò)該酶將黃嘌呤向氫化黃嘌呤的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生大量的超氧負(fù)離子，并且高鐵細(xì)胞色素c還原為亞鐵細(xì)胞色素c用作超氧化物水平的靈敏檢測(cè)。當(dāng)將試驗(yàn)生物活性組合物加入反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)，對(duì)亞鐵細(xì)胞色素c水平(550nm)的檢測(cè)是能夠測(cè)定其超氧化物清除活性。每孔的終濃度為細(xì)胞色素c75μm、黃嘌呤425μm/l和黃嘌呤氧化酶10mu/ml。方法8：測(cè)定體外毒性和細(xì)胞凋亡的方法。研究了celltiter96aqueous一種細(xì)胞增殖試驗(yàn)溶液和cytotox96非放射性細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及隨后的方案(兩種試驗(yàn)都由promegacorporation,madison,wis.生產(chǎn))。第一個(gè)試驗(yàn)是用于測(cè)定活細(xì)胞數(shù)量的比色法，其研究了四唑化合物(3-(4,5-二甲基噻-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑，內(nèi)鹽；mts和電子偶聯(lián)試劑(吩嗪硫酸甲脂；pms)。mts被細(xì)胞生物還原為在組織培養(yǎng)基中可溶的在490μm吸收度最大的甲臜產(chǎn)物。mts向水性可溶的甲臜的轉(zhuǎn)化是由在代謝活性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的脫氫酶來(lái)完成，并且甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)量成正比。第二個(gè)試驗(yàn)是脫氫酶(ldh)的定量檢測(cè)，脫氫酶是細(xì)胞溶胞后釋放的穩(wěn)定的細(xì)胞溶質(zhì)酶。在細(xì)胞培養(yǎng)基上清中釋放的ldh用30分鐘偶聯(lián)酶試驗(yàn)檢測(cè)，其導(dǎo)致四唑鹽(int)轉(zhuǎn)化為紅色甲臜產(chǎn)物。所形成顏色的量與溶胞的細(xì)胞數(shù)量成正比。方法9：測(cè)定由刺激后的細(xì)胞所分泌的酶水平的方法。用pma孵育后，monomac6細(xì)胞分泌兩種溶解明膠的基質(zhì)金屬蛋白酶，mmp-2(明膠酶a)和mmp-9(明膠酶b)。在試驗(yàn)生物活性組合物存在下這些酶的水平由二維十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)測(cè)定。實(shí)施例21用于檢測(cè)山茶屬產(chǎn)品的某些生物活性特性的細(xì)胞系認(rèn)為是晚期乳腺癌模型的細(xì)胞系mda-mb-435s是獲自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所(atcc編號(hào)htb-129)。將該細(xì)胞系在37℃下在以下atcc培養(yǎng)基中孵育：leibovitz'sl-15培養(yǎng)基，含有添加了0.01mg/ml胰島素的2mml-谷氨酰胺90％；胎牛血清10％。認(rèn)為是早期或較少未分化的乳腺癌模型的mcf-7細(xì)胞系是獲自atcc(編號(hào)htb-22)，將其在37℃下在以下atcc培養(yǎng)基中孵育：最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(eagle)，含有2mm的l-谷氨酰胺和調(diào)整包含1.5g/l碳酸氫鈉的earle'sbss、0.1mm非必需氨基酸和1mm丙酮酸鈉，并添加了0.01mg/ml牛胰島素，90％；胎牛血清，10％。細(xì)胞系monomac6(mm6，獲自germancollectionofmicroorganismsandcellcultures)與分化的人單核細(xì)胞(ziegler-heitbrock等人,“establishementofahumancellline(monomac6)withcharacteristicsofmaturemonocytes,”internationaljournalofcancer41:456-461(1988)，其以其整體引入本文作為參考)非常類(lèi)似。將細(xì)胞保存在rpmi1640中，添加2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mm丙酮酸鈉、10％fcs、非必需氨基酸、9μg/ml胰島素和1mm草乙酸。試驗(yàn)條件下，還加入0.2％葡萄糖。實(shí)施例22山茶屬產(chǎn)品的兒茶素分析分析本發(fā)明的細(xì)胞壁部分提取物、膜部分提取物和細(xì)胞汁液中不同的兒茶素含量。白茶樣品用作對(duì)照物。分析以下兒茶素：(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素；(+)-兒茶素；(-)-表兒茶素；(-)-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯；(-)-沒(méi)食子兒茶酸沒(méi)石子酸酯；和(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯。將樣品用0.1％h3po4萃取，并超聲處理15分鐘。離心后，將提取物注射入hplc上。c-18反相柱用作固定相。0.1％磷酸和乙腈用作流動(dòng)相。在280nm下檢測(cè)。該計(jì)算是基于將各種列出的兒茶素與其純度標(biāo)準(zhǔn)品面積的比較。結(jié)果如圖38和表16(下文)所示。表16實(shí)施例23某些山茶屬產(chǎn)品的功能性飲料和個(gè)人護(hù)理應(yīng)用介紹：活的茶植物能力的應(yīng)用皮膚是人體最大的器官，而且是對(duì)其他人而言最明顯的器官。其外觀不僅反映外在的損害和局部護(hù)理，而且還反映了個(gè)體的總體健康狀況。根據(jù)epstein的最近綜述，保持健康代謝、特別是關(guān)于胰島素敏感性、血糖水平和適合的氨基酸攝入，對(duì)于保持更加年輕樣的皮膚而言至關(guān)重要。同時(shí)，控制氧化損害和炎癥的惡性循環(huán)仍然任務(wù)艱巨。[1]lesleye.rhodes等人最近的研究提供了當(dāng)口服時(shí)綠茶化合物、綠茶兒茶素類(lèi)的潛在健康益處。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，是將綠茶兒茶素代謝物引入人皮膚，并保護(hù)避免由uv照射引起的與促炎癥類(lèi)二十烷酸12-羥基二十碳四烯酸產(chǎn)生減少相關(guān)的皮膚炎癥，并且可能有助于保護(hù)避免曬傷炎癥和潛在的長(zhǎng)期uvr-介導(dǎo)的損害。[2]因此，茶植物(山茶)可能從內(nèi)到外都有助于實(shí)現(xiàn)皮膚健康。成分cs是經(jīng)zetafractiontm技術(shù)從活的山茶中開(kāi)發(fā)用于潛在個(gè)人護(hù)理應(yīng)用，并且其多功能活性以前在personalcare雜志的2012年11月版中由koganov等人描述過(guò)。該實(shí)施例23包括關(guān)于用于功能飲料的活的茶植物能力的應(yīng)用的持續(xù)研究，其可以潛在地支持“內(nèi)在美”的概念；以及用于具有抗氧化特性的局部個(gè)人護(hù)理制劑。此外，該實(shí)施例23包括基于該成分的飲料制劑與傳統(tǒng)綠茶和紅茶以及市售的基于茶的飲料的對(duì)比評(píng)價(jià)。purecentiatm山茶–用于支持“內(nèi)在美”概念的功能飲料zetafractiontm技術(shù)用于開(kāi)發(fā)功能飲料應(yīng)用purecentiatmcamellia和局部美容應(yīng)用cs植物汁液部分兩者的有效成分。用于個(gè)人護(hù)理的成分cs[3]和開(kāi)發(fā)為用于功能飲料應(yīng)用的有效成分purecentiatm山茶的區(qū)別與特定應(yīng)用的生產(chǎn)規(guī)程和防腐系統(tǒng)相關(guān)。purecentiatm山茶與紅茶和綠茶傳統(tǒng)制劑比較purecentiatm山茶、綠茶和紅茶傳統(tǒng)制劑均獲自在位于美國(guó)南加州中心wadmalawisland的charleston茶葉種植場(chǎng)于2012年6月采集的相同茶樹(shù)品種。對(duì)于不同茶植物制劑的精確比較而言，相同樹(shù)種的使用是關(guān)鍵性的；如karori等人所示樹(shù)種類(lèi)型能夠顯著影響茶葉產(chǎn)品的特性[4]；因此，相同樹(shù)種的使用消除了與樹(shù)種類(lèi)型相關(guān)的差異性。purecentiatm山茶制劑：purecentiatm山茶是按照koganovus7,473,435；8,043,635and8,318,220中所述方法制作，所述公開(kāi)物以其整體引入本文作為參考。[5-7]紅茶傳統(tǒng)制劑：將去離子水加熱至約99℃；將2.0g錫等級(jí)散裝紅茶置于燒杯中；當(dāng)水達(dá)到所需溫度時(shí)，將水倒入裝有茶葉的燒杯中；將該燒杯封蓋，并在磁力攪拌器上放置四分鐘；四分鐘過(guò)去后，將該燒杯從攪拌器上移去，并將該紅茶制劑經(jīng)過(guò)濾器倒出，冷卻至室溫。綠茶傳統(tǒng)制劑：將去離子水加熱至約85℃；將2.0g錫等級(jí)散裝綠茶置于燒杯中；當(dāng)水達(dá)到所需溫度時(shí)，將水倒入裝有茶葉的燒杯中；將該燒杯封蓋，并在磁力攪拌器上放置兩分鐘；兩分鐘過(guò)去后，將該燒杯從攪拌器上移去，并將該綠茶制劑經(jīng)過(guò)濾器倒出，冷卻。分析性評(píng)價(jià)來(lái)自活的茶植物的purecentiatm山茶相對(duì)于紅茶和綠茶傳統(tǒng)制劑的物理化學(xué)參數(shù)如下表17中所示。表17–purecentiatm山茶、紅茶和綠茶傳統(tǒng)制劑的物理化學(xué)參數(shù)＊＊全部分析性評(píng)價(jià)都快速地進(jìn)行以對(duì)未保存過(guò)的制劑進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)purecentiatm山茶、紅茶和綠茶傳統(tǒng)制劑進(jìn)行l(wèi)c(液相色譜)-elsd(蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器)評(píng)價(jià)。elsd絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于保留時(shí)間如圖39中所示；且elsd相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于保留時(shí)間如圖40中所示。圖39中峰高的差異顯示了檢驗(yàn)品中單個(gè)成分濃度的差異。在圖40中，將相同數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)度，各個(gè)信號(hào)強(qiáng)度中“0”為最小且“1”為最大，以顯示峰的位置及其大小的比例。還進(jìn)行l(wèi)c(液相色譜)-dad(二極管陣列檢測(cè)器)評(píng)價(jià)。各自的lc-dad三維色譜圖如圖41-43中所示。通過(guò)這些表征以及酶解圖譜法的數(shù)據(jù)顯示出purecentiatm山茶的組合物與綠茶和紅茶傳統(tǒng)制劑相比較具有顯著的性質(zhì)上的差異。purecentiatm山茶具有更高的固體含量、某些峰的更好表示以及更強(qiáng)的化合物多樣性?？傊琾urecentiatm山茶比傳統(tǒng)紅茶和綠茶制劑具有更高的濃度，并且包含更多組分；其表征正在進(jìn)行中。用lc-ms(液相色譜-質(zhì)譜)分析l-茶氨酸的濃度l-茶氨酸是幾乎僅在茶植物的樹(shù)葉中才能發(fā)現(xiàn)的非必需氨基酸，并且當(dāng)作為補(bǔ)充劑口服時(shí)提供多種健康益處。[8]某些公司生產(chǎn)的皮膚護(hù)理產(chǎn)品開(kāi)始在其化妝品中包含l-茶氨酸。例如dermascriptive，在晚霜中包含l-茶氨酸以濕潤(rùn)并向壓力皮膚提供營(yíng)養(yǎng)。[9]三個(gè)樣品中l(wèi)-茶氨酸的量如下表18中所示。表18–來(lái)自活的茶植物的purecentiatm山茶與紅茶和綠茶傳統(tǒng)制劑中l(wèi)-茶氨酸的比較purecentiatm山茶紅茶傳統(tǒng)制劑綠茶傳統(tǒng)制劑l-茶氨酸(μg/ml)11502333l-茶氨酸(μg/ml)3000+2333液相色譜-質(zhì)譜分析顯示purecentiatm山茶比傳統(tǒng)紅茶和綠茶制劑具有更高濃度的l-茶氨酸。purecentiatm山茶與紅茶、綠茶傳統(tǒng)制劑和市售的基于茶的飲料相比的抗氧化劑活性市售基于茶的飲料的成分(標(biāo)簽信息)和物理化學(xué)參數(shù)如下表19所示。表19–市售基于茶的飲料的成分(標(biāo)簽信息)和物理化學(xué)參數(shù)purecentiatm山茶、紅茶和綠茶傳統(tǒng)制劑與市售基于茶的飲料的相對(duì)orac活性比較如圖44中所示。orac實(shí)驗(yàn)顯示試驗(yàn)的市售的綠茶飲料，最高的orac值比最低的高大約五倍。試驗(yàn)的傳統(tǒng)茶制劑的活性在此范圍內(nèi)。但是，應(yīng)當(dāng)注意，飲料的抗氧化劑活性部分地來(lái)自茶以外的其它來(lái)源–例如檸檬酸和抗壞血酸，以及在某些情況下的草藥(herbal)提取物。purecentiatm山茶的活性比效果最佳的試驗(yàn)的市售綠茶飲料高超過(guò)二十倍，并且甚至5％的purecentiatm山茶制劑超過(guò)了試驗(yàn)的市售飲料。這提示了，purecentiatm山茶可能成為向現(xiàn)有飲料中添加抗氧化活性的有效成分，或者用其作為基礎(chǔ)活性成分來(lái)制作功能性飲料。具有抗氧化特性的個(gè)人護(hù)理制劑研究了個(gè)人護(hù)理制劑的抗氧化劑活性，如表20中所示。表20–含有0.5％cs＊的精華膠＊不含cs的精華膠基質(zhì)含有去離子水代替cs。含有0.5％cs的精華膠與不含cs的精華膠的抗氧化劑活性在orac實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)價(jià)。將這些制劑在室溫下和45℃下保持2個(gè)月，然后對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些試驗(yàn)品的相對(duì)orac活性如圖45所示。如個(gè)人護(hù)理原型的數(shù)據(jù)所示，cs的抗氧化劑作用顯著高于精華膠基質(zhì)制劑。加速穩(wěn)定性試驗(yàn)過(guò)程在45℃下進(jìn)行2個(gè)月，該制劑的抗氧化劑作用降低了精華膠基質(zhì)的～11％，且僅降低了包含cs的精華膠的～4％。數(shù)據(jù)證實(shí)，cs在個(gè)人護(hù)理凝膠原型中保留了其活性，且有助于保持該制劑中其它組分的抗氧化劑活性。方法重量摩爾滲透壓濃度，每單位質(zhì)量溶液中溶質(zhì)顆粒的數(shù)量(例如每千克毫滲摩爾)，是按照基于設(shè)備手冊(cè)的方法使用來(lái)自advancedinstruments,inc(norwood,ma,usa)的冰點(diǎn)降低滲壓計(jì)model3250進(jìn)行檢測(cè)。折射率(nd)，光在真空中的光速與光在其它介質(zhì)中光速的比率，其確定了當(dāng)光線從一種介質(zhì)中通過(guò)另一種介質(zhì)是其轉(zhuǎn)折的情況，是按照基于設(shè)備手冊(cè)的方法使用來(lái)自reicherttechnologies(depew,ny,usa)的reichertarias500折射計(jì)在20℃下檢測(cè)。密度，每單位體積質(zhì)量的量度(例如每立方厘米的克數(shù))，是按照基于設(shè)備手冊(cè)的方法使用來(lái)自mettler-toledollc(columbus,oh,usa)的densito30px密度計(jì)在環(huán)境溫度下檢測(cè)。干物質(zhì)，在105℃下持續(xù)24小時(shí)以將水喝揮發(fā)性化合物從樣品中蒸發(fā)除去后剩余質(zhì)量的百分比，已按照基于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐的方法使用來(lái)自ohaus公司(parsippany,nj,usa)的ohausexplorere00640分析天平和來(lái)自spxthermalproductsolutions(rochester,ny,usa)的lindbergbluem重力烤箱測(cè)定。lc(液相色譜)–elsd(蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器)或dad(二極管排列檢測(cè)器)。在40℃下將整4μl注射體積的三個(gè)樣品在裝有反相c18柱(kinetexc18coreshell,4.6mmi.d.x10cm,2.6μm顆粒大小，和孔徑,phenomenex,usa)的agilent1260infinitylc上分離。溶劑梯度通過(guò)將溶劑a(含有0.1％甲酸的100％水)與溶劑b(含有0.1％甲酸的100％乙腈)混合以0.8ml/min的流速產(chǎn)生。25分鐘lc梯度按照如下方法產(chǎn)生：5％溶劑b，0～0.5分鐘(等度)；5％-30％溶劑b，0.5～6.5分鐘(線性)；30％–100％溶劑b，6.5～13.5分鐘(線性)；100％溶劑b，13.5～18.5分鐘(等度)；100％～5％溶劑b，18.5～20分鐘(線性)；5％溶劑b，20～25分鐘(等度)。用elsd(model300s,softa公司,westminster,co,usa)和dad(1040a,hewlett-packard)在多個(gè)波長(zhǎng)(uv＝204nm、254nm、270nm、280nm、320nm、350nm和410nm)下收集數(shù)據(jù)。l-茶氨酸分析的lc-ms(液相色譜-質(zhì)譜)。將樣品稀釋后進(jìn)行l(wèi)c-ms分析：將purecentiatm山茶稀釋100倍，將紅茶和綠茶傳統(tǒng)制劑稀釋10倍。為了產(chǎn)生用于定量的校正曲線，制備許多種濃度的l-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品。使用裝有aquac18柱(4.6μmi.d.×15cm,5μm顆粒大小，和孔徑,phenomenex,usa)的agilent1100lc系統(tǒng)用等度溶劑a(80％水和20％乙腈，含有0.1％甲酸)以0.8ml/min的流速洗脫4分鐘來(lái)分離所述樣品。將該lc系統(tǒng)通過(guò)點(diǎn)噴射離子化(esi)源(lctpremier,waters公司,milford,ma,usa)與飛行時(shí)間(tof)質(zhì)譜儀偶聯(lián)，并且該ms譜需要50-500m/z(正離子模式)的m/z掃描范圍。l-茶氨酸在～1.9分鐘的保留時(shí)間洗脫出，并通過(guò)其特征性離子175.2m/z進(jìn)行定量。氧自由基吸收容量(orac)?？寡趸瘎┗钚允鞘褂脕?lái)自biotek的“performingoxygenradicalabsorbancecapacity(orac)assayswithsynergyhtmulti-detectionmicroplatereader”applicationnote中所述方法通過(guò)orac檢測(cè)來(lái)確定，在(www.biotek.com/resources/docs/orac_assay_application_note.pdf)中可以獲得，其修正使用了來(lái)自biotekinstrumentsinc(winooski,vt)的synergy2全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀。在該實(shí)驗(yàn)中，aaph(2,2'-偶氮二2-氨基-丙烷)產(chǎn)生破壞熒光探針(熒光素鈉)的活性氧種類(lèi)?？寡趸瘎├?r)-trolox甲醚阻止或減緩這種破壞，且其作用可以通過(guò)熒光檢測(cè)進(jìn)行定量。在激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定在485nm且發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)定在528nm下、200μl的反應(yīng)體積、55mm的aaph濃度、1.33μm的熒光素鈉濃度以及80μm至2μm之間的(r)-trolox甲醚濃度下于37℃連續(xù)進(jìn)行熒光讀數(shù)2小時(shí)。熒光素鈉(fluka46960)、aaph(sigma440914)和(r)-trolox甲醚(fluka93509)是獲自sigma-aldrich(st.louis,mo)。auc(曲線下面積)值計(jì)算為比例(當(dāng)前孔的熒光讀數(shù)除以該孔第一次的熒光讀數(shù))的總和。將用去離子水的各孔的平均auc值從含有(r)-trolox甲醚的各孔以及含有檢測(cè)樣品的各孔的auc中扣減，得到對(duì)應(yīng)于抗氧化劑熒光保持的auc。各孔抗氧化劑的功能-相關(guān)auc產(chǎn)生的校正曲線顯示(r)-trolox甲醚化學(xué)當(dāng)量的orac活性。在去離子水中用來(lái)自scientificindustries,inc(bohemia,ny)的vortexgenie2來(lái)制備樣品的稀釋劑。將精華膠樣品以25％至3.125％之間的w/w濃度稀釋?zhuān)瑐鹘y(tǒng)茶制劑以10％至0.31％的w/w濃度稀釋?zhuān)襭urecentiatm山茶以2％至0.13％的w/w濃度稀釋。以實(shí)現(xiàn)與由1單位重量(r)-trolox甲醚所產(chǎn)生等價(jià)的抗氧化劑作用所必需的單位重量的檢測(cè)樣品來(lái)計(jì)算檢測(cè)樣品的orac活性，數(shù)字越低說(shuō)明orac活性越強(qiáng)。結(jié)論從所應(yīng)用的表征和酶解圖譜法得到的數(shù)據(jù)顯示使用zetafractiontm技術(shù)得到的purecentiatm山茶的組合物與綠茶和紅茶傳統(tǒng)制劑相比較的顯著的性質(zhì)上的差異。purecentiatm山茶具有更高的固體含量、某些峰的較好代表，以及化合物更強(qiáng)的多樣性；此外，其與傳統(tǒng)紅茶和綠茶制劑相比，具有濃度高很多的l-茶氨酸?？傊?，purecentiatm山茶比傳統(tǒng)紅茶和綠茶制劑具有高很多的濃度，且包含更多組分。purecentiatm山茶的活性比效能最佳的檢測(cè)的市售綠茶飲料高超過(guò)20倍，且甚至5％的purecentiatm山茶飲料原型超過(guò)了每個(gè)檢測(cè)的市售飲料。這說(shuō)明purecentiatm山茶可能成為向現(xiàn)有飲料中添加抗氧化劑活性的有效成分，或者用其作為基礎(chǔ)活性成分來(lái)制作功能性飲料?；瘖y品成分cs在個(gè)人護(hù)理凝膠原型中保留了其抗氧化劑活性，并且有助于保持該制劑中其它組分的抗氧化劑活性。實(shí)施例23的參考文獻(xiàn)以下是實(shí)施例23中引用的參考文獻(xiàn)：[1]howarda.epstein.thechallengesofformulating“beautyfromwithin”productsforskincare.monographicsupplementseries：anti-aging&beautyinside.householdandpersonalcaretodayn1/2012&agrofoodindustryhi-techvol23n1january/february2012，pp.23-2；[2]lesleye.rhodes，gemmadar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