本發(fā)明大體上涉及抗微生物肽和它們的使用方法。
背景技術(shù)：
：盡管在過去一個世紀(jì)中生活標(biāo)準(zhǔn)和生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有了顯著的改善，但傳染病的全球負(fù)擔(dān)仍然極高，并且是公共衛(wèi)生、經(jīng)濟(jì)和社會問題的主要原因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計，傳染病和寄生蟲病如肺炎、結(jié)核病、腦膜炎、腹瀉病、HIV和瘧疾是全世界第二大死亡原因。在工業(yè)化國家中廣泛和經(jīng)常不加區(qū)別地使用抗生素通過促進(jìn)抗藥性病原體的快速出現(xiàn)使得傳染病越來越難以用現(xiàn)有類別的抗生素加以控制而進(jìn)一步加劇了該問題?？股乜剐愿腥镜谋l(fā)危機(jī)加上新的小分子抗生素開發(fā)的持續(xù)缺乏，已引起相當(dāng)大的努力來發(fā)現(xiàn)和開發(fā)膜活性抗微生物肽(AMP)作為替代類別的抗微生物劑。天然存在的抗微生物肽也被稱為“宿主防御肽”，首先作為先天免疫的組成部分被發(fā)現(xiàn)，在所有活生物體中形成針對侵入的病原體的第一道防線。與抑制特定生物合成途徑如細(xì)胞壁或蛋白質(zhì)合成的常規(guī)抗生素不同，大多數(shù)陽離子抗微生物肽通過物理破壞帶更多負(fù)電荷的微生物膜脂質(zhì)雙層來誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)組分的滲漏，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡而發(fā)揮其活性。據(jù)認(rèn)為膜破壞的物理性質(zhì)使藥物產(chǎn)生抗性的可能性較低，因為對于微生物來說以與正遭受損傷時相同的速率突變或修復(fù)其膜組分在代謝上變得“代價更高”。盡管在過去30年中已分離并表征了來自各種來源(包括微生物、植物和動物)的超過1700種天然存在的抗微生物肽，但僅有極少數(shù)AMP如多粘菌素和短桿菌肽正在臨床上被使用；并且由于它們的高全身毒性而主要用于局部制劑中。對于應(yīng)用抗微生物肽作為藥物所確定的主要挑戰(zhàn)在于合成長肽序列的高成本、差的穩(wěn)定性和在全身施用后未知的毒性。在增強抗微生物活性和使非特異性毒性最小化的努力中，更多的研究人員越來越多地利用天然存在的抗微生物肽或蛋白質(zhì)序列作為模板來進(jìn)行化學(xué)修飾，如環(huán)化、序列截短和用D-氨基酸、β-氨基酸或氟化氨基酸取代，以產(chǎn)生對于體內(nèi)局部或全身感染具有更廣泛應(yīng)用的新的肽類似物。然而，目前優(yōu)化天然存在的抗微生物肽序列的方法充其量在很大程度上仍然是經(jīng)驗性的，使得極難以描述一般結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，尤其是針對大量序列和結(jié)構(gòu)多樣性的背景。此外，許多新的肽類似物保持較長(20個氨基酸或更多)，這可能誘導(dǎo)顯著的免疫原性并最終增加大規(guī)模制造的成本。更重要的是，已提出了使用具有與宿主防御抗微生物肽非常接近的序列的抗微生物肽可觸發(fā)對于先天AMP的抗性的發(fā)展，這可能不可避免地?fù)p害針對感染的天然防御，引起顯著的健康和環(huán)境風(fēng)險。同時，抗生素抗性細(xì)菌和真菌在醫(yī)院和社區(qū)環(huán)境中的快速出現(xiàn)已對世界各地的保健系統(tǒng)造成顯著壓力。盡管抗生素抗性病原體如抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)、抗萬古霉素的腸球菌(Enterococci)(VRE)以及多重抗藥性肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和不動桿菌屬種(Acinetobacterspp.)的全球性發(fā)生率已達(dá)到流行水平，但進(jìn)入臨床開發(fā)渠道的新抗生素的數(shù)量是令人沮喪的；自2000年以來僅有三種新結(jié)構(gòu)類別的抗生素，包括惡唑烷酮(利奈唑胺)、脂肽(達(dá)托霉素)和截短側(cè)耳素(瑞他莫林)進(jìn)入市場。鑒于病原菌如金黃色葡萄球菌(S.aureus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)正在對萬古霉素和碳青霉烯類產(chǎn)生抗性，這一開發(fā)尤其令人擔(dān)憂，萬古霉素和碳青霉烯類是在醫(yī)院中傳統(tǒng)上作為易感患者的最后一道防線保留的強效抗生素。隨著小分子抗生素開發(fā)的持續(xù)缺乏，具有可有效克服抗藥性機(jī)制的新作用模式的替代類別的抗微生物劑的設(shè)計和鑒別比以往更加迫切。由于大多數(shù)抗微生物肽通過快速和直接的膜溶解機(jī)制發(fā)揮它們的抗微生物活性，因此它們在克服微生物針對靶向特異性生物合成途徑的小分子抗生素獲得的常規(guī)抗生素抗性機(jī)制如微生物膜上藥物外排泵的增加表達(dá)、藥物降解酶的產(chǎn)生或藥物相互作用位點的改變等方面具有固有的優(yōu)勢。然而，限制抗微生物肽的成功臨床轉(zhuǎn)化的顯著障礙包括由于差的微生物膜選擇性所致的高全身毒性、相對高的制造成本(對于長肽序列)和對存在于生物體液如血清、傷口滲出物或淚液中的蛋白酶降解的敏感性。角膜炎一直是眼部發(fā)病的重要原因，并且它也是導(dǎo)致失明的主要眼部疾病。角膜炎的癥狀包括眼中的疼痛和發(fā)紅、視力模糊、對光的敏感性和多淚或過多分泌物。它可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失和角膜上的創(chuàng)傷。此外，角膜炎的發(fā)病率在過去30年里已增加，主要是由于在治療患有角膜炎的患者中頻繁使用局部皮質(zhì)類固醇和抗細(xì)菌劑，以及由于免疫功能不全的患者數(shù)量的上升。角膜炎的原因包括單純皰疹病毒1型、水痘帶狀皰疹和腺病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌和維生素A缺乏。2005年和2006年在美國以及法國、香港和新加坡報道了角膜炎的爆發(fā)。在美國的大多數(shù)病例涉及軟性角膜接觸鏡佩戴，其主要由真菌感染引起。由于幾個原因，角膜炎對于眼科醫(yī)生仍然是診斷和治療挑戰(zhàn)。主要的挑戰(zhàn)是快速和準(zhǔn)確的診斷。角膜炎的診斷通常通過培養(yǎng)或角膜活檢進(jìn)行。然而，在實驗室中分離和鑒別生物體的物種耗費時間，常常導(dǎo)致延誤診斷。此外，由于角膜炎可由各種微生物引起，因此不同類型的角膜炎經(jīng)常被誤診為彼此。例如，真菌性角膜炎經(jīng)常被誤診為細(xì)菌性角膜炎，因為臨床醫(yī)生經(jīng)常僅在假定的細(xì)菌性角膜炎在抗生素療法期間惡化后才考慮真菌性角膜炎。此外，抗真菌敏感性測試是不可靠的，并且與臨床功效差相關(guān)。即使準(zhǔn)確地進(jìn)行診斷，由于角膜滲透性差以及用于治療角膜炎的藥劑的商業(yè)可用性有限，因此對病況的管理仍然是一個挑戰(zhàn)。大多數(shù)市售藥物僅僅是抑制真菌的或殺細(xì)菌的，并且為了使該病況成功消退，它們需要完整的免疫系統(tǒng)和延長的療程。此類微生物特異性藥物是有缺點的，因為在可提供治療前需要對角膜炎原因進(jìn)行特異性診斷。此外，市售的抗真菌藥物沒有處理以下事實：真菌角膜炎感染經(jīng)常作為生物膜存在，生物膜特別難以去除，因為真菌細(xì)胞被包封在保護(hù)性和不可滲透的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中。因此，通常，為了力圖清除生物膜，治療需要顯著更高劑量的抗真菌劑。此外，目前的商業(yè)藥物包括唑類化合物(如氟康唑(funconazole))和聚烯(如兩性霉素B(amphopterinB)、制霉菌素和那他霉素)。唑類是抑制真菌的，其通過酶抑制起作用并且易于產(chǎn)生抗藥性。然而，本領(lǐng)域內(nèi)可用的唑類是極不穩(wěn)定的；它們的局部溶液必須保持冷藏不超過48小時并避光。本領(lǐng)域內(nèi)已知的另一抗真菌藥物是通過破壞穿過細(xì)胞膜的離子滲透性而起作用的聚烯，其相當(dāng)昂貴，水溶性差并且在水性、酸性或堿性介質(zhì)中或者在暴露于光和過熱時相當(dāng)不穩(wěn)定。所有這些限制了它們的臨床應(yīng)用。鑒于上述情況，需要提供可用于治療由各種微生物引起的角膜炎的替代藥劑。還需要提供可用于治療角膜炎的使用起來穩(wěn)定且安全的替代藥劑。技術(shù)實現(xiàn)要素：在一個方面，提供了包含(X1Y1X2Y2)n(式I)的兩親性肽在制造用于治療受試者的角膜炎的藥物中的用途，其中所述肽的C-末端被酰胺化；X1和X2彼此獨立地為疏水性氨基酸；Y1和Y2彼此獨立地為陽離子氨基酸，并且其中n為至少1.5，其中所述肽能夠自組裝成b-折疊結(jié)構(gòu)。在另一方面，提供了用于治療受試者的角膜炎的如本文所述的肽。在另一方面，提供了治療受試者的角膜炎的方法。所述方法包括施用藥學(xué)有效量的如本文所述的肽。在另一方面，提供了從受試者的角膜去除生物膜的方法。所述方法包括施用如本文所述的肽。附圖說明當(dāng)結(jié)合非限制實施例和附圖考慮時，參考具體實施方式將更好地理解本發(fā)明，其中：圖1顯示合成的形成β-折疊的肽的設(shè)計特征。A)顯示本公開的示例性肽。B)顯示呈現(xiàn)為線性分子的本公開的肽的示例。C)顯示由本公開的肽引起的可能的膜破壞的示意圖。簡單地說，在水溶液中，由于質(zhì)子化的Arg和/或Lys殘基之間的靜電排斥，因此肽以單體無規(guī)卷曲形式存在。然而，在微生物細(xì)胞膜存在下，肽容易組裝成通過帶正電荷的殘基和帶負(fù)電荷的磷脂之間的靜電相互作用而穩(wěn)定的β-折疊二級結(jié)構(gòu)，隨后它們的疏水殘基插入脂質(zhì)雙層中以介導(dǎo)膜破壞。圖2顯示(a)(VRVK)2-NH2(SEQIDNO:11)、(b)(IRIR)2-NH2(SEQIDNO:12)、(c)(IKIK)2-NH2(SEQIDNO:13)、(d)(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)、(e)(IRVK)2-NH2(SEQIDNO:14)、(f)(FRFK)2-NH2(SEQIDNO:15)、(g)(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)、(h)(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)、(i)(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)在去離子水和25mMSDS膠束溶液中的圓二色譜。圖2證實在微生物膜模擬條件(25mMSDS溶液)下本公開的肽如何容易自組裝成β-折疊二級結(jié)構(gòu)。圖3顯示合成的抗微生物肽的溶血活性。圖3顯示本公開的肽在不同的最小抑制濃度(MIC)值下誘導(dǎo)對大鼠紅細(xì)胞的最小溶血或無溶血。圖4顯示在用不同濃度(即0、0.5×最小抑制濃度(MIC)、MIC和2×MIC)的代表性肽(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)處理后的活微生物菌落形成單位(CFU)的圖。圖4圖3顯示本公開的肽在MIC值和MIC值以上是殺菌的。圖5顯示用含有10％(以體積計)水的液體培養(yǎng)基(作為對照)和代表性肽(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)的液體培養(yǎng)基處理2h的(a)大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)和(b)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的FE-SEM圖像。圖5顯示本公開的肽可引起大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的膜溶解。圖6顯示使用XTT法所測定的在用不同濃度的(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)處理24h的生物膜中的金黃色葡萄球菌的細(xì)胞活力。*P<0.01，相對于(IRVK)3-NH2。圖6顯示本公開的肽顯示出對駐留在生物膜中的金黃色葡萄球菌的劑量依賴性殺死。圖7顯示通過結(jié)晶紫染色所測定的用不同濃度的(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)處理24小時的預(yù)形成的金黃色葡萄球菌生物膜的生物量變化。圖7證實本公開的肽可用于去除生物膜。圖8顯示具有(a)兩個重復(fù)單元(n＝2)和(b)三個重復(fù)單元(n＝3)的本公開的肽對FITC標(biāo)記的LPS聚集體的穩(wěn)定性的影響。圖8證實本發(fā)明的肽在破壞脂多糖(LPS)聚集體方面有效。圖9顯示本公開的肽對大鼠巨噬細(xì)胞系NR8383中LPS刺激的NO產(chǎn)生的抑制作用。圖9證實本公開的肽在中和LPS的作用方面有效。圖10顯示在與不同濃度的本公開的肽培養(yǎng)18h后大鼠巨噬細(xì)胞系NR8383的細(xì)胞活力。圖10顯示本公開的肽的抗炎性質(zhì)獨立于它們對細(xì)胞活力的影響，并且所述肽在抗微生物活性和抗炎活性所需的濃度下是無細(xì)胞毒性的。圖11顯示在微生物膜模擬條件(25mMSDS膠束溶液)下(a)IK8對映異構(gòu)體、(b)IK12對映異構(gòu)體、(c)IK8立體異構(gòu)體和(d)對照肽的圓二色譜。圖11顯示在微生物膜模擬條件下本公開的肽容易自組裝以形成β-折疊二級結(jié)構(gòu)。圖12顯示在兔紅細(xì)胞中(a)IK8立體異構(gòu)體、(b)IK12對映異構(gòu)體和(c)IK8非形成β-折疊的肽對照的溶血活性。圖12顯示本公開的肽的D-立體異構(gòu)體在MIC值下表現(xiàn)出最小溶血或無溶血，對微生物膜具有高選擇性。圖13顯示在用蛋白酶(a)胰蛋白酶和(b)蛋白酶K處理6h后IK8-全部L和IK8-全部D針對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和綠膿假單胞菌的抗微生物活性。圖13顯示本公開的肽的所有D對映異構(gòu)體均為蛋白酶抗性的。圖14顯示在用不同濃度(即0、0.5×最小抑制濃度(MIC)、MIC和2×MIC)的IK8-全部D處理18h后的(a)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、(b)金黃色葡萄球菌、(c)大腸埃希氏菌、(d)綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和(e)白色念珠菌(Candidaalbicans)的活菌落形成單位(CFU)的圖。對每種微生物在MIC值和2×MIC值所設(shè)計的肽實現(xiàn)菌落計數(shù)超過3個對數(shù)減少(>99.9％殺死)，表明殺菌作用機(jī)制。圖14證實與L-對映異構(gòu)體類似，本公開的肽的D-對映異構(gòu)體具有殺菌機(jī)制。圖15顯示用125mgL-1IK8-全部D和含有10％(以體積計)HPLC水的MHBII處理2h的(a)金黃色葡萄球菌和(b)綠膿假單胞菌的FE-SEM圖像。圖15證實本公開的肽的D-對映異構(gòu)體可引起金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌的膜溶解。圖16顯示暴露于次最小抑制濃度(MIC)的IK8-全部D和不同的臨床使用的抗生素的(a)大腸埃希氏菌和(b)金黃色葡萄球菌的抗藥性產(chǎn)生曲線。圖16表明在所測試的時間范圍內(nèi)本公開的肽不誘導(dǎo)任何抗藥性的產(chǎn)生。圖17顯示在受感染的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(MOI10)中由IK8-全部D介導(dǎo)的金黃色葡萄球菌的細(xì)胞內(nèi)殺死。圖17證實本公開的肽具有針對受感染的細(xì)胞內(nèi)存在的細(xì)菌的強效的抗微生物性質(zhì)。圖18顯示在去離子水中(a)IK8對映異構(gòu)體、(b)IK8立體異構(gòu)體、(c)IK12對映異構(gòu)體和(d)對照肽的圓二色譜。圖18證實本發(fā)明的肽的對映異構(gòu)體和立體異構(gòu)體在去離子水中保持為無規(guī)卷曲，并且不采用任何二級結(jié)構(gòu)。圖19顯示證實胰蛋白酶和蛋白酶K對(a)(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(b)(irik)2-NH2(SEQIDNO:18)的蛋白質(zhì)水解活性的MALDI-TOF質(zhì)譜。箭頭指示主要的酶切割位點。圖19顯示，與L-對映異構(gòu)體相反，蛋白酶對本公開的D-對映異構(gòu)體肽的處理不會導(dǎo)致D-對映異構(gòu)體肽的降解。圖20顯示在用合成的抗微生物肽IK8-全部D處理18h后，對(a)抗環(huán)丙沙星的大腸埃希氏菌和(b)抗慶大霉素的大腸埃希氏菌的最小抑菌濃度(MIC)測定。圖20顯示本公開的肽的D-對映異構(gòu)體能夠以與野生型(非抗藥性)大腸埃希氏菌相同的濃度抑制抗慶大霉素的大腸埃希氏菌和抗環(huán)丙沙星的大腸埃希氏菌。圖21顯示針對小鼠肺泡巨噬細(xì)胞RAW264.7和人胎兒肺纖維母細(xì)胞WI-38細(xì)胞系的K8-全部D的細(xì)胞毒性研究。圖21證實本公開的肽的D-對映異構(gòu)體僅在遠(yuǎn)高于抗微生物濃度的濃度下是細(xì)胞毒性的。圖22顯示本公開的肽選擇性地殺死癌細(xì)胞(HeLa)并且對非癌性大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)和人真皮纖維母細(xì)胞系的細(xì)胞毒性較小。圖23顯示圖解說明肽(IKIK)2-NH2對白色念珠菌的殺死動力學(xué)的圖。圖23顯示在MIC水平處理2小時后白色念珠菌數(shù)目的顯著降低。大多數(shù)真菌在MIC4小時和在2×MIC或4×MIC1小時被根除。因此，圖23圖解說明本公開的肽是針對白色念珠菌的有用抗真菌劑。圖24顯示示出在用肽(IKIK)2-NH2處理24小時后白色念珠菌的細(xì)胞活力百分比的圖。圖24A顯示90％的白色念珠菌細(xì)胞在500mg/L的肽(IKIK)2-NH2的單次處理后24小時內(nèi)被殺死。圖24B顯示在相同濃度的相同肽的處理后顯著降低的白色念珠菌生物量。因此，圖24顯示本公開的肽可用于誘導(dǎo)白色念珠菌的死亡和降低白色念珠菌生物量。圖25顯示在用肽(IKIK)2-NH2處理之前和之后白色念珠菌生物膜的形態(tài)狀態(tài)的場發(fā)射掃描電子顯微圖像。在24小時處理后，白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)變形并且生物量顯著降低。因此，圖25顯示本公開的肽可用于使白色念珠菌的形態(tài)變形和降低白色念珠菌生物量。圖26顯示在局部施用肽(IKIK)2-NH2(即肽1)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)后角膜的組織學(xué)圖像。在局部施用所述肽后，使用蘇木精和曙紅的小鼠角膜的組織切片。比例尺：200μm。在局部施用3000mg/L肽1和肽2后角膜的組織學(xué)圖像未顯示角膜上皮侵蝕的顯著跡象，并且施加所述肽未導(dǎo)致基礎(chǔ)基質(zhì)中的明顯病理變化。因此，圖26顯示本公開的肽在用作滴眼劑時對眼是無毒的。圖27顯示在用H2O(對照)、兩性霉素B(AMB)(1000mg/L)、肽(IKIK)2-NH2(即肽1)(3000mg/L)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)(3000mg/L)處理后患有白色念珠菌角膜炎的小鼠眼的拍攝圖像。與對照組相比，在處理后觀察到角膜炎感染的顯著消退，角膜變得更透明并且虹膜可見。因此，圖27顯示本公開的肽的治療功效與兩性霉素B的治療功效相當(dāng)。圖28顯示描繪用以下四種局部滴眼劑治療之前和之后角膜炎的臨床裂隙燈評分(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)的條形圖：H2O(對照)、兩性霉素B(AMB)(1000mg/L)、肽(IKIK)2-NH2(即肽1)(3000mg/L)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)(3000mg/L)。兩性霉素B治療的眼和肽治療的眼的臨床評分顯著低于對照組中的眼的臨床評分(P<0.01)。因此，圖28顯示兩性霉素B治療的眼和肽治療的眼的評分沒有顯著差異。圖29顯示用指定溶液處理的角膜的組織學(xué)圖像。將角膜樣品包埋在石蠟中，并連續(xù)切片以用PAS染色；真菌被染成粉紅色。比例尺：200μm。在對照組中，真菌菌絲延伸到角膜基質(zhì)中，而用兩性霉素B(AMB)、肽1和肽2的處理減小了菌絲侵入角膜的最大深度。因此，圖29證實本公開的肽顯著降低了真菌在患有角膜炎的角膜中的浸潤。圖30顯示描繪在用兩性霉素B(AMB)、肽(IKIK)2-NH2(即肽1)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)處理后小鼠角膜中白色念珠菌的微生物學(xué)計數(shù)的條形圖。收集來自每組的六個角膜樣品(來自每只小鼠的一只眼)并分析。所述肽在減少眼球中白色念珠菌菌落的數(shù)目方面與兩性霉素B一樣有效，并且與未處理的對照組相比，約90％的真菌細(xì)胞在處理后從生物膜中被根除。因此，圖30顯示本公開的肽在根除小鼠眼中的固著性角膜炎相關(guān)真菌和它們的生物膜方面是有效的。附表簡述表1顯示本公開的肽的表征。表2顯示本公開的肽的最小抑制濃度(MIC)和選擇性指數(shù)。表3顯示本公開的肽的設(shè)計和表征。表4顯示本公開的肽的最小抑制濃度(MIC)和選擇性指數(shù)。表5顯示本公開的肽針對臨床分離的抗藥微生物的最小殺微生物濃度(MBC)。表6顯示本公開的肽針對臨床分離的結(jié)核分枝桿菌的最小抑制濃度(MIC)。表7顯示體內(nèi)角膜炎治療的臨床分級和評分。表8顯示本公開的肽的最小抑制濃度(MIC)。具體實施方式與天然存在的肽序列具有最小相似性的短合成肽的設(shè)計和優(yōu)化是用于開發(fā)用于臨床使用的安全且有效的抗微生物肽的有用策略。除了具有凈電荷在+2到+9之間的陽離子特征以及包含約30-50％的疏水性氨基酸殘基之外，不同天然存在的和合成的抗微生物肽的一個共同性還在于兩親性肽經(jīng)常在與微生物膜接觸時折疊以形成二級結(jié)構(gòu)。在折疊結(jié)構(gòu)的兩種主要形式(包括α-螺旋肽(例如抗菌肽cathelicidin、天蠶抗菌肽cecropin、爪蟾抗菌肽magainin)和β-折疊肽(例如防御素和抗菌肽protegrin))之間，已發(fā)現(xiàn)兩親性β-折疊肽的溶血性較低，同時具有與它們的相等電荷和疏水性的α-螺旋對應(yīng)物相當(dāng)?shù)目刮⑸锘钚浴Ｒ虼?，本公開的目的是提供具有β-折疊可折疊結(jié)構(gòu)的短合成肽，其具有抗微生物活性并且具有較低的溶血性。角膜炎是眼部發(fā)病的主要原因。角膜炎的不同原因常常被誤診為彼此，由此導(dǎo)致適當(dāng)治療的延誤。此外，由于缺乏用于臨床使用的安全且有效的抗角膜炎藥劑，因此角膜炎的治療仍然是一個挑戰(zhàn)。近年來，抗微生物肽(AMP)作為具有克服抗生素抗性的潛力的強效且廣譜的抗微生物劑已受到相當(dāng)大的關(guān)注。在本公開中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與形成非β-折疊的肽和市售的兩性霉素B相比，合成的形成β-折疊的肽可用于體內(nèi)角膜炎治療。因此，在一個方面，提供了包含(X1Y1X2Y2)n(式I)的兩親性肽在制造用于治療受試者的角膜炎的藥物中的用途，其中所述肽的C-末端被酰胺化；X1和X2可分別選自由疏水性氨基酸所組成的組；Y1和Y2可單獨地選自由陽離子氨基酸組成的組；并且n可以是至少1.5，其中所述肽能夠自組裝成β-折疊結(jié)構(gòu)。在一個示例中，本公開的發(fā)明人基于若干基本設(shè)計原理由天然存在的β-折疊可折疊AMP設(shè)計了由短重復(fù)的(X1Y1X2Y2)n-NH2序列組成的短合成β-折疊可折疊肽，所述基本原理包括但不限于：1)跨膜β-折疊中通常存在兩親性二分體重復(fù)，2)需要疏水殘基(例如但不限于Val、Ile、Phe和Trp)和陽離子殘基(例如但不限于Arg和Lys)以與微生物細(xì)胞壁和膜相互作用并使其混亂，以及3)Val、Ile、Phe和Trp的強β-折疊可折疊傾向。如本文所用的術(shù)語“兩親性肽”是指同時具有親水性能和親脂性能的肽，這兩種性質(zhì)由具有連接到疏水性氨基酸的陽離子氨基酸的肽賦予。如本文所用的術(shù)語“疏水性氨基酸”是指不溶于水的氨基酸殘基。在一個示例中，術(shù)語“疏水性氨基酸”可包括但不限于丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、組氨酸(H)、蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)和甘氨酸(G)。在一個示例中，疏水性氨基酸可以是丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)和半胱氨酸(C)。在一個示例中，疏水性氨基酸可以是異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)。如本文所用的術(shù)語“陽離子氨基酸”是指可溶于水的氨基酸殘基。在一個示例中，陽離子氨基酸可包括但不限于精氨酸(R)、賴氨酸(K)和組氨酸(H)。在一個示例中，兩親性肽是分離的肽。如本文所用的術(shù)語“分離的”是指不含或基本上不含例如與其天然締合的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸的肽。在一個示例中，兩親性肽可由(X1Y1X2Y2)n(式I)組成，其中X1和X2可彼此獨立地為疏水性氨基酸；Y1和Y2可彼此獨立地為陽離子氨基酸。因此，X1和X2可以是相同或不同的氨基酸并且Y1和Y2可以是相同或不同的氨基酸。在本公開中，n不可以是1，因為如本文所述的具有四個氨基酸的肽(例如X1Y1X2Y2(SEQIDNO：1))不具有抗微生物活性并且在微生物膜環(huán)境中不形成β-折疊。因此，n可以是約1.5到5。在一個示例中，n可以是1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5。在一個示例中，兩親性肽可包括但不限于X1Y1X2Y2X3Y3(SEQIDNO:2)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4(SEQIDNO:3)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5(SEQIDNO:4)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6(SEQIDNO:5)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7(SEQIDNO:6)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7X8Y8(SEQIDNO:7)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7X8Y8X9Y9(SEQIDNO:8)和X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7X8Y8X9Y9X10Y10(SEQIDNO:9)。在一個示例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7和X8可以是相同的或獨立地不同的氨基酸，并且Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7和Y8可以是相同的或獨立地不同的氨基酸。在一個示例中，本公開的肽可具有被酰胺化的C-末端。術(shù)語“C-末端”根據(jù)其在本領(lǐng)域內(nèi)通常已知的定義在本文中使用，即可與以下任何術(shù)語互換使用，如羧基端、羧基末端、C-尾端、C端或COOH-末端，其是指由游離羧基(-COOH)封端的氨基酸鏈的末端。如本文所寫出的，如本文所述的肽呈現(xiàn)為右側(cè)的C-末端和左側(cè)的N-末端。因此，如本文所使用的短語“C-末端被酰胺化”是指用伯胺基或仲胺基對本發(fā)明肽的C-末端的羥基的取代。在一個示例中，如本文所述的肽可以是(X1Y1X2Y2)n，其可以是(X1Y1X2Y2)n-NH2。在一個示例中，本公開的肽可通過本領(lǐng)域內(nèi)通常已知的方法酰胺化。不希望受限于理論，據(jù)認(rèn)為由于陽離子特性的增強C-末端酰胺化可能增強抗微生物活性；為本研究所設(shè)計的肽在C-末端被酰胺化以賦予高凈正電荷。本公開的肽無需二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑。短語“二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑”是指能夠保持多肽的主鏈原子的局部空間排列而不考慮其側(cè)鏈的構(gòu)象的分子。如本文所用的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑可包括但不限于疏水效應(yīng)、靜電相互作用和化學(xué)交聯(lián)，如多肽鏈內(nèi)和之間的二硫鍵或金屬離子內(nèi)部交聯(lián)。在一個示例中，本公開的肽不同于本領(lǐng)域內(nèi)已知的現(xiàn)有β-折疊肽，因為它們無需二硫橋或其它共價鍵約束來穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)。在水溶液中，由于質(zhì)子化的Arg和/或Lys殘基之間的靜電排斥，因此可預(yù)期本公開的肽以單體形式存在。在微生物細(xì)胞膜存在下，本公開的肽容易折疊成通過帶正電荷的殘基和帶負(fù)電荷的磷脂之間靜電相互作用隨后其疏水殘基插入脂質(zhì)雙層中而穩(wěn)定的二級β-折疊結(jié)構(gòu)。因此，在一個示例中，所述肽可能能夠自組裝成β-折疊結(jié)構(gòu)。如本文所使用的術(shù)語“自組裝”是指這樣一種類型的過程，其中在沒有外部引導(dǎo)的情況下預(yù)先存在的組分的無序體系由于組分本身之間的特定的局部相互作用而形成有組織的結(jié)構(gòu)或圖案。在本公開中，所述肽可在微生物膜環(huán)境中自發(fā)形成β-折疊結(jié)構(gòu)。如本文所用的短語“微生物膜環(huán)境”是指靶微生物的膜中的微環(huán)境。在一個示例中，該環(huán)境可通過陰離子表面活性劑SDS的存在來模擬。在一個示例中，所述肽在去離子水或水溶液中可能不會自發(fā)形成β-折疊結(jié)構(gòu)。如本文所用的“β-折疊”或“β-折疊片結(jié)構(gòu)”是指可包含至少一條β-鏈的肽的規(guī)則二級結(jié)構(gòu)，該β-鏈?zhǔn)情L度為3-12個氨基酸的一段多肽鏈，具有幾乎完全延伸的形式的主鏈。在一個示例中，本發(fā)明的β-折疊結(jié)構(gòu)由至少一條β-鏈組成。此外，形成β-折疊的序列內(nèi)的陽離子氨基酸和疏水性氨基酸的排列不可改變。在一個示例中，本公開的肽可包括：1)陽離子氨基酸殘基的選擇(即Arg相對于Lys相對于兩者的組合)、2)疏水側(cè)鏈的極性程度和龐大程度以及3)肽序列的具體長度。在本公開中，系統(tǒng)地研究了本公開的肽的各種可能構(gòu)型對抗微生物活性和溶血活性的影響。在一些示例中，已發(fā)現(xiàn)含有Arg的肽與含有Lys的肽相比具有更強的抗微生物性能。不希望受限于理論，據(jù)認(rèn)為本公開的富含Arg的肽的更強的抗微生物性能可能歸因于胍側(cè)鏈的更大的電荷密度。然而，本領(lǐng)域內(nèi)通常認(rèn)為肽序列內(nèi)存在大量精氨酸殘基與較高程度的溶血和細(xì)胞毒性相關(guān)。因此，Arg和Lys兩者都包括于肽設(shè)計中，以利用Arg的高電荷密度來改善抗微生物作用，同時使用毒性較小的Lys殘基來調(diào)節(jié)合成肽的毒性。同時，為了增強本公開的肽在生物體液中的穩(wěn)定性，本公開的發(fā)明人研究了立體化學(xué)對合成肽的抗微生物活性的作用。因此，在一個示例中，提供了本公開的肽，可具有式I的每個重復(fù)單元n，彼此獨立地包含1個或2個或3個或4個D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。在一個示例中，式I的重復(fù)單元n可彼此獨立地包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個或19個D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。在一個示例中，式I的重復(fù)單元n可彼此獨立地包含2個或4個或8個D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。如本文所用的“L-氨基酸”和“D-氨基酸”是指可在每種氨基酸中存在的兩種異構(gòu)體。如本文所寫出的，小寫加下劃線的殘基表示D-氨基酸，而大寫未加下劃線的表示L-氨基酸?！癓-氨基酸”是指在細(xì)胞中制造并且摻入蛋白質(zhì)中的氨基酸異構(gòu)體。“D-氨基酸”是指對本公開的肽的氨基酸的異構(gòu)體修飾。有利地，“D-氨基酸”可不被人蛋白酶和微生物蛋白酶識別。因此，如圖13和圖19中所圖解說明的，可防止本公開的肽在體內(nèi)發(fā)生過早的蛋白質(zhì)水解降解。然而，如本公開的發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的，在四個位置的選擇性D-氨基酸取代導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)的完全喪失。因此，在一個示例中，式I的每個重復(fù)單元n可彼此獨立地包含1個或2個D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。在一個示例中，式I的每個重復(fù)單元n中的D-氨基酸的分布可彼此相同或不同。在一個示例中，如本文所述的肽，其中n可以是2，并且第4位和第6位的氨基酸可以是D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。如實驗部分所說明的，在第4位和第6位的選擇性D-氨基酸取代使得能夠保留形成二級結(jié)構(gòu)的傾向(參見圖11c)。在一個示例中，如本文所述的肽可包含序列(IY1IY2)n-NH2或由序列(IY1IY2)n-NH2組成。在一個示例中，如本文所述的肽可包含序列(IRX2K)n-NH2或由序列(IRX2K)n-NH2組成。在一個示例中，如本文所述的肽當(dāng)由通式X1Y1X2Y2X3Y3(SEQIDNO:2)表示時，可包括但不限于irikir-NH2(SEQIDNO:10)，其中小寫加下劃線的殘基表示D-氨基酸。在一個示例中，如本文所述的肽當(dāng)由通式X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4(SEQIDNO:3)表示時，可包括但不限于VRVKVRVK-NH2(SEQIDNO:11)、IRIRIRIR-NH2(SEQIDNO:12)、IKIKIKIK-NH2(SEQIDNO:13)、IRVKIRVK-NH2(SEQIDNO:14)、FRFKFRFK-NH2(SEQIDNO:15)、WRWKWRWK-NH2(SEQIDNO:16)、IRIKIRIK-NH2(SEQIDNO:17)、irikirik-NH2(SEQIDNO:18)和IRIkIrIK-NH2(SEQIDNO:19)，其中小寫加下劃線的殘基表示D-氨基酸，而大寫未加下劃線的表示L-氨基酸。在一個示例中，如本文所述的肽當(dāng)由通式X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6(SEQIDNO:5)表示時，可包括但不限于VRVKVRVKVRVK-NH2(SEQIDNO:20)、IRIKIRIKIRIK-NH2(SEQIDNO:21)、IRVKIRVKIRVK-NH2(SEQIDNO:22)和irvkirvkirvk-NH2(SEQIDNO:23)，其中小寫加下劃線的殘基表示D-氨基酸，而大寫未加下劃線的表示L-氨基酸。在一個示例中，如本文所述的肽可選自由以下組成的組：VRVKVRVK-NH2(SEQIDNO:11)、VRVKVRVKVRVK-NH2(SEQIDNO:20)、IRIRIRIR-NH2(SEQIDNO:12)、IKIKIKIK-NH2(SEQIDNO:13)、IRVKIRVK-NH2(SEQIDNO:14)、FRFKFRFK-NH2(SEQIDNO:15)、WRWKWRWK-NH2(SEQIDNO:16)、IRIKIRIK-NH2(SEQIDNO:17)、IRIKIRIKIRIK-NH2(SEQIDNO:21)、irikir-NH2(SEQIDNO:10)、irikirik-NH2(SEQIDNO:18)、IRIkIrIK-NH2(SEQIDNO:19)、IRVKIRVKIRVK-NH2(SEQIDNO:22)和irvkirvkirvk-NH2(SEQIDNO:23)，其中小寫加下劃線的殘基表示D-氨基酸，而大寫未加下劃線的表示L-氨基酸。在另一方面，提供了用于治療受試者的角膜炎的兩親性肽，其中所述肽包含：(X1Y1X2Y2)n(式I)，其中所述肽的C-末端被酰胺化；X1和X2彼此獨立地是疏水性氨基酸；Y1和Y2彼此獨立地為陽離子氨基酸；并且n為至少1.5，其中所述肽能夠自組裝成β-折疊結(jié)構(gòu)。本公開的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如本公開中所公開的兩親性肽可用作廣譜抗微生物劑，可用于治療由微生物引起的角膜炎。如本文所用的術(shù)語“細(xì)菌或“微生物”以其最廣泛的含義被使用，因此在范圍上不限于原核生物體。而是，術(shù)語“微生物”在其范圍內(nèi)包括細(xì)菌、古細(xì)菌、病毒、酵母、真菌、原生動物和藻類。因此，在一個示例中，如本公開中所公開的角膜炎是真菌性角膜炎、病毒性角膜炎或細(xì)菌性角膜炎。在一個示例中，細(xì)菌可以是革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。因此，可被治療的細(xì)菌感染包括但不限于由來自以下屬的細(xì)菌引起的那些細(xì)菌感染：醋酸桿菌屬(Acetobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、放線菌屬(Actinomyces)、土壤桿菌屬種(Agrobacteriumspp.)、根瘤菌屬(Azorhizobium)、固氮菌屬(Azotobacter)、紅孢子蟲屬種(Anaplasmaspp.)、芽孢桿菌種(Bacillusspp.)、擬桿菌屬種(Bacteroidesspp.)、巴爾通體屬種(Bartonellaspp.)、博德特氏菌屬種(Bordetellaspp.)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、布魯氏菌屬種(Brucellaspp.)、伯克霍爾德菌屬種(Burkholderiaspp.)、鞘桿菌屬(Calymmatobacterium)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、衣原體屬種(Chlamydiaspp.)、嗜衣原體屬種(Chlamydophilaspp.)、梭菌屬種(Clostridiumspp.)、棒狀桿菌屬種(Corynebacteriumspp.)、柯克斯體屬(Coxiella)、埃立克體屬(Ehrlichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、腸球菌屬種(Enterococcusspp.)、埃希氏菌屬(Escherichia)、弗朗西斯氏菌屬(Francisella)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、加德納菌屬(Gardnerella)、嗜血桿菌屬種(Haemophilusspp.)、螺桿菌屬(Helicobacter)、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬種(Lactobacillusspp.)、乳球菌屬(Lactococcus)、軍團(tuán)桿菌屬(Legionella)、李斯特菌(Listeria)、扭脫甲烷桿菌(Methanobacteriumextroquens)、多形微桿菌屬(Microbacteriummultiforme)、藤黃微球菌屬(Micrococcusluteus)、卡他莫拉菌屬(Moraxellacatarrhalis)、分枝桿菌種(Mycobacteriumspp.)、支原體屬種(Mycoplasmaspp.)、奈瑟氏菌屬種(Neisseriaspp.)、巴氏桿菌種(Pasteurellaspp.)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、立克次氏體種屬(Rickettsiaspp.)、羅卡利馬體屬種(Rochalimaeaspp.)、羅氏菌屬(Rothia)、沙門氏菌屬種(Salmonellaspp.)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、葡萄球菌屬種(Staphylococcusspp.)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)、鏈球菌屬種(Streptococcusspp.)、密螺旋體屬種(Treponemaspp.)、弧菌屬種(Vibriospp.)、沃爾巴克氏體屬(Wolbachia)和耶爾森氏菌屬(Yersiniaspp.)。在一個示例中，細(xì)菌可包括但不限于橙黃醋酸桿菌(Acetobacteraurantius)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、衣氏放線菌(ActinomycesIsraelii)、放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)、根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)、維氏固氮菌(Azotobactervinelandii)、嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum)、邊緣邊蟲(Anaplasmamarginale)、炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、梭形芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)、地衣形芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、蕈狀芽孢桿菌(Bacillusmycoides)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)、齦擬桿菌(Bacteroidesgingivalis)、產(chǎn)黑色素擬桿菌(Bacteroidesmelaminogenicus)(產(chǎn)黑色素普雷沃氏菌(Prevotellamelaminogenica))、漢賽巴爾通體(Bartonellahenselae)、五日熱巴爾通體(BartonellaQuintana)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、流產(chǎn)布魯氏菌(Brucellaabortus)、羊布魯氏菌(Brucellamelitensis)、豬布魯氏菌(Brucellasuis)、鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiamallei)、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)復(fù)合體、新洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)、肉芽腫莢膜桿菌(Calymmatobacteriumgranulomatis)、大腸彎曲桿菌(Campylobactercoli)、胎兒彎曲桿菌(Campylobacterfetus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)、幽門彎曲桿菌(Campylobacterpylori)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、嗜衣原體(Chlamydophila)(如肺炎嗜衣原體(C.pneumoniae)、鸚鵡熱嗜衣原體(Chlamydophilapsittaci))、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridiumbotulinum)、艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridiumdifficile)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)、破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌(Clostridiumtetani))、白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、梭形棒狀桿菌(Corynebacteriumfusiforme)、貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)、查菲埃立克體(Ehrlichiachaffeensis)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、鳥腸球菌(Enterococcusavium)、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarum)、莫洛特斯腸球菌(Enterococcusmaloratus)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)、陰道加德納氏菌(Gardnerellavaginalis)、杜克雷嗜血桿菌(Haemophilusducreyi)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、副流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenzae)、百日咳嗜血桿菌(Haemophiluspertussis)、陰道嗜血桿菌(Haemophilusvaginalis)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜肺軍團(tuán)桿菌(Legionellapneumophila)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、扭脫甲烷桿菌(Methanobacteriumextroquens)、多形微桿菌(Microbacteriummultiforme)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、白喉分枝桿菌(Mycobacteriumdiphtheriae)、胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)、鼠麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumlepraemurium)、草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)、恥垢分枝桿茵(Mycobacteriumsmegmatis)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、發(fā)酵支原體(Mycoplasmafermentans)、生殖支原體(Mycoplasmagenitalium)、人型支原體(Mycoplasmahominis)、穿通支原體(Mycoplasmapenetrans)、肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、土拉巴斯德氏菌(Pasteurellatularensis)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、放射狀根瘤菌(RhizobiumRadiobacter)、普氏立克次氏體(Rickettsiaprowazekii)、鸚鵡熱立克次氏體(Rickettsiapsittaci)、五日熱立克次氏體(RickettsiaQuintana)、立氏立克次氏體(Rickettsiarickettsii)、沙眼立克次氏體(Rickettsiatrachomae)、亨氏羅卡利馬氏體(Rochalimaeahenselae)、五日熱羅卡利馬氏體(RochalimaeaQuintana)、齲齒羅氏菌(Rothiadentocariosa)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、志賀氏痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、鳥鏈球菌(Streptococcus.Avium)、牛鏈球菌(Streptococcusbovis)、倉鼠鏈球菌(Streptococcuscricetus)、屎鏈球菌(Streptococcusfaceium)、糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、野鼠鏈球菌(Streptococcusferus)、鶉雞鏈球菌(Streptococcusgallinarum)、乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis)、草綠色鏈球菌(Streptococcusmitior)、緩癥鏈球菌(Streptococcusmitis)、變異鏈球菌(Streptococcusmutans)、口腔鏈球菌(Streptococcusoralis)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、大鼠鏈球菌(Streptococcusrattus)、唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)、血鏈球菌(Streptococcussanguis)、遠(yuǎn)緣鏈球菌(Streptococcussobrinus)、梅毒密螺旋體(Treponemapallidum)、齒垢密螺旋體(Treponemadenticola)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、逗號弧菌(Vibriocomma)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、沃爾巴克氏體屬、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)和假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)。在一個示例中，細(xì)菌可包括但不限于大腸埃希氏菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌屬種、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、綠膿假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌。在一個示例中，細(xì)菌感染可引起以下諸如但不限于以下的病況：肺炎、結(jié)核病、腦膜炎、腹瀉性疾病、生物膜形成、膿毒癥、李斯特菌病、腸胃炎、中毒性休克綜合征、出血性結(jié)腸炎；溶血性尿毒綜合癥、萊姆病、胃潰瘍和十二指腸潰瘍、人埃立克體病、偽膜性結(jié)腸炎、霍亂、沙門氏菌病、貓抓熱、壞死性筋膜炎(GAS)、鏈球菌中毒性休克綜合癥、醫(yī)院和社區(qū)相關(guān)的感染、動脈粥樣硬化、嬰兒瘁死綜合癥(SIDS)、耳部感染、呼吸道感染、尿路感染、皮膚和軟組織感染、甲床感染、傷口感染、敗血癥、胃腸疾病、醫(yī)院獲得性心內(nèi)膜炎和血流感染。在一個示例中，所述細(xì)菌可以是抗藥性細(xì)菌。如本公開中所公開的兩親性肽可用于治療可由綠膿假單胞菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌引起的細(xì)菌性角膜炎。在一個示例中，病毒傳染性疾病可由病毒引起，包括但不限于由以下病毒引起的感染或傳染性疾?。合俨《尽捯卟《?、痘病毒、細(xì)小病毒、呼腸科病毒、小核糖核酸病毒、外衣病毒、正粘液病毒、彈狀病毒、副粘液病毒、乳頭瘤病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如人免疫缺陷病毒)和嗜肝病毒。在一個示例中，病毒傳染性疾病可包括但不限于普通感冒、流感、水痘、唇皰疹、埃博拉、AIDS、禽流感、SARS、登革熱、皰疹、帶狀皰疹、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、狂犬病、人乳頭瘤病毒、病毒性肝炎、柯薩奇病毒、EB病毒等。如本公開中所公開的兩親性肽還可用于治療可由水痘帶狀皰疹、腺病毒、單純皰疹病毒-1(HSV-1)引起的病毒性角膜炎。如本文所用的術(shù)語“真菌”(和其衍生詞，如“真菌感染”)包括但不限于，提及以下屬的生物體(或生物體導(dǎo)致的感染)：犁頭霉菌屬(Absidia)、阿耶羅菌(Ajellomyces)、節(jié)皮菌屬(Arthroderma)、曲霉菌屬(Aspergillus)、芽生菌屬(Blastomyces)、念珠菌屬(Candida)、孢瓶霉屬(Cladophialophora)、球孢子菌屬(Coccidioides)、隱球菌屬(Cryptococcus)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、表皮癬菌屬(Epidermophyton)、外瓶霉屬(Exophiala)、線黑粉菌屬(Filobasidiella)、著色真菌屬(Fonsecaea)、鐮刀菌(Fusarium)、地霉屬(Geotrichum)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、何德霉屬(Hortaea)、伊薩酵母屬(Issatschenkia)、馬杜拉分枝菌屬(Madurella)、馬拉色霉菌屬(Malassezia)、小孢子菌屬(Microsporum)、微孢子蟲屬(Microsporidia)、毛霉菌屬(Mucor)、叢赤殼菌屬(Nectria)、擬青霉屬(Paecilomyces)、副球孢子菌屬(Paracoccidioides)、青霉菌屬(Penicillium)、畢赤酵母屬(Pichia)、肺囊蟲屬(Pneumocystis)、假阿利什菌屬(Pseudallescheria)、根霉屬(Rhizopus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、賽多孢子菌屬(Scedosporium)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、孢子絲菌(Sporothrix)、毛癬菌屬(Trichophyton)和毛孢子菌屬(Trichosporon)。例如，由諸如但不限于以下的種所引起的真菌感染：傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)、莢膜阿耶羅菌(Ajellomycescapsulatus)、皮炎芽生菌(Ajellomycesdermatitidis)、苯海姆節(jié)皮菌(Arthrodermabenhamiae)、粉節(jié)皮菌(Arthrodermafulvum)、石膏樣節(jié)皮菌(Arthrodermagypseum)、內(nèi)彎節(jié)皮菌(Arthrodermaincurvatum)、太田節(jié)皮菌(Arthrodermaotae)和萬博節(jié)皮菌(Arthrodermavanbreuseghemii)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和黑曲霉(Aspergillusniger)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、吉利蒙念珠菌(Candidaguilliermondii)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、熱帶念珠菌(Candidatropicalis)和菌膜念珠菌(Candidapelliculosa)、卡氏枝孢霉(Cladophialophoracarrionii)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)和Coccidioidesposadasii、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、小克銀漢霉屬種(Cunninghamellasp.)、絮狀表皮癬菌(Epidermophytonfloccosum)、皮炎外瓶霉(Exophialadermatitidis)、新型線黑粉菌(Filobasidiellaneoformans)、裴氏著色真菌(Fonsecaeapedrosoi)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、白地霉(Geotrichumcandidum)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)、威尼克外瓶霉(Hortaeawerneckii)、東方伊薩酵母(Issatschenkiaorientalis)、灰色馬杜拉菌(Madurellagrisae)、糠秕馬拉色霉菌(Malasseziafurfur)、球形馬拉色霉菌(Malasseziaglobosa)、鈍形馬拉色菌(Malasseziaobtusa)、厚皮馬拉色霉菌(Malasseziapachydermatis)、限制性馬拉色霉菌(Malasseziarestricta)、斯洛菲馬拉色霉菌(Malasseziaslooffiae)、合軸馬拉色霉菌(Malasseziasympodialis)、犬小孢子菌(Microsporumcanis)、粉小孢子菌(Microsporumfulvum)、石膏樣小孢子菌(Microsporumgypseum)、微孢子蟲屬、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、紅球叢赤殼(Nectriahaematococca)、宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、馬爾尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)、異常畢赤酵母(Pichiaanomala)、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)、耶氏肺孢子蟲(Pneumocystisjiroveci)、卡氏肺孢子蟲(Pneumocystiscarinii)、波氏假阿利什菌(Pseudallescheriaboydii)、米根霉(Rhizopusoryzae)、深紅酵母(Rhodotorularubra)、尖端賽多孢子菌(Scedosporiumapiospermum)、裂褶菌(Schizophyllumcommune)、申克孢子絲菌(Sporothnxschenckii)、須毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes)、紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)、疣狀毛癬菌(Trichophytonverrucosum)和紫色毛癬菌(Trichophytonviolaceum)和阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii)、皮毛孢子菌(Trichosporoncutaneum)、墨汁毛孢子菌(Trichosporoninkin)和粘狀毛孢子菌(Trichosporonmucoides)。在一個示例中，如本文所述的真菌感染可由白色念珠菌引起。在一個示例中，真菌感染可由抗藥性真菌引起。表2和表4中提供了如本文所述的肽用于抑制、治療或去除真菌的示例性用途。本公開的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)如本文所公開的兩親性肽可用于治療可由絲狀真菌和/或酵母樣真菌引起的真菌性角膜炎。在一個示例中，酵母樣真菌可以是白色念珠菌。在另一示例中，絲狀真菌可包括黃曲霉、煙曲霉、鐮刀菌(Fusariumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)和淡紫色擬青霉(Paecilomyceslilacinus)。膿毒癥是指全球范圍內(nèi)特護(hù)病房中的主要死亡原因，其由從革蘭氏陰性細(xì)菌的外壁釋放的脂多糖分子而引起。目前，除了靜脈內(nèi)施用廣譜抗生素之外，僅給予支持療法來防止膿毒性休克綜合征的加重，而沒有針對作為免疫應(yīng)答的有害介質(zhì)的微生物內(nèi)毒素的有效療法。多粘菌素B是內(nèi)毒素結(jié)合和中和的“金”標(biāo)準(zhǔn)，然而，其高細(xì)胞毒性否定了其用于系統(tǒng)性應(yīng)用的實用性。因此，需要提供可同時消滅致病微生物并中和內(nèi)毒素且不具有針對哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的替代性抗微生物劑。因此，在一個示例中，本公開的肽可用于預(yù)防膿毒癥。具有強效免疫刺激性質(zhì)的脂多糖(LPS)內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜葉的完整結(jié)構(gòu)組分。LPS在微生物細(xì)胞生長和分裂期間不斷流出，并且在細(xì)胞死亡(經(jīng)常是由于針對細(xì)菌感染的抗生素治療而引起)期間大量釋放。在釋放到血流中時，LPS聚集體被結(jié)合LPS的血漿蛋白質(zhì)(LBP)解離而形成LPS-LBP復(fù)合物，其刺激宿主單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子(例如，TNF-α、IL-6、IL-8)和促炎性介質(zhì)(例如，NO和活性氧物種)。先天免疫系統(tǒng)的活化引起級聯(lián)放大的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致稱為膿毒性休克的嚴(yán)重臨床綜合征，如果不治療可快速地引起多器官衰竭或者則死亡。在多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌屬中結(jié)構(gòu)保守的陰離子兩親性脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)域被公認(rèn)為是LPS的活性部分。本公開的發(fā)明人證實，通過陽離子賴氨酸或精氨酸殘基與陰離子頭基的靜電相互作用而結(jié)合并中和LPS，以及通過LPS的烷基鏈與非極性氨基酸側(cè)鏈之間的疏水相互作用而解離LPS聚集體，如本文所述的陽離子抗微生物肽兩親物提供了特別有用的候選物。在一個示例中，提供了中和內(nèi)毒素的方法，其包括施用藥學(xué)有效量的本公開的肽。在一個示例中，內(nèi)毒素可以是細(xì)菌內(nèi)毒素或真菌內(nèi)毒素。在一個示例中，內(nèi)毒素可以是多糖、脂磷壁酸、脂多糖或脂寡糖。圖9證實本公開的肽有效降低LPS對巨噬細(xì)胞的作用。細(xì)菌可對人造成的另一個問題是生物膜的形成。生物膜的形成是涉及各種醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和非醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大問題。當(dāng)微生物細(xì)胞彼此粘附并嵌入表面上的細(xì)胞外聚合物質(zhì)(EPS)的基質(zhì)中時，出現(xiàn)生物膜。微生物在這種富含生物大分子(例如多糖、核酸和蛋白質(zhì))和營養(yǎng)物的受保護(hù)環(huán)境中生長使得微生物的交互作用增強以及使得微生物的毒力增加。因此，已經(jīng)廣泛地描述了特別是在截留在生物膜內(nèi)的微生物的生長速率和基因轉(zhuǎn)錄模式方面的生理和表型改變。據(jù)認(rèn)為抗生素不能穿過細(xì)胞外聚合物質(zhì)和/或細(xì)胞外聚合物質(zhì)的組分引起的抗生素失活是造成常規(guī)劑量的抗生素對抑制或殺死生物膜微生物無效的原因。該現(xiàn)象加上抗藥性基因的上調(diào)經(jīng)常導(dǎo)致生物膜中快速產(chǎn)生抗生素抗性，使得成功根除它們成為醫(yī)療環(huán)境中的巨大挑戰(zhàn)。因此，需要提供去除生物膜的方法。鑒于以上原因，在另一方面，提供了去除生物膜的方法，其包括施用藥學(xué)有效量的本公開的肽。在一個示例中，生物膜可存在于表面上。本文使用的術(shù)語“表面”是指提供流體如液體或空氣和固體之間的界面的任何醫(yī)學(xué)或工業(yè)表面。流體和固體之間的界面可以是間歇性的，并且可由流動或停滯的流體、氣溶膠或用于經(jīng)空氣的流體暴露的其它方法引起。在一些示例中，表面是指其機(jī)械結(jié)構(gòu)與細(xì)菌或真菌的粘附相容的平面。在本文所述的肽和方法的上下文中，術(shù)語“表面”涵蓋各種一次性的和非一次性的、醫(yī)療的和非醫(yī)療的儀器和裝置的內(nèi)面和外面。非醫(yī)療應(yīng)用的示例包括：船的船體、造船廠、食物加工器、混合器、機(jī)器、容器、水槽、濾水器、凈化系統(tǒng)、食品行業(yè)中的防腐劑、個人護(hù)理用品如洗發(fā)水、面霜、潤膚膏、洗手液、肥皂等。醫(yī)療用途的示例包括醫(yī)療裝置的整個范圍。此類“表面”可包括各種儀器和裝置的內(nèi)面和外面，不管所述儀器和裝置為一次性的，還是用來重復(fù)使用。示例包括適用于醫(yī)療用途的物品的整個范圍，包括：解剖刀、針、剪刀和用于侵入性手術(shù)、治療或診斷程序的其他器械；植入式醫(yī)療裝置，包括人工血管、導(dǎo)管和其他用于至患者的流體去除或遞送的裝置、人工心臟、人工腎、整形外科針、盤和移植物；導(dǎo)管和其它管(包括泌尿道和膽道導(dǎo)管、氣管內(nèi)套管、外周可插入式中心靜脈導(dǎo)管、透析管、長期隧道式中心靜脈導(dǎo)管、外周靜脈導(dǎo)管、短期中心靜脈導(dǎo)管、動脈導(dǎo)管、肺導(dǎo)管、氣囊漂浮導(dǎo)管、泌尿?qū)Ч?、腹膜?dǎo)管)、泌尿裝置(包括長期泌尿裝置、結(jié)合組織的泌尿裝置、人工泌尿括約肌、泌尿擴(kuò)張器)、分流器(包括心室或動脈-靜脈分流器)；假體(包括乳房填充物、陰莖假體、血管移植物假體、心臟瓣膜、人造關(guān)節(jié)、人工喉、耳移植物)、血管導(dǎo)管口、傷口引流管、腦積水分流器、起搏器和可植入除顫器、牙種植體、填料、假牙等。對于這些領(lǐng)域的從業(yè)者來說，其它示例將是顯而易見的。醫(yī)療環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的表面還包括：醫(yī)療器械的零件、醫(yī)療保健環(huán)境中的人員穿戴或攜帶的醫(yī)療設(shè)備的內(nèi)面和外面。此類表面可包括用于醫(yī)療程序或用于準(zhǔn)備呼吸治療中使用的醫(yī)療器械、導(dǎo)管和容器的區(qū)域中的案臺和固定裝置，所述呼吸治療包括施用氧氣、噴霧器中的溶解的藥物和麻醉劑。還包括預(yù)期在醫(yī)療環(huán)境中作為傳染性微生物的生物屏障如手套、圍裙和面罩的那些表面。用于生物屏障的常用材料可以是基于乳膠的或非基于乳膠的。非基于乳膠的生物屏障材料的示例可包括乙烯基塑料。其他的此類表面可包括用于并非為無菌的醫(yī)療或牙科設(shè)備的手柄和電纜。另外，此類表面可包括通常會遇到血液或體液或其它有害生物材料的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的管和其它設(shè)備的那些非無菌的外表面。在一個示例中，在導(dǎo)管和醫(yī)學(xué)植入物上可包含生物膜。在另一方面，提供了治療受試者的角膜炎的方法，其包括施用藥學(xué)有效量的本公開的肽。術(shù)語“處理”、“治療(treatment)”和其語法變體是指治療性治療和預(yù)防性或防御性措施，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)不期望的生理病況、病癥或疾病，或者獲得有益的或期望的臨床結(jié)果。此類有益或期望的臨床結(jié)果包括但不限于癥狀的減輕，病況、病癥或疾病的程度減小；病況、病癥或疾病的穩(wěn)定(即，不惡化)狀態(tài)；病況、病癥或疾病進(jìn)展的延遲或減緩；病況、病癥或疾病狀態(tài)的改善；緩解(不論是部分的還是總體的)，不論是可檢測的還是不可檢測的；或者病況、病癥或疾病的改進(jìn)或改善。治療包括誘發(fā)臨床上顯著且無過高水平副作用的細(xì)胞應(yīng)答。治療還包括，與不接受治療時預(yù)期的存活相比，延長存活。鑒于以上原因，在另一方面，提供了從受試者的角膜中去除生物膜的方法，其包括施用藥學(xué)有效量的本公開的肽。術(shù)語“降低”、“減少的”、“減少”、“降低”、“去除”或“抑制”在本文中全部通常用于意指降低了統(tǒng)計學(xué)上顯著的量。然而，為了避免歧義，“減少的”、“減少”或“降低”、“去除”或“抑制”意指與參照水平相比降低至少10％，例如降低至少約20％、或至少約30％、或至少約40％、或至少約50％、或至少約60％、或至少約70％、或至少約80％、或至少約90％、或多達(dá)100％并且包括降低100％(例如，與參照樣品相比不存在的水平)，或者與參照水平相比10-100％的任何降低(例如，不存在如本文所述的肽)。本公開的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)如本文所述的肽可誘導(dǎo)癌細(xì)胞系的細(xì)胞死亡。因此，在另一方面，提供了治療增殖性疾病的方法，其可包括施用藥學(xué)有效量的如本文所述的肽。在一個示例中，增殖性疾病可包括但不限于腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或其組合。在一個示例中，增殖性疾病可包括但不限于結(jié)腸直腸癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管-內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、肝轉(zhuǎn)移、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、甲狀腺癌如甲狀腺未分化癌、腎母細(xì)胞瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、肺小細(xì)胞癌、肺非小細(xì)胞癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。圖22中提供了如本文所述的肽用于誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的示例性用途。在另一方面，提供了本公開的肽在制造用于治療細(xì)菌感染、或去除細(xì)菌、或中和內(nèi)毒素、或治療基于病毒的傳染性疾病、或治療真菌感染或侵染、或去除真菌、或治療增殖性疾病的藥物中的用途。在一個示例中，所述用途可進(jìn)一步包括提供用于施用給有需要的受試者的本公開的肽。在一個示例中，其中將向有需要的受試者施用所述藥物待。在一個示例中，所述受試者或患者可以是動物、哺乳動物、人，包括但不限于動物，可分類為?？啤⒇i科、馬科、犬科、狼科、貓科、鼠科、綿羊、鳥類、魚類、山羊、鴉科、蛙科或海豚科。在一個示例中，患者可以是人。在一個示例中，如本文所述的肽可作為組合物或藥物組合物提供。如本文所述的組合物可以多種方式施用，這取決于是期望局部治療還是期望全身治療。施用可以是局部的、肺部的(例如，通過吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮)或全身的，如口服和/或腸胃外。腸胃外施用包括：靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如，鞘內(nèi)或腦室內(nèi)施用。在一個示例中，施用途徑可選自由全身施用、口服施用、靜脈內(nèi)施用和胃腸外施用組成的組。由于本公開涉及眼部角膜炎的治療，因此在一個示例中，可施用所述組合物用于局部治療。因此，在所述示例中，組合物可作為用于局部給藥的組合物提供，如滴眼劑、霜劑、泡沫、凝膠、洗劑和軟膏。由于本公開涉及眼部角膜炎的治療，因此在一個示例中，可施用所述組合物用于局限或局部治療。用于局部施用的組合物和制劑可包括無菌水溶液，其還可含有緩沖劑、稀釋劑和其它合適的添加劑，諸如但不限于滲透促進(jìn)劑、載體化合物和其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。如本文所述的組合物包括但不限于溶液、糊劑、軟膏、霜劑、水凝膠、乳液、含有脂質(zhì)體的制劑、泡沫、滴眼劑和涂料。這些組合物可由各種組分產(chǎn)生，所述組分包括但不限于預(yù)成型液體、自乳化的固體和自乳化的半固體?？筛鶕?jù)制藥行業(yè)內(nèi)熟知的常規(guī)技術(shù)制備可方便地以單位劑型呈現(xiàn)的如本文所述的制劑。此類技術(shù)包括將活性成分與藥物載體或賦形劑結(jié)合的步驟。通常通過如下方式制備所述制劑：將活性成分與液體載體或磨碎的固體載體或二者均勻且緊密地結(jié)合，然后(如有必要)，使產(chǎn)品成形。可將如本文所述的組合物配制成許多可能的劑型中的任何一種，包括但不限于片劑、膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。還可將如本文所述的組合物配制成水性介質(zhì)、非水性介質(zhì)或混合介質(zhì)中的懸浮液。水性懸浮液可進(jìn)一步含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。所述懸浮液還可含有穩(wěn)定劑。在一個示例中，可將所述藥物組合物配制并用作泡沫。藥物泡沫包括諸如但不限于乳劑、微乳劑、霜劑、凝膠劑和脂質(zhì)體的制劑。雖然在性質(zhì)上基本類似，但這些制劑在最終產(chǎn)品的組分和一致性上不同。如本文所述的組合物可另外含有藥物組合物中常規(guī)發(fā)現(xiàn)的其它輔助組分。因此，例如，所述組合物可含有另外的相容的藥物活性物質(zhì)，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或者可含有用于物理配制本發(fā)明的組合物的各種劑型的另外材料，如緩沖劑、染料、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑或其組合，所述材料適于與可以適用于滴眼劑的任何濃度添加到溶液中的藥理活性劑一起使用。然而，在被添加時，此類材料不應(yīng)過度干擾本公開的組合物的組分的生物活性。所述制劑可被滅菌，并且如果期望，可與不與所述制劑的肽有害地相互作用的助劑(潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香物質(zhì)等)混合。如本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上有效量”在其含義內(nèi)包括足夠但無毒的量的如本文所述的化合物，用以提供預(yù)期效應(yīng)，即使微生物數(shù)目的對數(shù)減少為至少1.0，這意味著10個微生物中留下小于1個。本公開的修飾肽可提供至少約2.0、或至少約3.0、或至少約4.0、或至少約5.0、或至少約6.0、或至少約7.0的微生物數(shù)目的的對數(shù)減少。所需的確切的量根據(jù)受試者不同而不同，這取決于諸如治療的物種、受試者的年齡和總體狀況、治療的病況的嚴(yán)重性、施用的具體試劑、施用方式等因素。因此，不可能規(guī)定確切的“有效量”。然而，對于任何給定的情況，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用常規(guī)實驗即可確定適當(dāng)?shù)摹坝行Я俊?。劑量取決于待治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和響應(yīng)性，治療過程可持續(xù)幾天至幾個月，或者直到達(dá)到治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減輕?？捎苫颊呱眢w中的藥物積累的測量來計算最佳的給藥方案。施用醫(yī)師可容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)頻率。最佳的劑量可根據(jù)組合物的相對效力而變化，并且通?？苫谠隗w外和體內(nèi)動物模型中發(fā)現(xiàn)有效的EC50或基于本文所述的示例進(jìn)行估算。通常，劑量為16mg/ml到5000mg/ml，并且可每天、每周、每月或每年給予一次或多次。在一個示例中，使用所得到的滴眼劑治療或減輕眼部角膜炎癥狀的方案可包括每天3次向受影響的眼中滴滴眼劑，直到癥狀的嚴(yán)重性降低到可接受的水平。在特別嚴(yán)重的情況下，可能需要更頻繁的施加，而在不太嚴(yán)重的情況下，單次日劑量可能是足夠的。在一個示例中，所述組合物可以在以下的任一個之中的量施用：1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1050mg、1100mg、1150mg、1200mg、1250mg、1300mg、1350mg、1400mg、1450mg、1500mg、1550mg、1600mg、1650mg、1700mg、1750mg、1800mg、1850mg、1900mg、1950mg、2000mg、2050mg、2100mg、2150mg、2200mg、2250mg、2300mg、2350mg、2400mg、2450mg、2500mg、2550mg、2600mg、2650mg、2700mg、2750mg、2800mg、2850mg、2900mg、2950mg、3000mg、3050mg、3100mg、3150mg、3200mg、3250mg、3300mg、3350mg、3400mg、3450mg、3500mg、3550mg、3600mg、3650mg、3700mg、3750mg、3800mg、3850mg、3900mg、3950mg、4000mg、4050mg、4100mg、4150mg、4200mg、4250mg、4300mg、4350mg、4400mg、4450mg、4500mg、4550mg、4600mg、4650mg、4700mg、4750mg、4800mg、4850mg、4900mg、4950mg、5000mg/ml。在一個示例中，所施用的組合物的濃度為約1-約100mg/Kg患者體重、約5-約100mg/Kg患者體重、約10-約100mg/Kg患者體重、約20-約100mg/Kg患者體重、約30-約100mg/Kg患者體重、約1-約50mg/Kg患者體重、約5-約50mg/Kg患者體重和約10-約50mg/Kg患者體重。如本文所用的術(shù)語“約”在制劑的組分的濃度的背景下，通常意指所述值的+/-5％，更通常所述值的+/-4％，更通常所述值的+/-3％，更通常所述值的+/-2％，甚至更通常所述值的+/-1％，且甚至更通常所述值的+/-0.5％。本文所說明性地描述的發(fā)明可在不存在本文未明確公開的任何一種或多種要素、一種或多種限制的情況下被合適地實施。因此，例如，術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”等應(yīng)當(dāng)被寬泛地解讀并且沒有限制。另外，本文所采用的術(shù)語和表達(dá)是以描述而非限制的術(shù)語被使用，并且使用這些術(shù)語和表達(dá)并不意在排除所顯示和描述的特征或其部分的任何等同物，而應(yīng)認(rèn)識到可在所要求保護(hù)的發(fā)明范圍內(nèi)作出各種修改。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然已經(jīng)通過優(yōu)選實施方案和任選特征具體地公開了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用本文所公開的優(yōu)選實施方案和任選特征中所體現(xiàn)的發(fā)明的修改和變更，并且認(rèn)為此類修改和變更在本發(fā)明范圍內(nèi)。如本文所用的術(shù)語“基本上由……組成”是指給定實施例所需的那些元素。該術(shù)語允許存在不會實質(zhì)上影響本發(fā)明的示例的基本和新穎或功能特征的另外要素。術(shù)語“由......組成”是指如本文所述的組合物、方法及其各自的組分，其不包括給定示例中未敘述的任何要素。本文已對本發(fā)明進(jìn)行了寬泛的和一般性的描述。落入該一般公開的每個較窄的類和亞類的組合也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括用將任何主題從一般性中去除的附帶條件或負(fù)面限制來一般性地描述本發(fā)明，而不管被除去的內(nèi)容是否在本文中明確述及。其它實施方案在以下權(quán)利要求書和非限制性實施例內(nèi)。另外，在用馬庫什組描述本發(fā)明的特征或方面時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，由此也是以馬庫什組的任何單個成員或成員亞組來描述本發(fā)明。實驗部分實施例1本公開的肽(L-肽)的抗微生物性能的調(diào)查研究材料本研究中使用的肽由GLBiochem(中國上海)合成，并使用分析型反相(RP)-HPLC純化到大于95％。采用α-氰基-4-羥基肉桂酸(4-HCCA)作為基質(zhì)，使用基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS，AutoflexII型，BrukerDaltonics公司，美國)進(jìn)一步確認(rèn)所述肽的分子量。4-HCCA購自Sigma-Aldrich(新加坡)，并在重新結(jié)晶后于飽和的乙腈/水(1:1體積比)中使用。磷酸鹽緩沖鹽水(10×PBS)購自1stBase(新加坡)，并在使用前稀釋到所需濃度。Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基II(MHBII)和酵母霉菌液體培養(yǎng)基(YMB)粉末購自BDDiagnostics(新加坡)，并根據(jù)制造商的說明書重新構(gòu)建。從ATCC(美國)獲得表皮葡萄球菌(ATCC編號12228)、金黃色葡萄球菌(ATCC編號29737)、大腸埃希氏菌(ATCC編號25922)、綠膿假單胞菌(ATCC編號9027)和酵母白色念珠菌(ATCC編號10231)，并根據(jù)推薦的方案培養(yǎng)。來自大腸埃希氏菌0111:B4的脂多糖(LPS)和FITC-綴合的LPS購自Sigma-Aldrich。從Promega(美國)獲得格里斯(Griess)試劑系統(tǒng)并根據(jù)制造商的方案使用。圓二色(CD)光譜首先每種肽以0.5mg/mL-1溶解于單獨的去離子(DI)水中或含有25mMSDS表面活性劑的去離子水中。使用具有1.0mm路徑長度的石英小室，在室溫下用CD分光偏振計(JASCOCorp.J-810)記錄CD譜。，使用190-240nm的溶劑扣除以10nm/min掃描速度獲得CD譜，并由每個肽樣品的5次運行進(jìn)行平均。使用以下方程式將獲得的CD譜轉(zhuǎn)化為平均殘基橢圓率：其中θM是指平均殘基橢圓率(deg·cm2·dmol-1),θobs是在給定波長下針對DI水校正的觀察橢圓率(mdeg)，MRW是殘基分子量(Mw/氨基酸殘基數(shù))，c是肽濃度(mg·mL-1)，并且l是路徑長度(cm)。溶血測試用PBS25倍稀釋新鮮的大鼠紅細(xì)胞，以獲得約4％(以體積計)懸浮液用于本實驗。將300μL紅細(xì)胞懸浮液添加到含有等體積(300μL)的PBS中的肽溶液的每個管中。在37℃培養(yǎng)所述管lh，然后以1000×g離心5min。將上清液的等分試樣(100μL)轉(zhuǎn)移到96孔板的每個孔中，并使用微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士)在576nm下針對血紅蛋白釋放分析等分試樣。用PBS培養(yǎng)的紅細(xì)胞懸浮液用作陰性對照。用0.1％v/vTritonX-100溶解的紅細(xì)胞的吸光度用作陽性對照，并視為100％溶血。使用下式計算溶血百分比：溶血(％)＝[(處理樣品的O.D.576nm-陰性對照的O.D.576nm)/(陽性對照的O.D.576nm-陰性對照的O.D.576nm)]×100。數(shù)據(jù)表示為4個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。最小抑制濃度(MIC)測量使用液體培養(yǎng)基微量稀釋法，針對革蘭氏陽性表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性大腸埃希氏菌和綠膿假單胞菌以及酵母白色念珠菌研究了聚合物的抗微生物活性。在300rpm的恒定振蕩下在37℃在MHBII中培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞，并且在300rpm的恒定振蕩下在室溫使酵母細(xì)胞在YMB中生長，以達(dá)到對數(shù)生長期中期。用適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基稀釋微生物懸浮液，并進(jìn)行調(diào)整使得在微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士)上在600nm波長下的初始光密度(O.D.)讀數(shù)為約0.07，其對應(yīng)于McFarland標(biāo)準(zhǔn)1號(約3×108CFUmL-1)。肽溶解于經(jīng)0.2μm過濾的HPLC級水中，并使用適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)液進(jìn)行一系列的兩倍稀釋。將具有3×105CFUmL-1的初始加載水平的100μL微生物懸浮液添加到等體積(100μL)的肽溶液中，以獲得3.9-500mgL-1范圍的最終濃度，并且96孔板的每個孔中的水濃度固定在10％(以體積計)。細(xì)菌和酵母分別在37℃或室溫振蕩培養(yǎng)18h或42h后，MIC作為目視觀察不到微生物生長并且從0h起O.D.讀數(shù)沒有變化的最低聚合物濃度。含有10％(以體積計)HPLC級水的液體培養(yǎng)基中的微生物細(xì)胞和單獨的純液體培養(yǎng)基中的微生物細(xì)胞用作陰性對照。為了確保無菌處理，在每個實驗中都包括含有純液體培養(yǎng)基且不含微生物的孔。在至少2個獨立場合下每個測試進(jìn)行6個重復(fù)。殺死效率的確定在0.5×MIC、MIC和2×MIC用不同濃度的肽處理微生物18h后，對各個樣品進(jìn)行一系列的10倍稀釋，并平鋪到LB瓊脂板上。然后培養(yǎng)板過夜，并對菌落形成單位進(jìn)行計數(shù)。含有用10體積％水處理的微生物的樣品用作陰性對照。結(jié)果表示為Log(CFU/mL)和殺死％＝[(對照的細(xì)胞計數(shù)-聚合物處理的微生物的存活計數(shù))/對照的細(xì)胞計數(shù)]×100。場發(fā)射-掃描電子顯微鏡(FE-SEM)成像在96孔板中，用含有20％(以體積計)水和致死劑量(250mgL-1)的代表性肽的等體積液體培養(yǎng)基培養(yǎng)約3×108CFUml-1(100μL)大腸埃希氏菌懸浮液2h。將每種條件的8個重復(fù)合并在微量離心管中，5000×g5min沉淀，并用PBS沖洗兩次。然后在室溫下用4％甲醛固定樣品15min，隨后用DI水沖洗。使用一系列梯度的乙醇溶液(35％、50％、75％、90％、95％和100％)進(jìn)行細(xì)胞的脫水。對樣品進(jìn)行空氣干燥，固定于碳桌上，并用鉬進(jìn)行濺涂以供使用FE-SEM設(shè)備(JEOLJSM-7400F，日本)進(jìn)行成像。生物膜生長抑制和生物量測定將稀釋到3×106CFUml-1的金黃色葡萄球菌的過夜培養(yǎng)物以每孔100μL的體積添加到96孔板的每個孔中，并在37℃、100rpm輕微振蕩下使其粘附過夜。然后用100μLPBS沖洗孔一次，以去除浮游的細(xì)胞和松散附著的細(xì)胞，并補充100μL新鮮液體培養(yǎng)基。在用于實驗前，使生物膜繼續(xù)形成長達(dá)6-8天，每天進(jìn)行沖洗并更換培養(yǎng)基。為了確定肽處理對生物膜中金黃色葡萄球菌的生活力的影響，在MIC、4×MIC和8×MIC水平下將100μL(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)溶液添加到每個孔中，并使其培養(yǎng)24h。隨后，去除溶液，將120μL活化的XTT溶液添加到每個孔中。在培養(yǎng)4h后，將來自每個孔的100μL等分試樣轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，以供使用微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士)分別測定在490nm測量波長和660nm參照波長下的吸光度。相對細(xì)胞活力表示為[(A490-A660)樣品/(A490-A660)對照]×100％。數(shù)據(jù)表示為每個濃度4個重復(fù)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過結(jié)晶紫染色法估算生物膜的生物量。簡單地說，首先如上所述用所述肽處理形成的生物膜24h。在吸出培養(yǎng)基后，用PBS洗滌生物膜一次，在室溫下用甲醇固定15min，并用100μL0.1％(體積重量比)結(jié)晶紫染色10min。通過用DI水沖洗孔5次來去除過量的結(jié)晶紫染料。使用每孔100μL33％冰乙酸提取與生物膜結(jié)合的染料，并通過使用微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士瑞士)測量570nm波長處的吸光度來進(jìn)行定量。肽處理后殘留的生物量的相對量表示為用含有10％(以體積計)水的液體培養(yǎng)基處理的對照的百分比。數(shù)據(jù)表示每個濃度4個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。FITC-LPS結(jié)合測定在具有透明底部的黑色96孔板的每個孔中，用等體積的肽溶液(50μL)處理于PBS中的50μL1μg/mL-1FITC-LPS。在濃度遞增的肽(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500mgL-1)的存在下，在0h和2h，使用熒光微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士瑞士)，通過在480nm處激發(fā)FITC-LPS和監(jiān)測在516nm處的FITC發(fā)射來研究肽與FITC-綴合的LPS的相互作用。含有10％體積水的100μLPBS作為空白被包含于其中。PBS中的100μLFITC-LPS(0.5μgmL-1)的熒光強度用作陰性對照。熒光強度的百分比變化按如下計算：％ΔF(AU)＝[((F樣品-F空白)/(F對照-F空白))×100]–100。結(jié)果表示為4個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。細(xì)胞培養(yǎng)大鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系NR8383維持在補充有10％FBS、100UmL-1青霉素和100mgmL-1鏈霉素的FK15生長培養(yǎng)基中，并在37℃、5％CO2和95％濕潤空氣的氣氛下培養(yǎng)。內(nèi)毒素中和測定在96孔板的每個孔中，以4×104個的密度平鋪NR8383細(xì)胞，并在肽存在(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500mgL-1)或不存在下，用來自大腸埃希氏菌0111:B4的LPS(100ngmL-1)在37℃刺激18h。未處理的細(xì)胞和僅用LPS刺激的細(xì)胞分別用作陽性對照和陰性對照。根據(jù)制造商的方案，使用格里斯試劑(1％磺胺、0.1％N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽、5％磷酸)，通過對分離的上清液部分中穩(wěn)定的NO代謝物亞硝酸鹽的濃度進(jìn)行定量來估算產(chǎn)生的NO的量。測量540nm處的吸光度，并使用從已知濃度的NaNO2溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)參考曲線確定亞硝酸鹽濃度。細(xì)胞毒性測試96孔板的每個孔以4×104個細(xì)胞的密度接種大鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系NR8383，并在37℃用濃度遞增的肽(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500mgL-1)處理18h。隨后，將20μL試劑添加到每個孔中，并再培養(yǎng)所述板4h。使用微板讀數(shù)器測定在560nm激發(fā)波長和590nm發(fā)射波長處孔的熒光強度讀數(shù)。含有不存在細(xì)胞的肽溶液的對照孔被包括在內(nèi)以確定背景熒光。細(xì)胞活力％＝[(F處理的樣品–F對應(yīng)的背景)/(F10％水對照-F10％水對照背景)]×100。數(shù)據(jù)表示為4個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果在本研究中，通過使極性面中的陽離子賴氨酸和/或精氨酸氨基酸和相對的非極性面中的各種疏水性氨基酸分離來設(shè)計含有8個或12個氨基酸殘基的短的兩親性肽。通過MALDI-TOF質(zhì)譜驗證了合成的肽的分子量，并且將所觀察到的分子量列在表1中。可以見到，實驗確定的分子量與計算的質(zhì)量接近一致，表明所述產(chǎn)物對應(yīng)于所設(shè)計的序列。表1.合成的形成β-折疊的肽的設(shè)計和分子量表征[a]通過MALDI-TOFMS測量的，表觀Mw＝[Mw+H]+在去離子水中，每種肽采用無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，其特征在于，由于質(zhì)子化的賴氨酸和/或精氨酸殘基之間的分子間靜電排斥而在水溶液中在約195nm處具有最小值。然而，在模擬微生物膜的疏水環(huán)境(使用25mMSDS膠束溶液)中，合成的肽容易自組裝成β-折疊二級結(jié)構(gòu)，其特征CD譜顯示在約200nm處的最大值且顯示在約218nm處的最小值(圖2)。針對臨床相關(guān)微生物(包括革蘭氏陽性表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性大腸埃希氏菌和綠膿假單胞菌，以及酵母白色念珠菌)的代表性集合，測試了合成肽的抗微生物活性。如表2中所示，所設(shè)計的肽顯示針對測試的微生物組的廣譜抗微生物活性，其幾何平均(GM)最小抑制濃度(MIC)范圍為13.3-162.7mgL-1。總之，所有陽離子殘基均為Arg的肽(IRIR)2-NH2(SEQIDNO:12)展現(xiàn)了最佳的抗微生物活性，其最低GMMIC值為13.3mgL-1。緊隨其后的為(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IKIK)2-NH2(SEQIDNO:13)，其GMMIC值分別為23.4和38.3mgL-1。由這些結(jié)果可見，具有2個Arg和2個Lys殘基的肽產(chǎn)生抗微生物效應(yīng)，該抗微生物效應(yīng)處于其4個Arg或4個Lys的相對物之間。被報道為具有高的形成β-折疊的傾向的非極性氨基酸，基于遞增的疏水性程度和龐大程度同時保留2個Arg和2個Lys陽離子殘基的組合而系統(tǒng)地變化(表1)。在包含Val、lie、Phe和Trp的肽中，(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)顯示了針對所測試的5種微生物的組最有效的抗微生物效應(yīng)。用Val替代肽重復(fù)單元中的第二疏水性Ile殘基以生成(IRVK)2-NH2(SEQIDNO:14)導(dǎo)致了抗微生物活性的輕微降低。該結(jié)果有力地表明，Ile殘基為所觀察到的強抗微生物效應(yīng)所必需。使用含有Val和Ile的序列，研究了具有n＝3個重復(fù)單元的肽的生物效應(yīng)。從表2中可見，(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)顯示了最佳的整體抗微生物效應(yīng)，其次為(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)和(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)。與臨床上使用的脂肽多粘菌素B相比，發(fā)現(xiàn)幾種形成β-折疊的肽(包括(IRIR)2-NH2(SEQIDNO:12)、(IKIK)2-NH2(SEQIDNO:13)、(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20))具有更廣譜的抗微生物活性，如從它們較低的GMMIC值(13.3-34.6相對于41.4)所見。表2.合成的抗微生物肽的最小抑制濃度(MIC)和治療指數(shù)[a]測試的5種微生物的MIC值的幾何平均值(GM)。[b]溶血濃度10％(HC10)被定義為誘導(dǎo)≥10％溶血的最低肽濃度。[c]選擇性指數(shù)(SI)以計算。[d]以2500除以250mgL-1計算。對于有資格作為合適的治療候選物的形成β-折疊的肽，它們的抗微生物活性應(yīng)當(dāng)根據(jù)它們對微生物細(xì)胞膜的選擇性加以考慮，以便使對哺乳動物細(xì)胞的毒性減到最小。如圖3中所示，合成肽在各種MIC值下誘導(dǎo)最小的針對大鼠紅細(xì)胞的溶血作用或無溶血作用。所述肽的選擇性指數(shù)(SI)被進(jìn)一步評估為，不同的肽序列的安全性和功效的比較(表2)。不同肽的SI以HC10值(定義為誘導(dǎo)10％或更多溶血的最低肽濃度)與GM(所測試的5種微生物菌株的幾何平均MIC)的比值來計算。除了(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)外，發(fā)現(xiàn)測試的所有肽均具有大于10的高SI，表明它們?yōu)檫m合外部應(yīng)用和全身性應(yīng)用于身體的具有高度吸引力的候選物。特別地，本公開顯示(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)中的Arg和Lys殘基的組合使SI顯著改善，單個陽離子氨基酸肽序列(IRIR)2-NH2(SEQIDNO:12)和(IKIK)2-NH2(SEQIDNO:13)的SI值分別從11.3和18.3增加到44.8的值。通過在小鼠中尾靜脈靜脈注射含有n＝2[(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)]和n＝3[(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)]重復(fù)單元的代表性肽的溶液進(jìn)行急性體內(nèi)毒性測試。選擇前者是因為在具有n＝2個重復(fù)單元的肽中其具有更好的SI，而選擇后者是因為在具有n＝3個重復(fù)單元的肽中其具有更好的抗微生物活性、選擇性和內(nèi)毒素中和性能(在下文討論)。發(fā)現(xiàn)(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)分別具有致死劑量，50％(LD50；在特定測試時期后殺死50％的小鼠所需的劑量)值為35.2mg/kg。所設(shè)計的肽的LD50值與所報告的多粘菌素B(5.4g/kg)和短桿菌肽(1.5g/kg)的值有利地形成對比。為了闡明抗微生物機(jī)制，在用不同濃度的(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)處理微生物的組后，進(jìn)行了菌落計數(shù)實驗。對于所測試的5種微生物中的每種，所述肽在各自MIC值實現(xiàn)了接近100％的殺死效率，因此支持殺細(xì)菌機(jī)制(圖4)。在場-發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)下研究了以(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)處理后的大腸埃希氏菌的表面形態(tài)。如圖5中所示，與用含有10％(以體積計)水的液體培養(yǎng)基處理的對照樣品的相對光滑表面相比，用所述肽處理的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的表面看起來較粗糙且不均勻。該觀察與文獻(xiàn)中報道的各種天然存在和合成的AMP的膜溶解機(jī)制一致。與抑制微生物的生物合成途徑中各種靶標(biāo)的常規(guī)抗生素相比，由于發(fā)生賦予多重抗藥性的突變的可能性降低，預(yù)期由所述肽引起的微生物細(xì)胞膜的物理破壞能在臨床環(huán)境中提供固有的優(yōu)勢?？股锬つ芰酉聛硌芯苛撕铣傻目刮⑸镫膶︻A(yù)先形成的生物膜的抗生物膜能力，這在本質(zhì)上比防止生物膜形成更具挑戰(zhàn)性。如圖6中所示，肽(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)顯示對生物膜中存在的金黃色葡萄球菌的劑量依賴性殺死。發(fā)現(xiàn)在3種濃度測試(P<0.01)中，(IRIK)2-NH2誘導(dǎo)顯著更高水平的殺死，在4×MIC水平下細(xì)胞活力在24h內(nèi)大幅下降到小于10％。為了確定以肽處理后殘留的生物量的相對量，進(jìn)行了生物膜的結(jié)晶紫染色和溶液化。與金黃色葡萄球菌細(xì)胞活力的降低一致，觀察到在處理的生物膜中生物量的量以劑量依賴性方式降低(圖7)?？傊@些結(jié)果直接證明，8個和12個氨基酸長度的肽在殺死生物膜中的微生物方面非常有效，并且能夠有效介導(dǎo)生物膜基質(zhì)的擴(kuò)散。LPS和內(nèi)毒素中和為了評估合成的肽結(jié)合和解離LPS聚集體的能力，將FITC-綴合的LPS與不同肽綴合，并監(jiān)測2h內(nèi)熒光強度的變化。在水溶液中，隱藏在LPS聚集體內(nèi)的FITC顯示出自淬滅，產(chǎn)生低熒光強度。相反，當(dāng)FITC-LPS聚集體解離時，熒光由于去淬滅效應(yīng)而增加。如圖8a中所示，具有n＝2的形成β-折疊的肽似乎并未誘導(dǎo)FITC-LPS聚集體的可識別的破壞，如由在高達(dá)500mgL-1的肽濃度無熒光強度變化而證明。然而，具有3個重復(fù)單元的相應(yīng)肽產(chǎn)生了FITC-LPS的熒光強度的強劑量依賴性增強(圖8b)。在所述3種肽序列中(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)在較低濃度下誘導(dǎo)熒光強度的較大百分比改變，最后為(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)。在大鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系NR8383與100ngmL-1LPS和不同的肽共培養(yǎng)后，通過對細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的穩(wěn)定NO代謝物亞硝酸鹽濃度進(jìn)行定量來估算釋放的促炎性氧化氮的量從而確定合成肽的內(nèi)毒素中和能力。發(fā)現(xiàn)：與非肽處理的對照相比，所述肽甚至在15.6mgL-1的低肽濃度，能有效抑制LPS刺激的NO產(chǎn)生，顯著降低亞硝酸鹽濃度(圖9)。各種肽介導(dǎo)的LPS中和程度的順序為：(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)>(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)>(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)，這與先前在FITC-LPS相互作用測定中觀察到的趨勢接近一致。重要的是，在125mgL-1的(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)下，亞硝酸鹽濃度被降低到對照水平。針對NR8383細(xì)胞系進(jìn)一步評估了所述肽的細(xì)胞毒性，并且發(fā)現(xiàn)分別在高達(dá)62.5mgL-1、125mgL-1和125mgL-1濃度的(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)、(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)和(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)下細(xì)胞活力超過80％(圖10)。這些結(jié)果確認(rèn)，合成肽的良好抗炎性與它們對細(xì)胞活力的影響無關(guān)，并且所述肽在抗微生物和抗炎劑量下無細(xì)胞毒性，表明它們對于全身施用的適合性。盡管(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)在3種肽中具有最強效的抗炎活性，但其相對較弱的抗微生物活性(GMMIC值＝162.7mgL-1)和較低的選擇性指數(shù)(SI＝3.1)表明第二好的抗炎肽(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)是用于安全且有效治療血流感染的更合適的候選物，它具有低得多的幾何平均MIC值(為47.3)和較高的選擇性指數(shù)(為26.4)(表2)。在本公開中，本發(fā)明人基于天然β-折疊跨膜蛋白質(zhì)中的兩親性二聯(lián)體重復(fù)的普遍存在設(shè)計了一系列短的合成的β-折疊可折疊肽。所設(shè)計的β-折疊可折疊肽顯示針對革蘭氏陽性表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性大腸埃希氏菌和綠膿假單胞菌以及酵母白色念珠菌的廣譜抗微生物活性。發(fā)現(xiàn)n＝2和n＝3重復(fù)單元的最佳肽序列，即(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)，分別具有高選擇性指數(shù)(44.8和26.4)。與臨床上使用的多粘菌素B和短桿菌肽相比，小鼠中的急性體內(nèi)毒性測試揭示了最佳合成肽的更高的靜脈內(nèi)LD50值。關(guān)于浮游微生物的高效殺死，還證實了合成的肽為生物膜中細(xì)菌生長的強效抑制劑。另外，用不同的肽處理生物膜導(dǎo)致生物量顯著減少，表明所述肽可有效轉(zhuǎn)運通過生物膜基質(zhì)并引起生物膜基質(zhì)的擴(kuò)散。另外，具有3個重復(fù)單元的合成肽(包括(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)、(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)和(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21))顯示了內(nèi)毒素結(jié)合和中和能力，且在功能效應(yīng)所需的濃度下誘導(dǎo)最小的毒性或無毒性。總之，我們的發(fā)現(xiàn)清楚地證實，合理設(shè)計的合成的β-折疊可折疊肽是高度選擇性的并且具有用作廣譜抗微生物劑的潛力，以克服眾多基于細(xì)菌或真菌的傳染性疾病相關(guān)的應(yīng)用中多重抗藥性的普遍問題，所述應(yīng)用包括但不限于預(yù)防和根除在治療上有挑戰(zhàn)性的開放性傷口、導(dǎo)管或植入物上的生物膜以及中和微生物內(nèi)毒素以改善血流感染的治療。實施例2本公開的肽(D-肽)的抗微生物性能的調(diào)查研究材料本研究中使用的肽由GLBiochem(中國上海)合成，并使用分析型反相(RP)-HPLC純化到大于95％。采用α-氰基-4-羥基肉桂酸(4-HCCA)作為基質(zhì)，使用基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-T0FMS，AutoflexII型，BrukerDaltonics公司，美國)進(jìn)一步確認(rèn)所述肽的分子量。4-HCCA購自Sigma-Aldrich(新加坡)，并在重新結(jié)晶后于飽和的乙腈/水(1:1體積比)中使用。磷酸鹽緩沖鹽水(10×PBS)購自1stBase(新加坡)并在使用前稀釋至所需濃度。陽離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基II(MHBII)和酵母霉菌液體培養(yǎng)基(YMB)粉末購自BDDiagnostics(新加坡)，并根據(jù)制造商的說明書重新構(gòu)建。從ATCC(美國)獲得表皮葡萄球菌(ATCC編號12228)、金黃色葡萄球菌(ATCC編號6538)、大腸埃希氏菌(ATCC編號25922)、綠膿假單胞菌(ATCC編號9027)和酵母白色念珠菌(ATCC編號10231)，并根據(jù)推薦的方案培養(yǎng)。從Sigma-Aldrich獲得環(huán)丙沙星、硫酸慶大霉素和青霉素G。圓二色(CD)光譜首先每種肽以0.5mg/mL-1溶解于單獨的去離子(DI)水或含有25mMSDS表面活性劑的去離子水中。使用具有1.0mm路徑長度的石英小室，在室溫下用CD分光偏振計(JASC0Corp.J-810)記錄CD譜。以10nmmin-1掃描速度，使用190-240nm的溶劑扣除獲得CD譜，并對每個肽樣品的5次運行進(jìn)行平均。使用以下方程式將獲得的CD譜轉(zhuǎn)化為平均殘基橢圓率：其中θM指平均殘基橢圓率(degcm2dmol-1)，θobs是在給定波長下針對DI水校正的觀察橢圓率(mdeg)，MRW是殘基分子量(Mw·氨基酸殘基數(shù)-1)，c是肽濃度(mgmL-1)，并且l是路徑長度(cm)。最小抑制濃度(MIC)測量使用液體培養(yǎng)基微量稀釋法，針對表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性)、大腸埃希氏菌和綠膿假單胞菌(革蘭氏陰性)，以及白色念珠菌(酵母)，研究了形成β-折疊的肽的抗微生物活性。在實驗之前，在300rpm的恒定振蕩下在37℃在MHBII中培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞，并且在300rpm的恒定振蕩下在室溫使酵母細(xì)胞在YMB中生長過夜，以達(dá)到對數(shù)生長期中期。用適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基稀釋微生物懸浮液，并進(jìn)行調(diào)整使得在微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士)上在600nm波長下的初始光密度(O.D.)讀數(shù)為約0.07。O.D.讀數(shù)對應(yīng)于麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)1號(約3×108CFUmL-1)。肽溶解于HPLC級水中，并使用適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)液進(jìn)行一系列的兩倍稀釋。隨后，將具有3×105CFUmL-1的初始加載水平的100μL微生物懸浮液添加到等體積(100μL)的聚合物溶液中，以獲得3.9-500mgL-1范圍的最終聚合物濃度，并且96孔板的每個孔中的水含量固定在10％(以體積計)。在37℃或室溫振蕩培養(yǎng)18h或42h后，MIC作為目視觀察不到微生物生長，并且從0h起O.D.讀數(shù)沒有變化的最低聚合物濃度。含有10％(以體積計)水的液體培養(yǎng)基以及僅純液體培養(yǎng)基中的微生物細(xì)胞用作陰性對照。為了保證無菌處理，在每個實驗中都包括含有純液體培養(yǎng)基且不含微生物的孔。在至少2個獨立場合下每個測試進(jìn)行6個重復(fù)。殺死效率測試在用不同濃度的肽(0.5×MIC、MIC和2×MIC)處理微生物18h后，對各個樣品進(jìn)行一系列的10倍稀釋，并平鋪到LB瓊脂板上。然后培養(yǎng)板過夜，并對菌落形成單位進(jìn)行計數(shù)。含有用10％(以體積計)水處理的微生物的樣品用作對照。結(jié)果表示為Log(CFU/mL)和殺滅％＝[(對照的細(xì)胞計數(shù)-肽處理的微生物的存活計數(shù))/對照的細(xì)胞計數(shù)]×100。場發(fā)射-掃描電子(FE-SEM)顯微鏡分析在96孔板中，分別用等體積的含有最終濃度為10％(以體積計)的HPLC水或125mgL-1IK8-全部D的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)約3×108CFUmL-1(100μL)的金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌懸浮液，2h。將每種條件8個重復(fù)合并到微量離心管中，以4000rpm5min沉淀，并用PBS沖洗2次。然后在室溫下用4％甲醛固定樣品20min，隨后用去離子水沖洗。使用一系列梯度的乙醇溶液(35％、50％、75％、90％、95％和100％)進(jìn)行細(xì)胞的脫水。將樣品固定在銅帶上，進(jìn)行空氣干燥，并用鉬進(jìn)行濺涂，以供使用FE-SEM設(shè)備(JE0LJSM-7400F，日本)進(jìn)行成像。溶血活性測試用RPMI164025倍稀釋新鮮的兔紅細(xì)胞×，以獲得約4％(以體積計)的懸浮液用于本實驗。將300μL紅細(xì)胞懸浮液添加到含有等體積(300μL)的RPMI1640中的肽溶液的每個管中。在37℃培養(yǎng)所述管子lh，然后以1000×g離心5min。將上清液的等分試樣(100μL)轉(zhuǎn)移到96孔板的每個孔中，并使用微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士)在576nm下針對血紅蛋白釋放分析等分試樣。用RPMI1640培養(yǎng)的紅細(xì)胞懸浮液用作陰性對照。用0.1％v/vTritonX-100溶解的紅細(xì)胞的吸光度用作陽性對照，并視為100％溶血。使用下式計算溶血百分比：溶血(％)＝[(處理樣品的O.D.576nm-陰性對照的O.D.576nm/陽性對照的O.D.576nm-陰性對照的O.D.576nm)]×100。數(shù)據(jù)表示為4個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差?？顾幮匝芯亢歪槍顾幮约?xì)菌的抗微生物活性根據(jù)先前描述的液體培養(yǎng)基微量稀釋法，用不同濃度的肽IK8-全部D以及臨床上使用的環(huán)丙沙星、慶大霉素和青霉素G抗生素，重復(fù)處理大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌(3×105CFUmL-1的初始加載水平)多達(dá)20次傳代。在每次傳代的18h培養(yǎng)結(jié)束時，對細(xì)菌細(xì)胞(在特定世代的1/4MIC)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并使其生長到達(dá)到對數(shù)生長期中期，然后用于隨后的MIC測試。通過記錄每次傳代的MIC的變化，即n次傳代的MIC歸一化為初始傳代的MIC(MICn/MIC0)，可監(jiān)測抗藥性的產(chǎn)生。在本測定結(jié)束時，用不同濃度的IK8-全部D處理產(chǎn)生的抗環(huán)丙沙星和慶大霉素的大腸埃希氏菌培養(yǎng)物以確定其是否可以有效克服抗生素藥物抗性。細(xì)胞培養(yǎng)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7和人胎肺纖維母細(xì)胞WI-38細(xì)胞分別維持在補充有2mML-谷氨酰胺、1.5gL-1碳酸氫鈉和10％FBS的DMEM和RPMI培養(yǎng)基中，并于37℃在5％CO2和95％濕潤空氣的氣氛下培養(yǎng)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌殺死以12孔板的每個孔4×105的密度接種RAW264.7細(xì)胞。在過夜培養(yǎng)后，用13.3μL處理過的細(xì)菌(3.0×108CFUmL-1)感染細(xì)胞lh，以達(dá)到10:1的感染復(fù)數(shù)。然后用1×PBS沖洗細(xì)胞兩次，并用含有50μgmL-1慶大霉素的lmL新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)45min，以清除細(xì)胞外細(xì)菌。去除每個孔中的培養(yǎng)基，并受感染細(xì)胞與含有10％(以體積計)水或不同濃度的IK8-全部D(2、3.9、7.8、15.6和31.3mgL-1)的新鮮培養(yǎng)基一起培養(yǎng)長達(dá)4h和8h。在各個時間點，使感染的細(xì)胞胰蛋白酶化，用PBS沖洗兩次，并用800μL無菌水溶解，在室溫下培養(yǎng)10min，然后超聲處理5min。通過將連續(xù)稀釋的培養(yǎng)物平鋪到LB瓊脂上并在24h后計數(shù)來確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌計數(shù)。細(xì)胞毒性測試分別以96孔板的每孔1.5×104和1×104的密度接種RAW264.7和WI-38細(xì)胞。在培養(yǎng)過夜后，用1.0-125mgL-1的IK8-全部D處理細(xì)胞48h。隨后，將每個孔中的培養(yǎng)基替換成100μL生長培養(yǎng)基和10μLMTT溶液(5mg·ml-1于PBS中)，并根據(jù)制造商的說明在37℃培養(yǎng)細(xì)胞4h。在去除生長培養(yǎng)基后，使用150μLDMSO溶解每個孔中形成的合成甲臜晶體。然后將來自每個孔的100μL等分試樣轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，以供使用微板分光光度計在550nm和690nm波長下測定吸光度。相對細(xì)胞活力表示為[(A550-A690)樣品/(A550-A690)對照]×100％。數(shù)據(jù)表示為來自以每個濃度4個重復(fù)的兩個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果肽設(shè)計和表征上述實施例1描述了由天然存在的L-氨基酸構(gòu)成的短的合成的形成β-折疊的肽的設(shè)計，并且證實了它們對臨床相關(guān)微生物的廣譜和高選擇性的抗微生物活性。在本研究中，使用分別n＝1.5、2或3個重復(fù)單元的最佳的β-折疊可折疊肽(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)(IK8-全部L)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)(IK12-全部L)進(jìn)行D-氨基酸的取代，所述肽在之前已針對抗微生物活性、選擇性和內(nèi)毒素中和性能進(jìn)行了優(yōu)化。所有設(shè)計的肽在C-末端均被酰胺化，以賦予高凈正電荷用以增強抗微生物活性。如表3中所示，使用MALDI-TOF質(zhì)譜確定的合成肽序列的觀察分子量與理論值接近一致，表明產(chǎn)物與所設(shè)計的組成接近一致。表3.形成β-折疊的肽的設(shè)計和表征。[a]小寫加下劃線的殘基表示D-氨基酸。[b]通過MALDI-TOFMS測量的，表觀Mw＝[Mw+H]+使用CD譜在微生物膜模擬環(huán)境中研究了所設(shè)計的肽的二級結(jié)構(gòu)形成。在25mMSDS膠束溶液中IK8-全部L和IK12-全部L容易自組裝以形成β-折疊二級結(jié)構(gòu)，如由約200nm處的特征性最大值和約218nm處的特征性最小值所證明(圖11a和圖11b)。相應(yīng)的對映體異構(gòu)體IK8-全部D和IK12-全部D是精確鏡像，具有與它們的L-對應(yīng)物的橢圓率相比大致等同但符號相反的橢圓率。有趣的是，在最佳的IK8-全部L序列中的第2、4、6、8(IK8-4D)位處的選擇性D-氨基酸取代導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)的完全喪失，而僅第4、6(IK8-2D)位處的取代使得能夠保留形成β-折疊的傾向(圖11c)。由于β-折疊形成受到給定肽中的側(cè)鏈官能團(tuán)之間的分子間氫鍵的控制，因此IK8-4D中包含大量的D-氨基酸可能影響肽結(jié)構(gòu)內(nèi)官能團(tuán)的空間定位，導(dǎo)致鄰近肽分子之間的相互作用喪失從而破壞β-折疊形成。形成β-折疊的序列IK8-全部L中陽離子氨基酸和疏水性氨基酸重排而產(chǎn)生對照肽(IIRK)2-NH2(對照-全部L；SEQIDNO:25)、(iirk)2-NH2(對照-全部D；SEQIDNO:26)和(IirK)2-NH2(對照-4D；SEQIDNO:275)(表3)導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)的喪失；盡管所述分子的總電荷和疏水性保持不變，但在測試條件下它們以無規(guī)卷曲形式存在(圖11d)。因此，該結(jié)果表明，所述氨基酸交替的疏水性和親水性空間定位為在膜條件下β-折疊的形成所必需。如圖18中所示，所設(shè)計的肽在去離子水中保持為無規(guī)卷曲形式，因此證實了各個形成β-折疊的肽對兩親性微生物膜模擬物的特異性。抗微生物活性和選擇性針對一組臨床相關(guān)的微生物，包括表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)、大腸埃希氏菌和綠膿假單胞菌(革蘭氏陰性菌)以及白色念珠菌(酵母)，評估了所設(shè)計的肽的抗微生物活性。表4.合成的抗微生物肽的最小抑制濃度(MIC)和選擇性指數(shù)[a]測試的5種微生物的MIC值的幾何平均值(GM)。[b]溶血濃度10％(HC10)被定義為誘導(dǎo)≥10％溶血的最低肽濃度。[c]選擇性指數(shù)(SI)以計算。[d]4種微生物的GMMIC值，所述肽具有針對這4種微生物的活性。[e]從125mgL-1開始RPMI1640培養(yǎng)基中發(fā)生的沉淀。從表4中可見，與形成非β-折疊的肽相比，不管立體化學(xué)如何，在微生物膜模擬條件下組裝成β-折疊的肽序列顯示了針對所有測試的微生物顯著更強且更寬范圍的活性(表4)。例如，不同的形成β-折疊的肽的幾何平均(GM)最小抑制濃度(MIC)的范圍為4.3-113.3mgL-1，而形成非β-折疊的對照肽和IK8-4D未表現(xiàn)出或表現(xiàn)出顯著降低的抗微生物活性。因此，該觀察證實，所設(shè)計的AMP自組裝以形成β-折疊二級結(jié)構(gòu)對它們的強抗微生物性能至關(guān)重要。該發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報道一致，其中AMP的生物活性常常與形成二級結(jié)構(gòu)時陽離子氨基酸殘基與相對面上的疏水性氨基酸殘基的分離而導(dǎo)致膜脂雙層的破壞有關(guān)。有趣的是，為獲得(IirK)2-NH2(對照-4D)選擇性取代形成非β-折疊的IIRK基序(對照-均為L)的第2位和第3位的D-氨基酸部分地恢復(fù)了針對表皮葡萄球菌、大腸埃希氏菌、綠膿假單胞菌和白色念珠菌的抗微生物活性(表4)。特別地，針對大腸埃希氏菌的MIC值增加了約16倍，從>500mgL-1到31.3mgL-1。然而，該肽的抗微生物活性保持低于長度、電荷和疏水性相同的形成β-折疊的肽(即IK8-全部L或IK8-全部D)。另外，還發(fā)現(xiàn)用D-氨基酸取代顯著改善了形成β-折疊的肽的抗微生物活性，而不論重復(fù)單元的數(shù)目(n＝2或3)或肽長度如何。該效果對于具有n＝2個重復(fù)單元的較短的IK8-全部D肽尤其顯著，所述鈦針對不同細(xì)菌的MIC值比其L-對映異構(gòu)體低2-16倍。相比之下，與其相應(yīng)的L-對映異構(gòu)體相比，IK12-全部D介導(dǎo)了MIC值2-4倍降低，其具有增強的針對白色念珠菌的抗真菌活性。在不同的肽中，IK8-全部D顯示出最有效的抗微生物活性，其針對不同類型的微生物具有非常低的幾何平均(GM)MIC值(4.3mgL-1)，優(yōu)于在相同的測試條件下針對臨床上使用的脂肽抗生素多粘菌素B所獲得的值(41.4mgL-1)。肽長度進(jìn)一步減少至6個D-氨基酸(n＝1.5)導(dǎo)致抗微生物活性降低，其具有更高的GMMIC值(113.3mgL-1)，表明具有n＝2個重復(fù)單元的形成β-折疊的肽提供了最佳的抗微生物活性結(jié)構(gòu)。使用4％(以體積計)兔血評估了合成肽的溶血活性。如先前所報道的，含有全部L-氨基酸的形成β-折疊的肽在MIC值下顯示最小的溶血或無溶血，具有對于微生物膜的高選擇性(也顯示在圖2和表2中)。在本發(fā)明的研究中，發(fā)現(xiàn)n＝2個重復(fù)單元的形成β-折疊的肽的對映異構(gòu)體形式之間的溶血活性的差異很小，IK8-全部L和IK8-全部D分別具有高HC10值(2000mgL-1和1750mgL-1)(表4)。鑒于對先前觀察到的抗微生物活性的極大改善，這些結(jié)果清楚地證實了，D-對映異構(gòu)體對于陰離子微生物膜的選擇性高于對于兩性離子型哺乳動物細(xì)胞膜的選擇性，IK8-全部D和IK12-全部D分別產(chǎn)生了非常高的SI(407.0mgL-1和>>9.8mgL-1)(表4)。總之，這些結(jié)果表明，n＝2的合成的形成β-折疊的肽的D-對映異構(gòu)體(IK8-全部D)具有廣譜和高選擇性的抗微生物活性，可以作為用于治療抗藥性微生物感染的強治療候選物。與它們差的抗微生物活性一致，形成非β-折疊的肽(對照-全部L和對照-全部D)在高達(dá)2500mgL-1下誘導(dǎo)最小溶血或無溶血(圖12c)，表明與紅細(xì)胞膜的同樣弱相互作用。同樣，D-氨基酸取代的形成非β-折疊的肽對照-4D顯示出針對幾種微生物的一定程度的抗微生物活性，也誘導(dǎo)最小溶血，因此產(chǎn)生高選擇性指數(shù)(SI)(>23.3)(表4)。這些結(jié)果表明，在不存在二級結(jié)構(gòu)形成的情況下，用D-氨基酸取代后獲得的改變的肽構(gòu)象仍然可以允許與某些微生物膜組成的適度的相互作用，而不會影響真核生物細(xì)胞膜(圖11d)。對蛋白酶降解的抗性限制AMP的臨床效用的主要因素之一在于它們不穩(wěn)定而被大量存在于生物體液中和/或由微生物分泌的蛋白酶快速降解。為了評估所設(shè)計的形成β-折疊的肽的蛋白質(zhì)水解穩(wěn)定性，將n＝2的肽序列的D-異構(gòu)體和L-異構(gòu)體(分別為IK8-全部D或IK8-全部L)用廣譜絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K處理6h，并評估它們對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和綠膿假單胞菌的抗微生物活性。如圖13中所見，在培養(yǎng)18h后，未處理的IK8-全部D和IK8-全部L有效抑制所有3種微生物的生長。然而，用蛋白酶處理IK8-全部L導(dǎo)致細(xì)菌抑制活性的完全喪失，表明其已被存在的蛋白酶降解。另一方面，IK8-全部D保留了其對各種微生物的抗細(xì)菌活性。還使用MALDI-TOF質(zhì)譜評估了用兩種蛋白酶處理后的合成肽的結(jié)構(gòu)完整性。如從MALDI-TOF質(zhì)譜所見，用兩種蛋白酶處理IK8-全部L均導(dǎo)致完整肽的降解，產(chǎn)生多個較低分子量的峰(圖19a)，因此解釋了先前觀察到的抗細(xì)菌活性的喪失。圖19a中圖解說明了兩種酶對于IK8-全部L肽的切割位點，其中質(zhì)譜峰被分配給主要片段。相反，IK8-全部D在蛋白酶處理后保持完整，沒有觀察到較低分子量的產(chǎn)物(圖19b)。這種對酶降解的降低的敏感性，結(jié)合先前觀察到的優(yōu)良的抗微生物活性和選擇性強烈地表明，IK8-全部D是用于治療應(yīng)用的有前景的候選物。膜溶解活性和抗藥性緩解AMP的主要作用機(jī)制在于微生物膜的快速擾亂和破壞，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物的滲漏和最終的細(xì)胞死亡。由于微生物修復(fù)大量的細(xì)胞膜損傷是非常具有挑戰(zhàn)性的，因此已經(jīng)提出了這種殺細(xì)菌作用模式以提供高度有吸引力的方式來預(yù)防和克服抗藥性機(jī)制。本研究首次確定，與其L-對映異構(gòu)體類似，IK8-全部D介導(dǎo)殺細(xì)菌作用機(jī)制，在本研究中測試的5種微生物中每種的各自MIC值下，導(dǎo)致存活菌落計數(shù)的大于3個對數(shù)降低(>99.9％殺死效率)(圖14)。在FE-SEM下，與用含有10％(以體積計)水的液體培養(yǎng)基處理的各個對照的平滑表面相比，在用125mgL-1IK8-全部D短暫處理2h后，在革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的綠膿假單胞菌的表面上，觀察到顯著的膜損傷和起皺(圖15)。已知將微生物長時間重復(fù)暴露于非致死劑量的抗生素促進(jìn)抗藥性的獲得。為了研究IK8-全部D介導(dǎo)的膜破壞是否能夠充分地防止抗藥性產(chǎn)生，將用亞MIC量AMP處理的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌每天傳代，并用于測定多達(dá)20次傳代的MIC。在本研究中包括各種類別的臨床上使用的抗生素(包括細(xì)胞壁合成抑制劑青霉素G、細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑環(huán)丙沙星和蛋白質(zhì)合成抑制劑硫酸慶大霉素)作為對照。如圖16中所示，盡管用低劑量的所設(shè)計的AMP重復(fù)處理，但I(xiàn)K8-全部D針對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC值仍然在3.9mgL-1(MICn/MIC0＝1)保持不變。用硫酸慶大霉素處理大腸埃希氏菌，最早在第2次傳代時誘導(dǎo)抗藥性，如從MIC值的加倍(MICn/MIC0＝2)所見，隨后到第6次傳代時增加到原始MIC值的4倍((MICn/MIC0＝4)(圖16a)。環(huán)丙沙星介導(dǎo)稍微延遲的抗藥性起始，第4次傳代隨后出現(xiàn)MIC加倍。隨后到第7次傳代時MIC值增加4倍，隨后在實驗結(jié)束時MIC值大幅增加32倍。對于金黃色葡萄球菌也觀察到類似的趨勢，早期獲得抗藥性且到第20次傳代時對青霉素G的MIC和環(huán)丙沙星的MIC分別增加32倍和4倍(圖16b)?？傊?，這些結(jié)果強烈地表明，由不同抗生素介導(dǎo)的各種抗微生物作用機(jī)制不同程度地影響它們的抗藥性產(chǎn)生譜。值得注意的是，在實驗過程中用合成的形成β-折疊的肽對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行重復(fù)處理不誘導(dǎo)任何抗藥性產(chǎn)生。除了能夠防止抗藥性產(chǎn)生外，用IK8-全部D處理來源于本實驗的抗慶大霉素和環(huán)丙沙星的大腸埃希氏菌還揭示出，所述合成的肽以與野生型(非抗藥性的)細(xì)菌中的濃度相同的濃度(即3.9mgL-1)有效抑制細(xì)菌生長(圖20)。該結(jié)果有力地證明，形成β-折疊的肽的膜破壞能力可有效克服常規(guī)的抗生素抗性機(jī)制以抑制細(xì)菌生長。針對抗藥性微生物的臨床分離物進(jìn)一步研究了所設(shè)計的形成β-折疊的肽的活性。如表5中所見，所設(shè)計的AMP顯示了針對MRSA、VRE、多重抗藥性鮑曼不動桿菌、綠膿假單胞菌和酵母新型隱球菌的廣譜抗微生物活性。與先前觀察到的結(jié)果一致，與其L-對映異構(gòu)體相比，IK8-全部D誘導(dǎo)更強的抗細(xì)菌活性，其MBC降低4-8倍。另外，IK8-全部D、IK8-2D和IK12-全部L還顯示針對臨床上分離的結(jié)核分枝桿菌的極佳活性，其MIC范圍為15.6-125mgL-1(表6)。表5.合成的抗微生物肽對臨床上分離的抗藥微生物的最小殺微生物濃度(MBC)。表6.合成的抗微生物肽對臨床上分離的結(jié)核分枝桿菌的最小抑制濃度(MIC)。受感染的小鼠巨噬細(xì)胞中金黃色葡萄球菌的細(xì)胞內(nèi)殺死肺泡巨噬細(xì)胞對微生物的吞噬，由于存活和保護(hù)細(xì)菌免受許多很少滲入細(xì)胞中的細(xì)胞外抗生素?fù)p害，可潛在地產(chǎn)生持續(xù)性感染的來源。金黃色葡萄球菌是可存活于肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的機(jī)會性病原體的臨床相關(guān)示例，并且常常與社區(qū)和醫(yī)院獲得的肺感染病例有關(guān)。因此，接下來研究了合成的AMP根除細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的能力。用不同劑量的IK8-全部D處理受感染的RAW264.7小鼠肺泡巨噬細(xì)胞4h和8h。如從圖17中所見，當(dāng)與用含有10％(以體積計)水(P<0.01)的培養(yǎng)基處理對照所獲得的相比時，用IK8-全部D處理4h和8h后細(xì)胞內(nèi)的金黃色葡萄球菌菌落計數(shù)顯著降低。例如，當(dāng)與對照相比時，所設(shè)計的肽在8h時有效地介導(dǎo)菌落計數(shù)的1.2-1.5對數(shù)降低(圖17)。重要的是，發(fā)現(xiàn)由IK8-全部D介導(dǎo)的金黃色葡萄球菌的細(xì)胞內(nèi)殺死獨立于所述肽的細(xì)胞毒性，因為在殺細(xì)菌劑量觀察到大于80％細(xì)胞活力(圖21)。還在人胎肺纖維母細(xì)胞WI-38細(xì)胞系中研究了IK8-全部D的細(xì)胞毒性，并且顯示在高達(dá)62.5mgL-1(遠(yuǎn)高于其抗微生物濃度)大于77％的細(xì)胞活力?？傊@些結(jié)果證實，除了在細(xì)胞外細(xì)菌殺死中的有效活性，所設(shè)計的形成β-折疊的肽還可有效進(jìn)入受感染細(xì)胞，以降低細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌負(fù)載并產(chǎn)生最小的細(xì)胞毒性。實施例2研究了二級結(jié)構(gòu)形成的重要性和立體化學(xué)對抗微生物活性和選擇性的影響。證實在微生物膜模擬條件下合成肽自組裝成β-折疊是其強抗微生物活性所必需的。在不同的肽中，IK8-全部D展現(xiàn)最強效的抗微生物活性，具有非常高的選擇性指數(shù)(407.0)。在廣譜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K存在下，D-對映異構(gòu)體還顯示增加的穩(wěn)定性。另外，IK8-全部D的膜溶解活性提供了有效方式來防止抗藥性產(chǎn)生和有效地介導(dǎo)對不同的臨床上分離的多重抗藥性微生物的殺死。除了對細(xì)胞外微生物的效力外，合成的形成β-折疊的肽IK8-全部D還顯示出對細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的有效殺死?？傊?，這些結(jié)果顯示，D-氨基酸取代的形成β-折疊的肽IK8-全部D，具有增強的抗微生物活性和改善的蛋白酶穩(wěn)定性，可用于在各種臨床應(yīng)用中與抗生素抗性微生物對抗。實施例3本公開的肽的抗增殖性能的調(diào)查研究細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞系、人表皮纖維母細(xì)胞HDF細(xì)胞系和大鼠巨噬細(xì)胞NR8383細(xì)胞系分別維持在補充有10％FBS、100UmL-1青霉素和100mgmL-1鏈霉素的RPMI、DMEM和FK15生長培養(yǎng)基中，并在37℃、5％CO2和95％濕潤空氣的氣氛下培養(yǎng)。細(xì)胞活力測試分別以96孔板的每個孔1×104、1×104和4×104個細(xì)胞的密度接種HeLa、HDF和NR8383細(xì)胞。在培養(yǎng)過夜后，用3.9-500mgL-1(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)和(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)處理細(xì)胞24h。對于粘附的HeLa和HDF細(xì)胞系，將每個孔中的培養(yǎng)基替換成100μL生長培養(yǎng)基和10μLMTT溶液(于PBS中5mg·ml-1)。根據(jù)制造商的說明，在37℃進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞4h。在去除生長培養(yǎng)基后，使用150μLDMSO溶解每個孔中形成的合成甲臜晶體。然后將來自每個孔的100μL等分試樣轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，以供使用微板分光光度計在550nm和690nm波長下測定吸光度。相對細(xì)胞活力表示為[(A550-A690)樣品/(A550-A690)對照]×100％。數(shù)據(jù)表示為來自每個濃度進(jìn)行4個重復(fù)的兩個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。對于半粘附的NR8383細(xì)胞，在處理后將20μL的試劑添加到每個孔中，并再培養(yǎng)所述板4h。使用微板讀數(shù)器在560nm激發(fā)波長和590nm發(fā)射波長處測定孔的熒光強度讀數(shù)。含有不存在細(xì)胞的肽溶液的對照孔被包括在內(nèi)以確定背景熒光。＝[(F處理的樣品–F對應(yīng)的背景)/(F10％水對照-F10％水對照背景)]×100。數(shù)據(jù)表示為4個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如從圖22中所見，用(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)處理HeLa宮頸癌細(xì)胞系導(dǎo)致細(xì)胞活力從125mg/L開始濃度依賴性地降低到小于70％。另一方面，大于80％的非癌性HDF和NR8383細(xì)胞在125mg/L下存活。類似地，用(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)處理HeLa細(xì)胞導(dǎo)致在250mg/L下僅30％細(xì)胞活力，而HDF和NR8383細(xì)胞具有大于53％細(xì)胞活力。因此，這些結(jié)果證實，與正常細(xì)胞膜相比，形成β-折疊的肽對帶有更多陰離子電荷的癌細(xì)胞膜具有更大的選擇性。實施例4本公開的肽對角膜炎的效果的調(diào)查研究材料和方法肽表征本研究中使用的肽由GLBiochem(中國上海)合成，并使用分析型反相(RP)-HPLC純化到大于95％。采用α-氰基-4-羥基肉桂酸(4-HCCA)作為基質(zhì)，使用基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-T0FMS，AutoflexII型，BrukerDaltonics公司，美國)進(jìn)一步確認(rèn)所述肽的分子量。4-HCCA購自Sigma-Aldrich(新加坡)，并在重新結(jié)晶后于飽和的乙腈/水(1:1體積比)中使用。磷酸鹽緩沖鹽水(10×PBS)購自1stBase(新加坡)，并在使用前稀釋到所需濃度。Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基II(MHBII)和酵母霉菌液體培養(yǎng)基(YMB)粉末購自BDDiagnostics(新加坡)，并根據(jù)制造商的說明書重新構(gòu)建。從ATCC(美國)獲得表皮葡萄球菌(ATCC編號12228)、金黃色葡萄球菌(ATCC編號29737)、大腸埃希氏菌(ATCC編號25922)、綠膿假單胞菌(ATCC編號9027)和酵母白色念珠菌(ATCC編號10231)，并根據(jù)推薦的方案培養(yǎng)。來自大腸埃希氏菌0111:B4的脂多糖(LPS)和FITC-綴合的LPS購自Sigma-Aldrich。從Promega(美國)獲得格里斯試劑系統(tǒng)并根據(jù)制造商的方案使用。最小抑制濃度(MIC)的測定通過液體培養(yǎng)基微量稀釋法，針對真菌白色念珠菌(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)和腐皮鐮刀菌(ATCC)確定肽的MIC。在室溫、300rpm的恒定振蕩下白色念珠菌在酵母霉菌液體培養(yǎng)基(YMB)中生長，以達(dá)到對數(shù)生長期中期。用適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基稀釋微生物懸浮液，并進(jìn)行調(diào)整使得在微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士)上在600nm波長下的初始光密度(O.D.)讀數(shù)為約0.07，其對應(yīng)于麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)1號(約3×108CFUmL-1)。肽溶解于經(jīng)0.2μm過濾的HPLC級水中，并使用適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)液進(jìn)行一系列的兩倍稀釋。將具有3×105CFUmL-1的初始加載水平的100μL微生物懸浮液添加到等體積(100μL)的肽溶液中，以獲得3.9-500mgL-1范圍的終濃度，并且96孔板的每個孔中的水濃度固定在10％(以體積計)。在室溫下振蕩培養(yǎng)42h后，MIC作為目視觀察不到微生物生長的最低肽濃度。含有10％(以體積計)HPLC級水的液體培養(yǎng)基以及單獨的純液體培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞用作陰性對照。在培養(yǎng)器中在37℃在沙氏(sabouraud)右旋糖瓊脂板上培養(yǎng)腐皮鐮刀菌。為了在培養(yǎng)后收集分生孢子，在進(jìn)行實驗之前收獲腐皮鐮刀菌種的分生孢子并且標(biāo)準(zhǔn)化為1×108個孢子/ml。將沙氏右旋糖液體培養(yǎng)基(90μL)添加到培養(yǎng)板的孔中。通過2倍稀釋法在孔中制備不同濃度的肽，并且用含有1×106個孢子的10μL孢子懸浮液接種這些孔。板在37℃培養(yǎng)并在24h后肉眼檢查腐皮鐮刀菌的生長。在所述研究中包括沒有任何處理的適當(dāng)?shù)膶φ湛?。如果孔表現(xiàn)為透明的，沒有任何可見的腐皮鐮刀菌生長，則認(rèn)為肽是有活性的，并結(jié)果表示為MIC。對于每個濃度以4個重復(fù)進(jìn)行測定。體外殺死動力學(xué)進(jìn)行殺死動力學(xué)測試以評估肽對白色念珠菌的抗微生物活性。酵母溶液重懸于YMB(Difco)中以實現(xiàn)105-106CFUmL-1。將初始接種物暴露于濃度為1×MIC、2×MIC和4×MIC的肽1達(dá)0h、1h、2h、4h和24h，并且在這些時間點，以不同的稀釋系數(shù)稀釋樣品。每個稀釋物(20μL)平鋪在瓊脂板上并培養(yǎng)2天。培養(yǎng)后對存活的菌落計數(shù)。未處理的接種物組用作陰性對照。以一式三份進(jìn)行測試，結(jié)果表示為殺死效率(％)。穩(wěn)定性測試肽1和肽2以2mg/mL溶解在HPLC級水中，在121℃進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蒸汽滅菌高壓釜循環(huán)15min，并且在室溫下放置6周的一段時間。肽的完整性通過在處理之前和處理之后經(jīng)由MALDI-TOFMS評估它們的分子量來確定。對白色念珠菌生物膜的抗真菌研究(體外角膜炎治療模型)白色念珠菌用作用于測試肽1的抗真菌功能的代表性真菌。使用-80℃冷凍儲備培養(yǎng)物由YMB中的新鮮過夜培養(yǎng)物制備白色念珠菌懸浮液。這些培養(yǎng)物的子樣品再生長3h，并調(diào)節(jié)到在600nm下的光密度為約0.1，密度為107–108CFU/mL。體外白色念珠菌生物膜的制備稀釋到3×106CFUml-1白色念珠菌的過夜培養(yǎng)物以每孔100μL體積添加到96孔板的每個孔中，并在37℃、100rpm輕微振蕩下使其粘附5h。然后用100μLPBS沖洗孔一次以去除浮游的細(xì)胞和松散附著的細(xì)胞，并補充100μL新鮮液體培養(yǎng)基。在實驗前使生物膜形成持續(xù)長達(dá)2天且每天進(jìn)行沖洗并更換培養(yǎng)基。生物膜敏感性為了確定肽處理對生物膜中的白色念珠菌的活力的影響，將100μL不同濃度的肽1溶液添加到每個孔中，并培養(yǎng)24h。隨后，去除溶液，用100μLPBS漂洗一次，然后將120μL活化的XTT溶液添加到每個孔中。在培養(yǎng)4h后，將來自每個孔的90μL等分試樣轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，以供使用微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士)分別在490nm測量波長和660nm參照波長下測定吸光度。用含有10vol％水的液體培養(yǎng)基處理的生物膜用作對照。相對細(xì)胞活力表示為[(A490-A660)樣品/(A490-A660)對照]×100％。數(shù)據(jù)表示為每個濃度的4個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。生物量測定通過結(jié)晶紫染色法估算生物膜的生物量。簡單地說，首先如上所述用所述肽處理形成的生物膜24h。在吸出培養(yǎng)基后，用PBS將生物膜沖洗一次，在室溫下用甲醇固定15min，并用100μL0.1％(體積重量比)結(jié)晶紫染色10min。通過用DI水沖洗孔5次來去除過量的結(jié)晶紫染料。使用每孔100μL33％冰乙酸提取與生物膜結(jié)合的染料，并將來自每個孔的60-μL等分試樣轉(zhuǎn)移到新的94孔板中，以供使用微板讀數(shù)器(TECAN，瑞士)在570nm波長下定量吸光度。肽處理后殘留的生物量的相對量表示為用含有10vol％水的液體培養(yǎng)基處理的對照的百分比。數(shù)據(jù)表示每個濃度4個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。對生物膜的掃描電子顯微鏡研究使用在4.0-6.0keV加速電壓下操作的場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)(JEOLJSM-7400F)觀察用肽1處理的白色念珠菌生物膜的形態(tài)。白色念珠菌生物膜與1000mg/L的肽一起培養(yǎng)24h。用PBS洗滌三次，然后在含有2.5％戊二醛的PBS中固定過夜。用DI水進(jìn)一步洗滌細(xì)胞，并使用一系列乙醇洗滌脫水。將幾滴懸浮液置于銅帶上，并在室溫下干燥。在FESEM分析之前用鉑涂覆樣品。體內(nèi)小鼠角膜炎治療模型小鼠來源成年C57BL/6小鼠(8周齡，18-22g)用于動物研究。在開始實驗之前檢查所有小鼠眼不存在眼部病變。實驗方案由新加坡科技研究局(A*STAR)的生物資源中心的機(jī)構(gòu)動物管理和使用委員會批準(zhǔn)。所述肽的體內(nèi)毒性評估在小鼠眼中測試所述肽。在第一個小時期間每5min以3000mg/L劑量向小鼠施用所述肽并且在接下來的7h期間每30min以3000mg/L劑量向小鼠施用所述肽。在暫停16h后，以每小時間隔再施用滴眼劑8h。在施用最后一次滴眼劑后16h處死所有小鼠。立即收集處理的眼球。將固定的眼球包埋在石蠟中，進(jìn)行切片并通過標(biāo)準(zhǔn)方案用蘇木精和曙紅染色。隱形眼鏡相關(guān)性角膜炎模型用于本研究的LotrafilconA隱形眼鏡購自CIBAVision，焦度為+1.50屈光度。用PBS洗滌隱形眼鏡，并將其浸入YMB中過夜，然后將其沖壓成直徑為2mm的較小片。為了使白色念珠菌生物膜生長，將透鏡置于具有4mL酵母懸浮液(107CFU/mL)的6孔組織培養(yǎng)板中，并且在22℃培養(yǎng)3h。用PBS輕輕地洗滌隱形眼鏡以去除未粘附的酵母細(xì)胞，并在22℃、100rpm振蕩下浸入YMB中48h。通過采用隱形眼鏡生物膜感染來建立黑色小鼠角膜炎模型(如以下文獻(xiàn)中所述：GoldblumD,FruehBE,SarraGM,KatsoulisK,ZimmerliS.TopicalcaspofunginfortreatmentofkeratitiscausedbyCandidaalbicansinarabbitmodel.AntimicrobAgentsChemother2005；49:1359-63；LiP,PoonYF,LiW,ZhuHY,YeapSH,CaoY等人，Apolycationicantimicrobialandbiocompatiblehydrogelwithmicrobemembranesuctioningability.NatMater2011；10:149-56；PrakashG,SharmaN,GoelM,TitiyalJS,VajpayeeRB.Evaluationofintrastromalinjectionofvoriconazoleasatherapeuticadjunctiveforthemanagementofdeeprecalcitrantfungalkeratitis.AmJOphthalmol2008；146:56-9；和SunY,ChandraJ,MukherjeeP,Szczotka-FlynnL,GhannoumMA,PearlmanE.Amurinemodelofcontactlens-associatedfusariumkeratitis.InvestOphthalmolVisSci2010；51:1511-6)。經(jīng)由腹膜內(nèi)注射(I.P.)氯胺酮(150mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/mL)麻醉小鼠。還施用了0.5％鹽酸丁卡因滴眼劑(Bausch&Lomb，Tampa，F(xiàn)lorida)形式的另外的局部麻醉劑。在本研究中使用總共29只小鼠。用99％1-庚醇(Sigma-Aldrich，Lausanne，瑞士)潤濕的1mm濾紙盤放置在角膜的中心上40s。創(chuàng)傷性地擦除角膜上皮，并用PBS沖洗眼以去除任何殘留的痕量的1-庚醇。然后將來自具有白色念珠菌生物膜的隱形眼鏡的2mm直徑?jīng)_壓物放置在裸露的角膜表面上。用絲線使眼瞼閉合而將隱形眼鏡保持在眼內(nèi)。在接種后18h白色念珠菌細(xì)胞在眼球上生長；觀察到具有堅韌的革質(zhì)凸起表面的眼潰瘍。建立了從0(無疾病)到4(嚴(yán)重疾病)的疾病分級用以評估治療功效(表7)。通過皮下注射環(huán)磷酰胺(Sigma-Aldrich，180g/kg)使小鼠免疫抑制。表7.用于體內(nèi)角膜炎治療的臨床分級和評分。使用肽的角膜炎治療功效的評估用4種局部滴眼劑溶液隨機(jī)處理動物：水溶液(對照)、3000mg/L肽1、3000mg/L肽2以及1000mg/L兩性霉素B。在第一個小時期間每5min向小鼠施用滴眼劑(各20μl)并且在接下來的7h期間每30min向小鼠施用滴眼劑(各20μl)。在暫停16h后，以每小時間隔再施用滴眼液8h。在施用最后一次滴眼劑后16h處死所有小鼠。立即收集處理的眼球。收集來自每組的3個眼球用于組織學(xué)研究，并且將剩余的6個眼球勻質(zhì)化用于定量的真菌回收研究。將固定的眼球包埋在石蠟中，進(jìn)行切片并通過標(biāo)準(zhǔn)方案用Grocott烏洛托品銀染色。結(jié)果與形成非β-折疊的肽(IIRK)2–NH2(即肽3)相比，研究了形成β-折疊的肽(IKIK)2–NH2(即肽1)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)針對角膜炎相關(guān)真菌(包括白色念珠菌和腐皮鐮刀菌)的活性。如從表8所見，所設(shè)計的形成β-折疊的肽1和肽2顯示出強抗真菌活性，其針對白色念珠菌的MIC范圍為2-3.9mg/L，其針對腐皮鐮刀菌的MIC為31.3mg/L。相比之下，形成非β-折疊的肽3針對白色念珠菌僅顯示出適中的活性，具有明顯更高的MIC(>500mg/L)，并且發(fā)現(xiàn)其針對腐皮鐮刀菌根本無效。該結(jié)果證實，在與微生物膜相互作用之上形成β-折疊二級結(jié)構(gòu)對于所設(shè)計的肽的抗真菌作用是重要的。由于對白色念珠菌的優(yōu)異活性，因此用肽1進(jìn)行了殺死動力學(xué)研究。如圖23中所示，在MIC水平下處理2h后，白色念珠菌細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。在MIC下4h后以及在2×MIC和4×MIC下1h后大多數(shù)真菌被殺死。這些結(jié)果表明時間和劑量依賴性殺真菌作用機(jī)制；越高濃度的肽在越短的時段內(nèi)有效地根除所有真菌。表8.抗微生物肽的最小抑制濃度(MIC)MIC(mg/L)白色念珠菌腐皮鐮刀菌(IKIK)22.031.3(IRIK)23.931.3(IIRK)2>500>500大多數(shù)抗真菌劑對真菌性角膜炎無效，因為真菌性角膜炎感染經(jīng)常作為生物膜存在，其中真菌細(xì)胞附著在一起并被封閉在自產(chǎn)的ECM內(nèi)。肽1用于處理體外生長的白色念珠菌生物膜。如圖24A中所示，在500mg/L單個肽處理后24h內(nèi)90％細(xì)胞被殺死。在相同的肽濃度下處理后，白色念珠菌生物膜的生物量顯著降低(圖24B)。肽濃度增加導(dǎo)致生物量的進(jìn)一步降低。另外，SEM研究進(jìn)一步證實，在1000mg/L肽處理24h后，白色念珠菌細(xì)胞的形態(tài)變形，并且生物量顯著降低(圖25)。另外，測試了肽1的穩(wěn)定性。肽1溶液被高壓蒸汽滅菌，并且在沒有任何避光保護(hù)的情況下在室溫下保持6周。肽1的分子量保持不變且沒有觀察到降解產(chǎn)物，證實所述肽可通過高壓蒸汽滅菌來滅菌，并且在水中是穩(wěn)定的。在小鼠眼中評估肽1和肽2(各3000mg/L)的毒性。在局部施用所述肽后角膜的組織學(xué)圖像未顯示角膜上皮侵蝕的顯著跡象，并且施加高濃度的肽未導(dǎo)致基礎(chǔ)基質(zhì)的明顯病理變化(圖26)?？傊?，這些結(jié)果證實，肽1和肽2具有針對浮游性角膜炎相關(guān)真菌和它們的生物膜的高效力，以及極佳的穩(wěn)定性。另外，它們在用作滴眼劑時對眼無毒。為了研究肽在真菌角膜炎治療中的潛在應(yīng)用，在小鼠中建立了白色念珠菌角膜炎模型。首先在用于生物膜形成的隱形眼鏡上培養(yǎng)白色念珠菌。然后將含有白色念珠菌生物膜層的隱形眼鏡轉(zhuǎn)移到小鼠的脫上皮的角膜的表面上。在18h接種后，白色念珠菌生物膜感染角膜，導(dǎo)致形成具有堅韌的革質(zhì)凸起表面的眼潰瘍。肽1溶液(3000mg/L)、肽2溶液(3000mg/L)、兩性霉素B(1000mg/L)和水(對照)作為滴眼劑以20μL量局部施加在角膜的表面上。與對照組相比，在處理后觀察到角膜炎感染的顯著消退，角膜變得更透明并且虹膜可見。所述肽的治療功效與兩性霉素B的治療功效相當(dāng)(圖27)。根據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)評估治療前和治療后真菌性角膜炎的臨床評分。如圖28中所示，所有治療組中小鼠角膜的臨床評分均顯著低于對照組。另外，處理的眼球被固定并用過碘酸-希夫(PAS)染色。在對照組中，真菌菌絲延伸到角膜基質(zhì)中，而用肽1、肽2和兩性霉素B的處理減小了菌絲侵入角膜的最大深度(圖29)。組織學(xué)研究進(jìn)一步驗證用所述肽和兩性霉素B的處理顯著降低真菌在患有角膜炎的角膜中的浸潤。為了對處理的眼球中的真菌計數(shù)進(jìn)行定量，將處理的眼球勻質(zhì)化，并通過瓊脂鋪板確定每只眼球中白色念珠細(xì)胞的數(shù)目。所述肽在減少眼球中白色念珠菌菌落的數(shù)目方面與兩性霉素B一樣有效，并且與未處理的對照組相比，約90％的真菌細(xì)胞在處理后從生物膜中被從根除(圖30)。總之，這些合成的形成β-折疊的肽在根除小鼠眼中的固著性角膜炎相關(guān)真菌和它們的生物膜方面是有效的。因此，在本公開中，本公開的發(fā)明人已證實，形成β-折疊的肽具有強的抗真菌活性，并且能夠去除在體外和真菌生物膜誘導(dǎo)的角膜炎小鼠模型中形成的真菌生物膜且不會引起對眼的顯著毒性。所述肽是水溶性的，并且在高壓蒸汽滅菌程序中是穩(wěn)定的。它們是用于治療真菌性角膜炎的有用的抗真菌劑。168386PCT-CN-ELLA序列表<110>新加坡科技研究局<120>肽和其用途<130>9869SG2451<160>27<170>PatentInversion3.5<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>n為1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>為陽離子氨基酸<400>1XaaXaaXaaXaa1<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>n為1.5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>為陽離子氨基酸<400>2XaaXaaXaaXaaXaaXaa15<210>3<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n為2<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>為陽離子氨基酸<400>3XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa15<210>4<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>n為2.5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>為陽離子氨基酸<400>4XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa1510<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>n為3<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>為陽離子氨基酸<400>5XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa1510<210>6<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>n為3.5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>為陽離子氨基酸<400>6XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa1510<210>7<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>n為4<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>為陽離子氨基酸<400>7XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa151015<210>8<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>n為4.5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>為陽離子氨基酸<400>8XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa151015XaaXaa<210>9<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>n為5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>為陽離子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>為疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>為陽離子氨基酸<400>9XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa151015XaaXaaXaaXaa20<210>10<211>6<212>PRT<213>人工序列<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