背景技術(shù)：

本發(fā)明涉及免疫學(xué)和疫苗學(xué)的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及用于提供病毒體的改善方法、包含病毒體的組合物以及其應(yīng)用。對(duì)抗含膜(包膜)病毒的疫苗主要由滅活的或活減毒的病毒，或它們的蛋白質(zhì)的制劑(例如，裂解病毒疫苗或亞單位制劑)組成。使用滅活的病毒和蛋白制劑的接種疫苗是比使用復(fù)制活減毒或重組病毒的接種疫苗更安全的，因?yàn)楹笳呖赡芡蛔兓蚧謴?fù)到野生型病毒。亞單位疫苗導(dǎo)致更少的局部和全身副作用并且具有以下明顯優(yōu)勢(shì)：它們可以制備自由細(xì)胞表達(dá)的重組病毒蛋白而不是制備自病毒，使得生產(chǎn)更安全并消除活病毒污染疫苗制劑的風(fēng)險(xiǎn)。然而，雖然活病毒的注射一般誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞和抗體免疫應(yīng)答，防止病毒的未來(lái)感染，非復(fù)制型疫苗如蛋白質(zhì)制劑，尤其是膜蛋白制劑，可能不能如此，其主要誘導(dǎo)抗體應(yīng)答。感染的細(xì)胞可以在它們的表面上的mhc-1分子上呈遞來(lái)自感染病原體的物質(zhì)，引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，如細(xì)胞毒性t細(xì)胞應(yīng)答。不在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的許多蛋白質(zhì)制劑將不會(huì)以這種方式被呈遞給免疫系統(tǒng)。活的或滅活的病毒還將優(yōu)先被免疫系統(tǒng)的特異性吞噬細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞所吸收，并且呈遞給免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞，觸發(fā)免疫應(yīng)答。這些吞噬細(xì)胞巡查身體，攝取病毒尺寸的顆粒，但它們不會(huì)有效地吸收純化的蛋白質(zhì)如來(lái)自裂解病毒或亞單位疫苗的那些。膜蛋白的具體問(wèn)題在于它們不溶于水。因此，為了成功呈遞給抗原呈遞細(xì)胞，這些蛋白質(zhì)需要某種形式的增溶，以允許它們用于疫苗。

已經(jīng)通過(guò)物理或化學(xué)方式進(jìn)行了許多嘗試來(lái)增強(qiáng)對(duì)亞單位或蛋白質(zhì)制劑的免疫應(yīng)答。從這些實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的最重要的原則是，在將由吞噬細(xì)胞有效地吸收的顆粒中需要結(jié)合病毒蛋白的多個(gè)拷貝。這些顆?？梢允遣《倔w樣顆粒、病毒體、免疫刺激復(fù)合物(iscom)、混合微團(tuán)(mixedmicelle)、蛋白體制劑或微粒載體上的蛋白質(zhì)。經(jīng)常地，這些顆粒還含有化學(xué)物質(zhì)(稱(chēng)為佐劑)，其意在刺激針對(duì)免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞上的特異性受體的免疫系統(tǒng)。

病毒體是一種特別有用的疫苗成分。病毒體是有包膜病毒的重組的膜。它們通常通過(guò)用去污劑或短鏈磷脂從有包膜病毒提取膜蛋白和脂質(zhì)，隨后從提取的脂質(zhì)和病毒膜蛋白除去該去污劑或短鏈磷脂來(lái)產(chǎn)生，事實(shí)上重組或重整環(huán)繞病毒核或核衣殼的特征脂質(zhì)雙層(包膜)(wo2004/071492,stegmannt.etal.,1987,emboj.6,2651-2659)。然而，病毒體可以基本組裝自每種膜內(nèi)在蛋白或外周膜蛋白、或結(jié)合于脂質(zhì)錨定的蛋白。病毒體的基本特征在于，它們是由免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞有效地吸收的尺寸的顆粒，以及它們密切模仿天然病毒包膜的組成、表面結(jié)構(gòu)和功能活性，尤其是膜融合活性?？梢詫⑵渌肿尤缰|(zhì)、佐劑或蛋白質(zhì)加入溶解的膜材料。然后通過(guò)除去去污劑或短鏈磷脂來(lái)重組膜，產(chǎn)生病毒體。在膜重組期間，添加的分子將包含在病毒體內(nèi)或整合在病毒體膜中。病毒體可以用作疫苗或用來(lái)將分子遞送進(jìn)入細(xì)胞。

流感病毒和塞姆利基森林病毒(sfv)是包膜病毒的兩種典型實(shí)例。包膜病毒一般攜帶特異性膜蛋白(“刺突”)，其是結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞所需要的。這些蛋白質(zhì)以亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象，稱(chēng)為“融合前形式”，存在于成熟病毒體的表面上。在病毒與細(xì)胞的結(jié)合以后，由這些病毒感染細(xì)胞的第一步驟是由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來(lái)吸收完整的病毒顆粒。然后由于在內(nèi)涵體的膜中存在的atp依賴(lài)性質(zhì)子泵的活躍，內(nèi)涵體小室變成弱酸性。由這些酸性條件(ph5-6)的觸發(fā)，病毒刺突蛋白經(jīng)歷構(gòu)象變化(從“融合前”到“融合后”構(gòu)象)，其驅(qū)動(dòng)病毒膜與內(nèi)涵體的膜的融合。作為這樣的融合的結(jié)果，病毒核衣殼和遺傳物質(zhì)(dna或rna)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，且基因組復(fù)制產(chǎn)生子代病毒。

發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中特別活性的病毒體已保持天然病毒的包膜蛋白的適當(dāng)功能，如膜融合、受體結(jié)合和其它活性。受體結(jié)合和膜融合活性的保存表明在病毒體膜上的病毒刺突蛋白是處于融合前形式，對(duì)于所述病毒體的完整免疫原性的表達(dá)是必須的。作為由于病毒體的膜融合活性的細(xì)胞質(zhì)遞送的結(jié)果，已證明來(lái)自病毒體蛋白的表位的mhc-1暴露，其導(dǎo)致保護(hù)性細(xì)胞毒性t細(xì)胞活性的誘導(dǎo)(bungeneretal.vaccine23(2005)1232-1241,bungeneretal.,antiviraltherapy:111(6):717-727)。因此，具有膜融合活性的病毒體可用作疫苗，其具有滅活的疫苗的安全性，同時(shí)提供具有活疫苗的刺激物代表的免疫系統(tǒng)。

在本領(lǐng)域中已知的是，在病毒體的膜中并入兩親性佐劑以進(jìn)一步改善病毒體疫苗制劑在病毒體的注射或鼻內(nèi)施加以后刺激免疫應(yīng)答的能力。見(jiàn)例如wo2004/110486，其中用去污劑或短鏈磷脂來(lái)溶解病毒，接著除去病毒核衣殼。此后，將溶解在相同去污劑或短鏈磷脂中的佐劑加入溶解的病毒膜以在病毒體中并入佐劑。然后去除去污劑或短鏈磷脂，導(dǎo)致病毒體的形成，其包括至少病毒膜蛋白和脂質(zhì)以及佐劑。已證明，以這種方式并入病毒體膜的兩親性佐劑被穩(wěn)定地整合在膜中(stegmann,tetal.vaccine2010；28(34):5543-50；wo2004/110486)并在臨床前試驗(yàn)中在用這些病毒體接種疫苗以后增強(qiáng)或改變免疫應(yīng)答(kamphuis,t.etal.plosone2012；7(5):e36812)。

然而，膜中的蛋白質(zhì)和佐劑濃度之間的比率在病毒體膜的形成時(shí)是固定的，這是因?yàn)樗鼈兙嬖谟谙嗤哪ぶ小４送?，雖然將佐劑并入膜雙層的兩個(gè)小葉，但僅存在于外小葉中的佐劑可用于與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上存在的受體相互作用。

抗原/佐劑比率深入影響接種疫苗以后的免疫應(yīng)答。例如，對(duì)于含有單磷?；|(zhì)a佐劑的呼吸道合胞病毒(rsv)病毒體，發(fā)現(xiàn)佐劑的閾值濃度能夠?qū)⒚庖邞?yīng)答從主要的th2反應(yīng)偏移到更平衡的th1/th2反應(yīng)(kamphuis,t.etal.plosone2012；7(5):e36812)。

為了獲得含有佐劑的疫苗的銷(xiāo)售許可(參見(jiàn)“emaguidelinesonadjuantsinvaccinesforhumanuse”:emea/chmp/veg/134716/2004)，需要證明抗原與佐劑的充分和一致的關(guān)聯(lián)，隨后是在臨床前試驗(yàn)中且然后在臨床試驗(yàn)中疫苗候選物的安全性評(píng)估。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果經(jīng)常不能完全預(yù)測(cè)疫苗在人中的效果。特別是，難以估計(jì)最佳的抗原/佐劑比率。雖然期望低佐劑濃度以最小化副作用，但佐劑需要以期望的方式來(lái)增強(qiáng)或改變免疫應(yīng)答，且在高佐劑濃度下其它效果，如耐受性或增加的反應(yīng)原性(即，疫苗能夠產(chǎn)生常見(jiàn)的、“預(yù)期的”不良反應(yīng)的性能，尤其是過(guò)度免疫反應(yīng)和相關(guān)的體征和綜合征)是可能的。因此，僅可以通過(guò)試錯(cuò)法來(lái)確定最佳的抗原/佐劑比率。此外，可能的是，對(duì)于不同組的患者，如老人或嬰兒，可能不同的比率是最佳的。對(duì)于用經(jīng)典佐劑配制的疫苗，如吸收到明礬(alum)上的抗原，在gmp(藥物物質(zhì)a)下生產(chǎn)抗原，發(fā)布用于臨床試驗(yàn)，然后其可以與gmp級(jí)的明礬混合(藥物物質(zhì)b)，以在臨床形成藥品，使得容易測(cè)試各種佐劑/抗原比率。然而，對(duì)于具有并入兩親性佐劑的病毒體，這種方法是不可能的，因?yàn)樵谀さ闹亟M時(shí)抗原和佐劑之間的比率已經(jīng)固定。

因此，使用目前可用的用于制備含佐劑病毒體的方法測(cè)試各種佐劑/抗原比率的唯一方式是產(chǎn)生具有不同的抗原/佐劑組合(每種制劑構(gòu)成一種藥物物質(zhì))的各種各樣的病毒體，以對(duì)每種制劑進(jìn)行所需的臨床前安全性和免疫原性測(cè)試，以發(fā)布每種制劑用于臨床試驗(yàn)，以及以分別單獨(dú)測(cè)試每種不同的制劑。顯然，這以非常大的因數(shù)倍增了這些試驗(yàn)的成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服這些問(wèn)題，本發(fā)明人試圖使含佐劑病毒體的臨床試驗(yàn)更容易。尤其是，他們旨在最小化臨床前安全性、免疫原性、發(fā)布、臨床試驗(yàn)等的單獨(dú)測(cè)試所需要的制劑的數(shù)目。進(jìn)一步的目標(biāo)是在保留免疫原性的同時(shí)最小化所使用的佐劑的量。

觀測(cè)到，可以通過(guò)適用用于制備含佐劑病毒體的常規(guī)方法來(lái)滿(mǎn)足至少一些這些目標(biāo)。更具體地，新方法包括預(yù)形成含有抗原而沒(méi)有佐劑的病毒體以及通過(guò)添加溶解在適宜溶劑中的兩親性佐劑。使溶解的佐劑與含有預(yù)形成的病毒體的水性組合物混合，使得佐劑溶劑與水混合，且佐劑整合入病毒體膜。因此，在病毒體形成以后，而不是在病毒體形成期間，在病毒體膜中包含兩親性佐劑。本發(fā)明的這種“兩步’”方法有助于具有不同的佐劑/抗原比率的基于病毒體的疫苗的配制并形成具有僅在膜的外小葉中并入佐劑的病毒體。出乎意料地，盡管(病毒)蛋白質(zhì)暴露于佐劑溶劑，但根據(jù)這種新的后插入程序所獲得的病毒體顯示類(lèi)似于傳統(tǒng)的并入方法的融合活性。

因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于制備含佐劑病毒體的方法，包括以下步驟：

(i)提供包含膜融合蛋白的非含佐劑病毒體的水性組合物；

(ii)將兩親性佐劑溶解于可以與水形成均勻混合物的藥用非水溶劑；以及

(iii)將所述佐劑溶液在所述水性病毒體組合物中稀釋以誘導(dǎo)佐劑插入病毒體膜的外小葉中，同時(shí)保存病毒體的膜融合活性。

對(duì)于包含含佐劑病毒體的疫苗的臨床前和臨床測(cè)試，本發(fā)明具有重要的優(yōu)點(diǎn)。預(yù)形成的病毒體組合物將因此形成“藥物物質(zhì)a”，而在溶劑中的佐劑是“藥物物質(zhì)b”。僅需要針對(duì)藥物物質(zhì)a和b的安全性和臨床測(cè)試。物質(zhì)a和b組合為具有各種佐劑/抗原比率的藥物產(chǎn)品可以在臨床進(jìn)行。

此外，已知佐劑會(huì)產(chǎn)生各種副作用，從注射部位處的疼痛到炎癥，到貝爾麻痹(lewis,d.jh.etal.,plosone20094(9):e6999)和發(fā)作性睡病(oflanagand.etal.plosone2014,19(17)pii20789)。因此，重要的是，并入最低有效濃度的佐劑。通過(guò)在形成病毒體膜的常規(guī)一步方法中將佐劑整合到病毒體膜中，來(lái)將佐劑并入雙層的兩個(gè)小葉中。然而，僅一半存在于膜的外小葉中的佐劑可以接觸免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，因而可以貢獻(xiàn)于不期望的副作用的濃度是有效濃度的兩倍。相反，在本發(fā)明的適用預(yù)形成的病毒體膜的方法中，僅在膜的外小葉中插入佐劑，使得其全部可用于與免疫系統(tǒng)的相互作用。與在兩個(gè)小葉中具有佐劑的常規(guī)病毒體相比，這使得降低一半的有效佐劑濃度，從而潛在地限制副作用。

在本領(lǐng)域中沒(méi)有公開(kāi)或啟示將兩親性佐劑特異性地后插入病毒體雙層的外小葉。例如，反之wo2007/099387教導(dǎo)了免疫刺激效應(yīng)，可以通過(guò)關(guān)聯(lián)囊泡與至少一種佐劑，來(lái)進(jìn)一步增加其病毒體樣囊泡，其只是一般地教導(dǎo)了可以將佐劑包圍在所述囊泡內(nèi)和/或并入在所述囊泡的脂雙層中，和/或與所述囊泡自由結(jié)合。沒(méi)有提及或啟示在雙層的外小葉中后插入佐劑。

在第一方面，本發(fā)明提供了用于將兩親性佐劑引入預(yù)形成的病毒體的膜中的方法。在第二方面，本發(fā)明提供了僅在病毒體膜的外小葉中存在佐劑的病毒體。

術(shù)語(yǔ)“病毒體”是指含有包埋在脂質(zhì)膜中的病毒包膜蛋白的脂質(zhì)體。病毒體是體外形成的并且不含有病毒核蛋白。通常，病毒體具有約150nm的平均直徑的球形、單層囊泡。與脂質(zhì)體相反，病毒體通常含有功能性病毒包膜糖蛋白，如流感病毒血凝素(ha)、神經(jīng)氨酸酶(na)、或基質(zhì)蛋白2(m2)，其插入在磷脂雙層膜中。為了產(chǎn)生這些病毒體，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法首先產(chǎn)生不含佐劑的普通病毒體的水懸浮液。制備的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。用于本發(fā)明的適宜的程序例如描述于wo2004/045582或ep0538437。根據(jù)一種實(shí)施方式，病毒體可以獲得自病毒體囊泡本身，或獲得自產(chǎn)生于病毒體囊泡與脂質(zhì)體囊泡的融合的囊泡。

可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員的任何已知方法，如由bronetal.,methodsenzymol.220:313-331(1993)描述的來(lái)制備病毒體囊泡。在一種實(shí)施方式中，制備病毒體的步驟包括包膜病毒的功能重組，優(yōu)選選自由以下組成的組的病毒：逆轉(zhuǎn)錄病毒科、風(fēng)疹病毒、副粘病毒科、黃病毒科、皰疹病毒科、布尼亞病毒科、沙粒病毒科、漢坦病毒科、桿狀病毒科、冠狀病毒科、乳多空病毒科、彈狀病毒科、甲病毒科、動(dòng)脈炎病毒科、絲狀病毒科和痘病毒科。通常，包膜病毒功能重組為病毒體包括使包膜病毒接觸含有短鏈磷脂或去污劑的溶液，使得所述病毒的病毒包膜溶解，進(jìn)一步包括從所述溶液去除短鏈磷脂或去污劑，使得形成功能重組的病毒包膜。優(yōu)選地，通過(guò)透析、過(guò)濾、或吸收到疏水珠上，來(lái)去除磷脂或去污劑。優(yōu)選的疏水珠包括由聚苯乙烯二乙烯基苯組成的珠。用于制備病毒體的有用的脂質(zhì)是具有大于0.1mm，優(yōu)選大于0.3mm，更優(yōu)選大于1mm的臨界微團(tuán)濃度(cmc)的短鏈磷脂。例如,獲得非常好的結(jié)果，其中磷脂是磷脂酰膽堿，優(yōu)選1,2-二庚?；?sn-磷脂酰膽堿或1,2-二己?；?sn-磷脂酰膽堿。還參見(jiàn)wo2004/071492。適宜的去污劑也是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選地，去污劑是非離子去污劑如八乙二醇單(正十二烷基)醚。

在具體的實(shí)施方式中，在使用例如八乙二醇單(正十二烷基)醚(c12e8)來(lái)溶解完整的流感病毒，沉降核衣殼(病毒糖蛋白和脂質(zhì)將留在上清液中)，以及使用疏水性樹(shù)脂(bio-beadssm2)來(lái)除去在上清液中的去污劑以后，可以重組由原始的病毒膜脂質(zhì)和刺突糖蛋白重組病毒體(stegmannetal.,traffic1:598-604,1987)?？梢越柚谟梅请x子去污劑八乙二醇單十二烷基醚溶解的那些病毒的等量的蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行含有來(lái)自不同病毒株的ha的病毒體的制備。

在使用bio-beadssm2來(lái)除去去污劑以后，可以形成含有不同類(lèi)型的融合蛋白的病毒體。根據(jù)一種實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的病毒體樣囊泡可以獲得自病毒體囊泡與脂質(zhì)體囊泡的融合。

因此，根據(jù)一種實(shí)施方式，本發(fā)明的病毒體樣囊泡可以包含病毒體脂質(zhì)和脂質(zhì)體脂質(zhì)。

病毒體膜優(yōu)選包含：(a)脂雙層；(b)膜蛋白；以及(c)可選的另外的抗原。優(yōu)選地，膜蛋白是病毒膜融合蛋白。優(yōu)選地，脂雙層具有脂質(zhì)成分，其與如由融合蛋白誘導(dǎo)的病毒膜與病毒的自然宿主的宿主細(xì)胞的融合相容。優(yōu)選地，脂質(zhì)成分與融合的最佳ph下的融合相容。在如本文提供的方法中，各種包膜病毒中的任何一種可以用于病毒體的生產(chǎn)，諸如，逆轉(zhuǎn)錄病毒科如人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv)；疹病毒；副粘病毒科如副流感病毒、麻疹、腮腺炎、呼吸道合胞病毒、人類(lèi)偏肺病毒；黃病毒科如黃熱病毒、登革病毒、丙型肝炎病毒(hcv)、日本腦炎病毒(jev)、蜱傳腦炎、圣路易腦炎或西尼羅病毒；皰疹病毒科如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、eb病毒(epstein-barrvirus)；布尼亞病毒科；沙粒病毒科；漢坦病毒科如漢坦(hantaan)；冠狀病毒科；乳多空病毒科如人乳頭狀瘤病毒；彈狀病毒科如狂犬病病毒；冠狀病毒科如人冠狀病毒；甲病毒科；動(dòng)脈炎病毒科；絲狀病毒科如埃博拉病毒；沙粒病毒科；痘病毒科如天花病毒、或非洲豬瘟病毒。

病毒的融合蛋白在本文中被理解為是指病毒，通常是包膜病毒的膜內(nèi)在蛋白，如果表達(dá)在適宜的細(xì)胞的表面上，在適當(dāng)?shù)膒h下，其可誘導(dǎo)細(xì)胞與用于病毒的自然宿主的細(xì)胞的融合。用于并入重組的病毒膜的病毒融合蛋白的實(shí)例包括塞姆利基森林病毒e1蛋白、流感病毒血凝素(ha)蛋白、hivgp120/gp41蛋白、副粘病毒的f蛋白。還包含融合蛋白的(基因修飾的)變體，其可以介導(dǎo)與靶細(xì)胞的融合。可以區(qū)分由病毒融合蛋白誘導(dǎo)的兩種類(lèi)型的融合。第一種類(lèi)型的融合，如例如，由hivgp120/gp41蛋白或副粘病毒f蛋白誘導(dǎo)，在中性ph下發(fā)生，通常在靶向宿主細(xì)胞的表面上。第二種類(lèi)型的融合，如例如，由流感病毒血凝素(ha)蛋白誘導(dǎo)，在較低的ph(5.0–6.5)下，在內(nèi)在化時(shí)發(fā)生自宿主細(xì)胞的內(nèi)涵體小室內(nèi)。兩種類(lèi)型的融合特別包括在本發(fā)明中。

因此本發(fā)明的病毒體與宿主細(xì)胞融合的能力取決于適當(dāng)?shù)牟《救诤系鞍椎拇嬖?。然而，該能力進(jìn)一步取決于重組的病毒膜的雙層的脂質(zhì)成分，因?yàn)橐呀?jīng)在本領(lǐng)域中描述的由某些合成脂質(zhì)和病毒融合蛋白組成的病毒體不能融合。因此，優(yōu)選選擇病毒體的脂質(zhì)成分，使得在適當(dāng)?shù)膒h下，膜能夠與合適的宿主細(xì)胞融合。提供具有融合活性的病毒體的一種優(yōu)選的脂質(zhì)成分是包含病毒的天然脂質(zhì)的脂質(zhì)成分。術(shù)語(yǔ)“病毒的天然脂質(zhì)”在本文中被理解為存在于生長(zhǎng)在細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)或植物細(xì)胞，或生長(zhǎng)在胚胎卵上的病毒的膜中的那些脂質(zhì)。如與合成脂質(zhì)相反，病毒的天然脂質(zhì)優(yōu)選獲得自或分離自如此生長(zhǎng)的病毒顆粒。

然而，本發(fā)明的功能重組的病毒膜可以包含除病毒脂質(zhì)之外的來(lái)自其它來(lái)源的純化的脂質(zhì)，例如純化或合成的脂質(zhì)?？梢栽谥苽溥^(guò)程中將其它脂質(zhì)加入病毒體膜。當(dāng)添加與病毒源的那些脂質(zhì)類(lèi)似的脂質(zhì)或非常相似于病毒包膜的脂質(zhì)成分的脂質(zhì)混合物時(shí)，通常最佳地保持病毒體的融合活性。因此，符合本發(fā)明，可以在所述病毒體膜中包含范圍廣泛的脂質(zhì)。脂質(zhì)的組包含中性和帶電荷的磷脂、類(lèi)固醇衍生的脂質(zhì)、中性和帶電荷的合成脂質(zhì)。因此，用于提供具有融合活性的病毒體的脂質(zhì)成分優(yōu)選是獲得自或可獲得自天然病毒膜的成分。因此，用于本發(fā)明的脂質(zhì)成分包含完全由病毒的天然脂質(zhì)組成的成分、由病毒的天然脂質(zhì)組成并補(bǔ)充有來(lái)自其它來(lái)源的脂質(zhì)的成分、以及由來(lái)自各種來(lái)源的脂質(zhì)組成的成分，其模仿天然病毒膜的脂質(zhì)成分。

這些脂質(zhì)可以包含膽固醇和磷脂如磷脂酰膽堿(pc)、鞘磷脂(spm)、磷脂酰乙醇胺(pe)、和磷脂酰絲氨酸(ps)。然而，還可以添加其它磷脂。這些包括但不限于磷脂酰甘油(pg)、磷脂酸(pa)、心磷脂(cl)、和磷脂酰肌醇(pi)，其具有變化的脂肪?；M成且具有天然和/或(半)合成的源，以及磷酸二鯨蠟酯。還可以添加神經(jīng)酰胺和各種糖脂，如腦苷脂或神經(jīng)節(jié)苷脂。

本發(fā)明的病毒體優(yōu)選包含選自由陽(yáng)離子脂質(zhì)、合成脂質(zhì)、糖脂、磷脂、固醇、以及它們的衍生物組成的組的脂質(zhì)。磷脂優(yōu)選包含磷脂酰膽堿、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、心磷脂、和磷脂酰肌醇，具有變化的脂肪?；M成。陽(yáng)離子脂質(zhì)優(yōu)選選自由以下組成的組：dotma(n-[(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨)、dotap(n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨)、dodac(n,n-二油烯基-n,n,-二甲基氯化銨)、ddab(雙十二烷基二甲基溴化銨)、tc-chol(膽固醇n-(三甲基氨乙基)氨基甲酸酯氯化物)、dc-chol(膽固醇n-(二甲基氨乙基)氨基甲酸酯氯化物)、或其它陽(yáng)離子膽固醇衍生物、和硬脂胺或其它脂肪族胺、dppe(二棕櫚?；字Ｒ掖及?、dogs(二油?；?甘油基-琥珀酸酯)、dospa(2,3-二油酰氧基-n-[2(精胺酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-三氟乙酸丙銨)、dosper(1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基精胺酰)丙酰胺)、thdob(n,n,n',n'-四甲基-n,n'-二(2-羥基乙基)-2,3,-二油酰氧基-1,4-丁二銨碘)、dopa(二油酰基-sn-甘油基-磷酸酯)、dotp(對(duì)苯二甲酸二辛酯)、dosc(二油酰基-琥珀?；?甘油)、dotb(二油?；?e-(4'-三甲基氨基)-丁?；?sn-甘油)、dopc(二油酰基-sn-甘油基-磷脂酰膽堿)、dope(二油?；?sn-甘油基-磷脂酰乙醇胺)等。特別優(yōu)選的是，陽(yáng)離子脂質(zhì)選自陽(yáng)離子膽固醇衍生物如tc-chol(膽固醇n-(三甲基氨乙基)氨基甲酸酯)或dc-chol(膽固醇n-(二甲基氨乙基)氨基甲酸酯)。它們可以被配制為與pc(磷脂酰膽堿)的混合物中的小單層脂質(zhì)體。本發(fā)明的病毒體可以?xún)?yōu)選包含源自卵的pc，以及更優(yōu)選，dopc(二油?；?sn-甘油基-磷脂酰膽堿)、dope(二油?；?sn-甘油基-磷脂酰乙醇胺)?？梢圆⑷氡景l(fā)明的的病毒體的膽固醇或甾醇衍生物的實(shí)例包括：膽固醇半琥珀酸酯、植物甾醇如羊毛甾醇、麥角固醇、以及維生素d和維生素d相關(guān)的化合物。

為了將佐劑引入預(yù)形成的不含佐劑的病毒體的外小葉，將佐劑溶解于可以與水混合的非水溶劑。然后將該溶液加入不含佐劑的病毒體的水懸浮液。溶劑的稀釋使佐劑不溶，并完成自發(fā)整合進(jìn)入病毒體膜。

技術(shù)人員將能夠選擇能夠與水形成均勻混合物的藥用非水溶劑，其可以被描述為僅一相的溶液。例如，其選自在本領(lǐng)域中稱(chēng)為“藥品中的殘留溶劑”的溶劑的組。這些被定義為用于藥物物質(zhì)或賦形劑的制造或藥品的制備的，或者在藥物物質(zhì)或賦形劑的制造或藥品的制備中產(chǎn)生的有機(jī)揮發(fā)性化學(xué)品。表述“能夠與水形成均勻混合物”意在表明，在使用的特定條件下，佐劑溶劑與病毒體成分的水相混合到足以使溶解在其中的佐劑接觸病毒體并誘導(dǎo)在病毒體膜的外小葉中佐劑的插入的程度。適宜的溶劑有效地溶解佐劑并且是水可混合的。優(yōu)選地，它們不損害病毒體，特別是在這些中存在的膜融合蛋白。更優(yōu)選地，溶劑是藥用和無(wú)毒的。優(yōu)選的溶劑是共沸溶劑、醇和酯。

相比與其稀釋進(jìn)入的水性病毒體組合物的體積，溶解的佐劑的體積通常較小。例如，佐劑溶液被稀釋至少5倍，優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少20倍。

因此，佐劑溶劑的水溶性可以相對(duì)較低。在一種實(shí)施方式中，在20℃下，非水佐劑溶劑具有至少5g/100ml的在水中的溶解度。優(yōu)選地，在20℃下在水中的溶解度是至少10g/100ml，更優(yōu)選至少20g/100ml。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，佐劑溶劑是水可混溶的溶劑，即，以所有比例與水混合，形成均勻溶液的溶劑。

在一種實(shí)施方式中，佐劑溶劑選自由乙腈、2-丁醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸、甲酸、甲醇、乙醇、dmso、dmf、正丙醇、異丙醇、2-甲基-1-丙醇和thf、或它們的任何混合物組成的組。為了確保保持病毒體的融合活性，所選的佐劑溶劑應(yīng)至少部分地保存膜融合蛋白的功能。融合蛋白對(duì)溶劑的負(fù)面影響的易感性將取決于融合蛋白的特定類(lèi)型。一般來(lái)說(shuō)，在低ph下誘導(dǎo)融合的融合蛋白對(duì)溶劑如dmso或dmf不是非常敏感的，但對(duì)酸性溶劑是非常敏感的，而在中性ph下起作用的融合蛋白，如副粘病毒f蛋白，對(duì)溶劑的ph不敏感得多。技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的方法將能夠測(cè)試和評(píng)估給定的非水溶劑對(duì)融合蛋白的影響。例如，在無(wú)細(xì)胞的融合試驗(yàn)中，利用脂質(zhì)體靶，可以針對(duì)對(duì)給定病毒體制劑的融合活性的影響篩選候選溶劑的組?？梢酝ㄟ^(guò)體外融合測(cè)量，例如通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)譯(fret)，來(lái)監(jiān)測(cè)融合(strucketal.(1981)biochemistry20:4093)。當(dāng)佐劑溶劑是dmso、乙醇或dmf時(shí)，可以獲得良好的結(jié)果。

如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指當(dāng)連同一種或多種抗原一起注射時(shí)，非特異性地增強(qiáng)對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。取決于佐劑的性質(zhì)，其可以促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答或兩種的混合。因?yàn)槊庖邞?yīng)答的增強(qiáng)是非特異性的，所以在本領(lǐng)域中很好理解的是，相同的佐劑可以連同不同的抗原一起用于促進(jìn)針對(duì)不同靶的應(yīng)答，例如，連同來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的抗原一起，用于促進(jìn)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫性，或連同源自腫瘤的抗原一起用來(lái)促進(jìn)針對(duì)該特定種類(lèi)的腫瘤的免疫性。佐劑在本文中旨在包括當(dāng)連同抗原一起用于使人或動(dòng)物免疫時(shí)，刺激免疫系統(tǒng)，從而影響、引發(fā)、增強(qiáng)或促進(jìn)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)或化合物，優(yōu)選沒(méi)有產(chǎn)生針對(duì)佐劑本身的特異性免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)“兩親性佐劑”旨在包括任何佐劑，包括化合物如脂肽、單磷酰脂質(zhì)a和它們的衍生物和類(lèi)似物，以及糖脂，其具有包埋的疏水膜和環(huán)境導(dǎo)向的極性(頭部基團(tuán))部分，且其可以在水中與脂雙層囊泡或微團(tuán)關(guān)聯(lián)，或更優(yōu)選地整合入其中。優(yōu)選地，融合蛋白、兩親性佐劑以及優(yōu)選地可選的另外的與脂雙層的疏水性?xún)?nèi)部相互作用的抗原，即，通過(guò)與雙層的脂質(zhì)和/或彼此的疏水性相互作用，關(guān)聯(lián)、整合進(jìn)入、和/或包埋在病毒膜的雙層中。

本發(fā)明的病毒體膜優(yōu)選是功能性病毒體，其包含脂質(zhì)、兩親性佐劑、病毒融合蛋白和一種或多種抗原，其中兩親性佐劑、脂質(zhì)、病毒融合蛋白和抗原主要通過(guò)疏水性相互作用來(lái)相互作用，其中兩親性佐劑的疏水性部分優(yōu)選形成脂質(zhì)雙層膜的組成部分，該脂質(zhì)雙層膜進(jìn)一步含有融合蛋白、抗原和脂質(zhì)。功能重組是指，重組的膜具有膜融合活性。優(yōu)選的重組的病毒膜具有囊泡的形式。

該術(shù)語(yǔ)還包括穩(wěn)定地并入脂雙層(包含病毒的天然脂質(zhì))的任何兩親性佐劑，其中其疏水性部分接觸內(nèi)部，雙層膜的疏水區(qū)，且其極性頭部基團(tuán)部分朝向外部，膜的極性表面。然而，本發(fā)明特別不排除具有較不顯著的兩親性，即沒(méi)有或僅具有弱極性的頭部基團(tuán)部分，但可以關(guān)聯(lián)、或整合入脂雙層的較為疏水性的佐劑囊泡。

佐劑在本文中旨在包括當(dāng)結(jié)合抗原一起使用以使人或動(dòng)物免疫時(shí)，刺激免疫系統(tǒng)，從而引發(fā)、增強(qiáng)或促進(jìn)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，優(yōu)選沒(méi)有生成對(duì)佐劑本身的特異性免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)或化合物。優(yōu)選的佐劑將免疫應(yīng)答從th2型應(yīng)答偏離到th1型應(yīng)答。相比與在相同條件下但在沒(méi)有佐劑的情況下針對(duì)抗原生成的免疫應(yīng)答，其它優(yōu)選的佐劑會(huì)增強(qiáng)針對(duì)給定抗原的免疫應(yīng)答至少1.5、2、2.5、5、10或20的系數(shù)。其它優(yōu)選的佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間。用于測(cè)定相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照組，在一組動(dòng)物或人中由佐劑產(chǎn)生的針對(duì)給定抗原的免疫應(yīng)答的統(tǒng)計(jì)平均增強(qiáng)的測(cè)試是在本領(lǐng)域中可用的。佐劑優(yōu)選能夠影響或增強(qiáng)針對(duì)至少兩種不同抗原的免疫應(yīng)答。待并入本發(fā)明的功能性病毒體中的佐劑優(yōu)選是兩親性佐劑。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在病毒體中存在的兩親性佐劑是藥用以用于人類(lèi)。本發(fā)明的兩親性佐劑優(yōu)選地不共價(jià)連接于抗原，但一起存在于重組的膜的脂雙層中?？乖妥魟┎还矁r(jià)連接的事實(shí)確保了抗原的加工和其表位到免疫系統(tǒng)的呈遞基本上相同于單獨(dú)的天然蛋白，確保在天然病原體上存在的蛋白質(zhì)的良好識(shí)別。另一方面，抗原和佐劑與脂雙層(以及彼此)的疏水性相互作用使得佐劑和抗原分布在在制劑中的病毒體上，由此制劑中的大多數(shù)膜囊泡在單個(gè)囊泡中含有抗原和佐劑兩者，更優(yōu)選至少60、70、80、90、或95％的囊泡含有抗原和佐劑兩者。在單個(gè)膜或囊泡中抗原和佐劑的組合使得抗原遞送到由佐劑活化的抗原呈遞細(xì)胞，從而增加病毒體的治療和/或預(yù)防功效。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述兩親性佐劑由在抗原呈遞細(xì)胞上存在的toll樣受體(tlr)來(lái)識(shí)別?？商鎿Q地，兩親性佐劑可靶向其它受體。由tlr識(shí)別的各種化合物是本領(lǐng)域已知的并且包括例如脂肽、單磷酰脂質(zhì)a和單磷酰脂質(zhì)a的衍生物或合成或半合成類(lèi)似物、脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸、脂蛋白(來(lái)自支原體、分枝桿菌或螺旋體)、雙鏈rna(聚i:c)、非甲基化dna、脂阿拉伯甘露聚糖、鞭毛蛋白、含cpg的dna、和咪唑并喹啉。這樣的識(shí)別tlr的佐劑可以是兩親性佐劑本身，或可替換地它們可以例如通過(guò)疏水性化合物(見(jiàn)下文)與極性tlr配體的結(jié)合被修飾成兩親性佐劑。優(yōu)選的兩親性佐劑包括單磷酰脂質(zhì)a及其衍生物和脂肽。

在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的病毒體的特征在于存在合成佐劑，其選自phad(磷酸化六酰基二糖)和其3-o-去?；苌?、3-d-phad。在本領(lǐng)域中兩者均稱(chēng)為合成tlr-4激動(dòng)劑。phad在本領(lǐng)域中還稱(chēng)為吡喃葡糖苷脂質(zhì)a、或gla。見(jiàn)lousada-dietrichetal.,,vaccine.2011apr12；29(17):3284-92。在一種實(shí)施方式中，病毒體含有phad，其具有以下結(jié)構(gòu)(標(biāo)號(hào)14表明在每個(gè)?；溨刑荚拥目倲?shù))：

在另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，病毒體含有3-d-phad，其具有以下結(jié)構(gòu)：

在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述兩親性佐劑是糖脂。用作兩親性佐劑的優(yōu)選的糖脂具有佐劑活性并且是藥用以用于人類(lèi)。糖脂是共價(jià)連接于一種或多種糖的脂質(zhì)(或其它疏水性化合物)。示例性的糖脂佐劑包括α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺、磷脂酰肌醇甘露糖苷、內(nèi)毒素脂多糖的衍生物以及它們的衍生物。在高度優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的病毒體，其中糖脂是α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺或磷脂酰肌醇甘露糖苷。術(shù)語(yǔ)“α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺”和“磷脂酰肌醇甘露糖苷”旨在包括任何一種的任何衍生物。具有佐劑活性并且可用于本發(fā)明的上下文中的這些分子的衍生物例如分別描述于us5,936,076和us4,542,212中。用于本發(fā)明的其它適宜的糖脂佐劑包括例如革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素脂多糖(lps)的修飾形式，其具有l(wèi)ps的脂質(zhì)a部分的降低的毒性，但保留(部分的)佐劑活性，如可以獲自基因修飾的革蘭氏陰性病原體以及如在wo02/09746中評(píng)述的。

在本發(fā)明中用作兩親性佐劑的修飾的lps優(yōu)選具有帶有降低的毒性的修飾的脂質(zhì)a部分。修飾的lps的毒性?xún)?yōu)選小于相應(yīng)的野生型lps的毒性，更優(yōu)選地修飾的lps的毒性小于野生型lps的毒性的90、80、60、40、20、10、5、2、1、0.5或0.2％?？梢砸员绢I(lǐng)域已知的任何合適的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定野生型和各種具有降低的毒性的修飾的lps的毒性。另一方面，具有降低的毒性的修飾的lps應(yīng)該仍然具有足夠的免疫刺激活性，即佐劑活性。具有降低的毒性的修飾的lps優(yōu)選具有相應(yīng)的野生型lps的免疫刺激活性的至少10、20、40、80、90或100％。免疫刺激活性可以在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中體內(nèi)確定(如上所述的)，或體外確定，例如通過(guò)確定借助于待測(cè)試的lps的溫育所刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，該測(cè)試是通過(guò)測(cè)量lps刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞的至少一種細(xì)胞因子(例如il-12、il-10、tnf-α、il-6和il-1-β的一種)的生產(chǎn)，或通過(guò)測(cè)量lps刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞上至少一種共刺激分子(例如cd40或cd86)的表達(dá)。

在本發(fā)明的另一方面，在根據(jù)本發(fā)明的病毒體中存在的兩親性佐劑是肽，優(yōu)選兩親性肽。用作兩親性佐劑的優(yōu)選肽具有佐劑活性并且是藥用以用于人類(lèi)?？捎猛ㄟ^(guò)將它們(共價(jià))連接于適宜的疏水性化合物(見(jiàn)上文)，使具有佐劑活性的肽，尤其是極性肽，呈現(xiàn)為兩親性佐劑?？商鎿Q地，兩親性肽可以包含氨基酸的疏水性段如下文所述的跨膜序列。優(yōu)選的肽包含來(lái)自notch配體jagged-1的序列(見(jiàn)weijzenetal.,2002；ngenbank登錄號(hào)aac52020)或來(lái)自金黃色葡萄球菌蛋白a的序列。具有來(lái)自jagged-1或蛋白a的序列的肽優(yōu)選共價(jià)連接于適宜的疏水性化合物(見(jiàn)上文)和/或包含跨膜序列(見(jiàn)下文)。突出自脂雙層的源自jagged-1或蛋白a的肽的(極性)部分優(yōu)選包含不多于3、4、5、6、7、或8個(gè)氨基酸。

本發(fā)明的病毒體包含融合蛋白以及可選的其它抗原。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，僅包含病毒融合蛋白并且沒(méi)有另外的抗原的病毒體是本發(fā)明的一部分，在這種情況下，除其作為融合蛋白的功能之外，病毒融合蛋白還具有作為抗原的功能。另一方面，除病毒融合蛋白之外，病毒體因此可以包含一種或多種其它抗原。因此，在一種實(shí)施方式中，病毒體包含至少一種另外的抗原，優(yōu)選腫瘤抗原，或源自病毒、寄生物、真菌或細(xì)菌的抗原。

根據(jù)本發(fā)明的重組的病毒膜的一部分的抗原優(yōu)選具有疏水性部分，其能夠插入重組的病毒膜囊泡的脂雙層膜。許多致病實(shí)體如病毒、細(xì)菌、酵母和寄生物，在它們的衣殼、細(xì)胞壁或膜中，攜帶誘發(fā)在宿主中的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)。具有疏水性成分，如例如跨膜區(qū)段，以及適合作為根據(jù)本發(fā)明的重組的病毒膜的一部分的抗原的實(shí)例是在病原體的膜(在病毒的情況下還稱(chēng)為包膜)中存在的蛋白質(zhì)。因此，優(yōu)選地，在本發(fā)明的重組的病毒膜中存在的抗原是膜內(nèi)在蛋白。在本發(fā)明的病毒體中的抗原蛋白以與它們出現(xiàn)在病毒或細(xì)胞膜上同樣的方式取向，但當(dāng)存在于膜脂雙層中時(shí)，可以呈遞通常部分地或至少暫時(shí)隱藏的表位。由這些抗原呈遞病毒體的免疫系統(tǒng)的刺激可能是由于通過(guò)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的它們的特異性識(shí)別、它們的具體特性、蛋白質(zhì)的呈遞、和隱藏表位的露出的組合。優(yōu)選地，在本發(fā)明的病毒體中使用的抗原蛋白包含一個(gè)或多個(gè)保護(hù)性表位，即，能夠在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)免疫應(yīng)答的表位，該免疫應(yīng)答提供保護(hù)以免受抗原源自其的病原體的感染，或提供針對(duì)表達(dá)抗原的腫瘤的保護(hù)。

在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述抗原源自病毒、寄生物、真菌或細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的病毒體的形成可以應(yīng)用和采用的抗原可以源自各種各樣的病毒，這些病毒的非限制性實(shí)例是：逆轉(zhuǎn)錄病毒科如人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv)；風(fēng)疹病毒；副粘病毒科如副流感病毒、麻疹、腮腺炎、呼吸道合胞病毒(rsv)、人偏肺病毒；黃病毒科如黃熱病毒、登革病毒、丙型肝炎病毒(hcv)、日本腦炎病毒(jev)、蜱傳腦炎、圣路易腦炎或西尼羅病毒；皰疹病毒科如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、eb病毒；布尼亞病毒科；沙粒病毒科；漢坦病毒科如漢坦；冠狀病毒科；乳多空病毒科如人乳頭狀瘤病毒；彈狀病毒科如狂犬病病毒；冠狀病毒科如人冠狀病毒；甲病毒科、動(dòng)脈炎病毒科、絲狀病毒科如埃博拉病毒、沙粒病毒科、痘病毒科如天花病毒、以及非洲豬瘟病毒。特別優(yōu)選的是其中所述抗原源自流感病毒或rsv的病毒體。來(lái)自流感病毒的可以用于本發(fā)明的病毒體的蛋白質(zhì)優(yōu)選是血凝素(ha)蛋白、神經(jīng)氨酸酶(na)蛋白和/或m2蛋白(單獨(dú)或組合地)。來(lái)自rsv的可以用于本發(fā)明的病毒體的蛋白質(zhì)是融合(f)、糖蛋白(g)和/或基質(zhì)(m)蛋白。

同樣，這些抗原可以源自致病細(xì)菌、真菌(包括酵母)、或寄生物。這樣的抗原包括細(xì)菌抗原例如螺旋桿菌屬，如幽門(mén)螺旋桿菌，奈瑟氏球菌屬，如腦膜炎奈氏球菌，嗜血菌屬，如流感嗜血菌，博德特氏菌屬，如百日咳博德特氏氏菌，衣原體屬，鏈球菌屬，如血清型a族鏈球菌，弧菌屬，如霍亂弧菌，革蘭氏陰性腸道病原體，包括例如沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬、彎曲桿菌屬和埃希氏菌屬，以及來(lái)自引起炭疽病、麻風(fēng)、結(jié)核病、白喉、萊姆病、梅毒、傷寒熱、和淋病的細(xì)菌的抗原。來(lái)自寄生物的抗原包括例如來(lái)自原生動(dòng)物，如牛巴貝蟲(chóng)(babeosisbovis)、瘧原蟲(chóng)屬、利什曼原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、和錐蟲(chóng)屬，如克氏錐蟲(chóng)的抗原。真菌抗原可以包括來(lái)自真菌如曲霉屬，白色念珠菌，隱球菌屬，如例如新型隱球菌，和莢膜組織胞漿菌的抗原。

雖然接種疫苗通常應(yīng)用于針對(duì)病原體的預(yù)防性保護(hù)或用于在致病性感染以后的疾病治療，但本領(lǐng)域技術(shù)人員了解疫苗用于腫瘤治療的應(yīng)用。此外，發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的腫瘤特異性蛋白是可以由人或人源化抗體靶向的適當(dāng)?shù)膶?shí)體。這樣的腫瘤特異性蛋白也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。許多腫瘤特異性抗原是本領(lǐng)域已知的。因此，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含腫瘤特異性抗原的病毒體。適宜的腫瘤抗原包括例如癌胚抗原、前列腺特異性膜抗原、截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(egrf)、thomsen-friedenreich(t)抗原、gm-2和gd-2神經(jīng)節(jié)苷脂、ep-cam、粘蛋白-1、上皮糖蛋白-2、和結(jié)腸特異性抗原。

來(lái)自這些病原體的優(yōu)選的抗原是膜內(nèi)在蛋白。然而，還可以修飾非膜蛋白抗原或其含有保護(hù)性表位的部分用于本發(fā)明，將它們?nèi)诤嫌诳缒ば蛄?。因此，在一種實(shí)施方式中，抗原是膜內(nèi)在蛋白或附接至膜錨定部分的抗原。例如，可以將抗原附接至跨膜域或膜錨定氨基酸序列。跨膜序列或膜錨定序列是本領(lǐng)域公知的并且基于哺乳動(dòng)物跨膜分子的遺傳結(jié)構(gòu)?？缒ば蛄型ǔＳ杉s10-30，通常約20個(gè)氨基酸的段組成，其大部分具有疏水性側(cè)鏈?？缒ば蛄幸阎獮楦鞣N各樣的蛋白質(zhì)并且可以使用這些中的任何一種。用于本發(fā)明的膜錨定序列的實(shí)例包括例如源自cd8、icam-2、il-8r、cd4和lfa-1的那些。優(yōu)選地，跨膜序列源自自然存在于病毒膜中的病毒膜內(nèi)在蛋白。其實(shí)例包括人呼吸道合胞病毒(rsv)糖蛋白g的跨膜區(qū)(例如氨基酸38至63)或流感病毒神經(jīng)氨酸酶的跨膜區(qū)(例如氨基酸7至27)。疏水性相互作用來(lái)自在水性環(huán)境中存在的疏水性物質(zhì)之間的非共價(jià)、非靜電吸引力。在一種實(shí)施方式中，膜錨定部分是脂質(zhì)部分，優(yōu)選磷脂或?；?。因此，進(jìn)一步優(yōu)選的抗原是共價(jià)連接于疏水性物質(zhì)如磷脂或?；湥瑥亩试S它們并入病毒體膜的可溶性蛋白或肽。

本發(fā)明還提供了通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的新型“后插入’”方法可獲得的含佐劑病毒體。這樣的含佐劑病毒體尤其特征在于，佐劑是兩親性佐劑，其基本上局限于病毒體膜的外小葉。優(yōu)選地，含佐劑病毒體包含本文以上所描述的兩親性佐劑的一種或多種。特別優(yōu)選的病毒體是源自包膜病毒的那些，優(yōu)選選自由逆轉(zhuǎn)錄病毒科、風(fēng)疹病毒、副粘病毒科、黃病毒科、皰疹病毒科、布尼亞病毒科、沙粒病毒科、漢坦病毒科、桿狀病毒科、冠狀病毒科、乳多空病毒科、彈狀病毒科、甲病毒科、動(dòng)脈炎病毒科、絲狀病毒科和痘病毒科組成的組的病毒。

含佐劑病毒體可以包含至少一種另外的抗原，優(yōu)選腫瘤抗原或源自病毒、寄生物、真菌或細(xì)菌的抗原。在具體的實(shí)施方式中，抗原是病毒抗原，優(yōu)選源自流感病毒或rsv。如本文以上所述，抗原可以是膜內(nèi)在蛋白或附接至膜錨定部分的抗原，優(yōu)選其中膜錨定部分是跨膜域、膜錨定氨基酸序列或脂質(zhì)部分。

其它特別優(yōu)選的病毒體是包含抗原的那些，該抗原來(lái)自人偏肺病毒、副粘病毒f蛋白、單純皰疹病毒gd和gb蛋白，另外含有源自hivgp41蛋白的蛋白質(zhì)或肽的流感病毒體，含有來(lái)自瘧疾蛋白如cs和ama的蛋白質(zhì)和肽的流感病毒體，或另外含有可用于乳腺癌疫苗的抗原的流感病毒體。

根據(jù)本發(fā)明的病毒體可以用來(lái)將物質(zhì)(例如免疫原性分子、藥物和/或基因)遞送到靶細(xì)胞。不同于脂質(zhì)體，病毒體提供以下優(yōu)勢(shì)：通過(guò)病毒包膜蛋白觸發(fā)而有效進(jìn)入細(xì)胞，隨后病毒體內(nèi)含物在細(xì)胞內(nèi)釋放。此外，如果某些活性病毒包膜蛋白被并入它們的膜，則在與細(xì)胞膜融合以后病毒體可以立即將它們的內(nèi)含物釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，例如從而防止在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中治療性物質(zhì)的降解。

根據(jù)本發(fā)明的病毒體特別有用于接種疫苗的領(lǐng)域，其中期望刺激對(duì)于與特定疾病或病癥關(guān)聯(lián)的抗原的免疫應(yīng)答。在這樣的情況下，抗原通常被包封于或結(jié)合于病毒體，其然后將該抗原遞送到待接種疫苗的宿主免疫系統(tǒng)。借助于遞送的特定抗原，得到的預(yù)防和/或治療必然對(duì)于抗原與其關(guān)聯(lián)的疾病或病癥是特異性的。

在進(jìn)一步的方面，因此本發(fā)明提供了藥物制劑，其包含根據(jù)本發(fā)明的病毒體作為活性組分，以及藥用載體、稀釋劑或賦形劑。還可以將藥用穩(wěn)定劑、滲透劑、緩沖劑、分散劑等并入藥物組合物。優(yōu)選的形式取決于預(yù)期的給予模式和治療應(yīng)用。藥物載體可以是適合于將病毒體遞送到患者的任何相容的、無(wú)毒物質(zhì)。

用于鼻內(nèi)遞送的藥用載體由水、緩沖鹽水溶液、甘油、聚山梨酯20、聚氧乙烯蓖麻油、和辛酸/癸酸甘油酯的水性混合物舉例說(shuō)明，并且可以是緩沖的以提供中性ph環(huán)境。由無(wú)菌的緩沖的0.9％(w/v)nacl或5％(w/v)葡萄糖(可選地補(bǔ)充有20％白蛋白)來(lái)舉例說(shuō)明用于胃腸道外遞送的藥用載體。用于胃腸道外給予的制劑必須是無(wú)菌的。用于給予多肽或抗體的胃腸道外途徑是根據(jù)已知方法，例如，通過(guò)靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或病灶內(nèi)途徑的注射或輸液。

將組成用于肌肉內(nèi)注射的典型藥物組合物以含有，例如1-10ml的磷酸鹽緩沖鹽水以及1至100μg，優(yōu)選15-50μg的本發(fā)明的病毒體(的抗原蛋白)。

對(duì)于口腔給予，可以以液體劑型，如酏劑、糖漿、和混懸劑，來(lái)給予活性組分。用于口腔給予的液體劑型可以含有著色劑和香料以增加患者接受度。用于制備可胃腸道外、口腔或鼻內(nèi)給予的組合物的方法是本領(lǐng)域公知的并且更詳細(xì)地描述于各種來(lái)源，包括，例如remington'spharmaceuticalscience(15thed.,mackpublishing,easton,pa,1980)(其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引證結(jié)合于本文)。

在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的病毒體包含在免疫原性組合物或疫苗中。術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指可以給予宿主以誘導(dǎo)細(xì)胞和/或抗體免疫應(yīng)答的制劑。疫苗可以含有另外的佐劑、藥用載體、稀釋劑或賦形劑。示例性的另外的佐劑包括完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、gerbu佐劑(gmdp；c.c.biotechcorp.)、ribi禽類(lèi)佐劑(ribifowladjuvant)(mpl；ribiimmunochemicalresearch,inc.)、鉀明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、qs21(cambridgebiotech)、titermax佐劑(cytrx)、和quila佐劑?？梢跃哂凶魟┬阅艿钠渌衔锇ㄕ澈蟿┤玺燃谆w維素、乙基纖維素、微晶纖維素、或明膠；賦形劑如淀粉、乳糖或糊精；崩解劑如藻酸、藻酸鈉、primogel、玉米淀粉等；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或sterotex；助流劑如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；香料如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙香料；以及著色劑。

在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的病毒體可以冷凍干燥，或在冷凍干燥以后重新獲取水分。冷凍干燥的病毒體可以作為干燥粉末或在重新獲取水分以后用作疫苗。

還提供了根據(jù)本發(fā)明的含佐劑病毒體用作藥物。例如，本文提供含佐劑病毒體用于預(yù)防或治療癌癥或傳染病的方法。在一種實(shí)施方式中，含佐劑病毒體是免疫原性的。術(shù)語(yǔ)“免疫原性的”是指能夠在宿主動(dòng)物中誘發(fā)免疫應(yīng)答，包括產(chǎn)生抗體反應(yīng)和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(例如，涉及細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl))的分子。

可以通過(guò)，例如，首先確定有效地誘發(fā)預(yù)防和/或治療性免疫應(yīng)答的劑量來(lái)確定含佐劑病毒體或疫苗的劑量。這可以通過(guò)測(cè)量病毒特異性免疫球蛋白的血清效價(jià)和/或通過(guò)測(cè)量抗體在血清樣品、尿樣品、和/或粘膜分泌物中的抑制率來(lái)完成。可以由動(dòng)物研究，包括不是rsv的自然宿主的動(dòng)物，來(lái)確定劑量。例如，可以將動(dòng)物用疫苗候選物給藥，以部分地表征誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，和/或確定是否已產(chǎn)生任何中和抗體。此外，可以進(jìn)行常規(guī)人類(lèi)臨床研究以確定用于人類(lèi)的有效劑量。可以由源自體外和/或體內(nèi)動(dòng)物模型的劑量-應(yīng)答曲線來(lái)外推有效劑量。

在一種實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明制備的藥劑的日劑量在10ng/kg至約10g/kg病毒體/成人/天的范圍內(nèi)變化。對(duì)于口腔給予，優(yōu)選以片劑的形式來(lái)提供藥劑，其含有0.001至1,000mg，優(yōu)選0,01至100mg，更優(yōu)選0,05至50mg，以及最優(yōu)選0,1至20mg的病毒體，用于在治療過(guò)程中根據(jù)患者的體征和癥狀的劑量的癥狀調(diào)節(jié)。片劑可以例如含有0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、10、20、50、或100毫克病毒體。通常以每劑量單位約0.0001mg/kg至約50mg/kg體重的劑量水平來(lái)供應(yīng)根據(jù)一種實(shí)施方式制備的藥劑中的病毒體的有效量。更具體地，范圍是約0.0001mg/kg至7mg/kg體重/天。如果給予兒童，則可以適當(dāng)減小劑量。

在一種實(shí)施方式中，可以使用稀釋劑來(lái)配制疫苗。示例性的“稀釋劑”包括水、生理鹽水溶液、人血清白蛋白、油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑、抗菌劑如苯甲醇、抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉、螯合劑如乙二胺四乙酸、緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)摩爾滲透壓濃度(osmolarity)的試劑，如氯化鈉或右旋糖。示例性的“載體”包括液體載體(如水、鹽水、培養(yǎng)基、鹽水、水性右旋糖、和二醇)和固體載體(如碳水化合物，由淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、和葡聚糖舉例說(shuō)明，抗氧化劑，由抗壞血酸和谷胱甘肽舉例說(shuō)明，以及水解蛋白)。

在一種實(shí)施方式中，疫苗可以含有賦形劑。術(shù)語(yǔ)“賦形劑”在本文中是指形成用于遞送抗原的載體的任何惰性物質(zhì)(例如，阿拉伯樹(shù)膠、糖漿、羊毛脂、淀粉等)。術(shù)語(yǔ)賦形劑包括在足夠液體的存在下，賦予組合物為制備丸劑或片劑所需要的粘附性的物質(zhì)。

在一種實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生特異性地結(jié)合至感興趣的包含在病毒體中的蛋白質(zhì)的抗體。術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”，當(dāng)涉及抗體或細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞)與另一種分子(如蛋白質(zhì)或肽)的相互作用來(lái)使用時(shí)，是指相互作用取決于在分子上特殊結(jié)構(gòu)(即，抗原決定簇或表位)的存在。

在另一種實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答包括增加特異性地結(jié)合至感興趣的蛋白質(zhì)的t淋巴細(xì)胞的數(shù)目。術(shù)語(yǔ)“t淋巴細(xì)胞”包括但不限于一種或多種的細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)、輔助t細(xì)胞、和抑制t細(xì)胞。t淋巴細(xì)胞表達(dá)識(shí)別與mhc分子復(fù)合的肽片段的形式的抗原的受體。

因此，在一種實(shí)施方式中，可以將本發(fā)明的病毒體并入疫苗，以及可以將免疫有效量的疫苗給予動(dòng)物以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“免疫原性有效量”和“免疫有效量”是指在接種疫苗時(shí)在宿主中其誘發(fā)和/或增加免疫應(yīng)答的產(chǎn)生(包括特異性抗體的生產(chǎn)和/或tcl反應(yīng)的誘導(dǎo))的分子的量。優(yōu)選的是(雖然不是必需的)，免疫有效(即，免疫原性有效)量是“保護(hù)”量。術(shù)語(yǔ)組合物的“保護(hù)”和“治療”量是指延遲、減輕、緩和、改善、穩(wěn)定、和/或逆轉(zhuǎn)疾病的一種或多種癥狀的組合物的量。

在一種實(shí)施方式中，可以預(yù)防性地(即，在感染劑的感染和/或觀察到疾病癥狀以前)和/或治療性地(即，在感染劑的感染和/或觀察到疾病癥狀以后)給予本發(fā)明的病毒體或疫苗。給予還可以伴隨(即，在同時(shí)，或期間)一種或多種疾病癥狀的顯現(xiàn)。另外，可以在給予另一種類(lèi)型的藥物或治療程序(例如，手術(shù)、化療、放療等)以前、同時(shí)、和/或以后，給予本發(fā)明的病毒體或疫苗。給予本發(fā)明的化合物的方法包括但不限于以胃腸道外、口腔、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、局部(例如，直腸、和陰道)、和舌下形式的給予。給予的胃腸道外途徑包括，例如皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射、和輸液途徑。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及通過(guò)將治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的病毒體(包含本發(fā)明的病毒體的藥物組合物)給予需要預(yù)防或治療的受試者，用于針對(duì)傳染病或腫瘤接種疫苗，或者用于預(yù)防或治療傳染病或腫瘤的方法。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的病毒體用作藥劑，優(yōu)選用于針對(duì)傳染病或腫瘤的接種疫苗的藥劑，或者用于預(yù)防或治療傳染病或腫瘤的藥劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的病毒體在制造用于針對(duì)傳染病或腫瘤的接種疫苗的藥劑，或者用于預(yù)防或治療傳染病或腫瘤的藥劑中的用途。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于針對(duì)癌癥或病毒性疾病來(lái)使受試者免疫的方法，包括將免疫有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物給予受試者以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。例如，病毒性疾病是由rsv、流感病毒、皰疹病毒、或巨細(xì)胞病毒所引起。

更進(jìn)一步的方面涉及藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，尤其是疫苗優(yōu)化。提供了用于優(yōu)化基于病毒體的疫苗的佐劑/抗原比率的方法，包括制備至少兩種包含根據(jù)本發(fā)明的含佐劑病毒體的制劑，和/或使用根據(jù)本發(fā)明的“后插入”方法，每種制劑具有不同的佐劑/抗原比率，以及在測(cè)試受試者中評(píng)估每種制劑在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中的功效。如上文所解釋的，對(duì)于包含含佐劑病毒體的疫苗的臨床前和臨床試驗(yàn)，這種方法具有重要的優(yōu)勢(shì)。由于預(yù)形成的病毒體組合物形成“藥物物質(zhì)a”，而溶劑中的佐劑是“藥物物質(zhì)b”，只需要對(duì)藥物物質(zhì)a和b的安全和臨床測(cè)試。物質(zhì)a和b的組合為具有不同佐劑/抗原比率的至少兩種藥品制劑可以臨床發(fā)生，從而在臨床前試驗(yàn)且然后在臨床試驗(yàn)中避免每種單獨(dú)的佐劑/抗原比率的昂貴的安全性評(píng)估。此外，上述方法允許使用任何病毒體來(lái)測(cè)試不同的佐劑，或使用不同的病毒體來(lái)經(jīng)濟(jì)地測(cè)試任何佐劑。

附圖說(shuō)明

圖1：在rsv病毒體中后插入佐劑3-d-phad的平衡密度梯度分析。分圖a示出蛋白質(zhì)、磷酸鹽(均來(lái)自磷脂和3-d-phad)、以及從底部到頂部編號(hào)為1.1、1.2連續(xù)至1.11的級(jí)分中的密度；分圖b示出溶解在dmso中的僅3-d-phad的類(lèi)似的梯度。

圖2：來(lái)自圖1a的梯度的樣品的tlc板分析，泳道1：rsv病毒脂質(zhì)提取物；泳道2：使用的pc和pe；泳道3：3d-phad佐劑；泳道4-8：梯度的級(jí)分1.5-1.9。在乙醇染色以后圈出斑點(diǎn)并使用磷鉬酸鹽試劑來(lái)使板顯影。圖3：來(lái)自dmf中的溶液的rsv病毒體中的佐劑3-d-phad的后插入的平衡密度梯度分析。從底部到頂部編號(hào)級(jí)分。分析如圖1。

圖4：來(lái)自dmso中的溶液的rsv病毒體中的佐劑mpla的后插入的平衡密度梯度分析。從底部到頂部編號(hào)級(jí)分。分析如圖1。

圖5：來(lái)自dmso中的溶液的rsv病毒體中的脂肽佐劑的后插入的平衡密度梯度分析。從底部到頂部編號(hào)級(jí)分。分析如圖1。

圖6：來(lái)自圖5中的梯度的級(jí)分的樣品的銀染色的sds-page凝膠。指出病毒膜蛋白f(f1亞單位)和g。脂肽用箭頭標(biāo)記。

圖7：如通過(guò)elisa確定的抗rsvigg。幾何平均效價(jià)的對(duì)數(shù)表示(底10)，線表示平均值。

圖8：體外中和抗體。效價(jià)的對(duì)數(shù)表示(底2)，線表示平均值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例

實(shí)施例1：通過(guò)后插入rsv病毒體并入佐劑mpl。

如在本領(lǐng)域中描述的，由純化的呼吸道合胞病毒(rsv)，菌株a2制備病毒體。簡(jiǎn)要地，將病毒在冰上溶解于50mm二己?；字Ｄ憠A(dcpc)30分鐘，并且通過(guò)在120000g下離心30分鐘來(lái)去除病毒核衣殼。收集上清液并通過(guò)0.1μm過(guò)濾器過(guò)濾。通過(guò)蒸發(fā)溶劑(氯仿/甲醇2:1v/v)，由2:1摩爾比的磷脂酰膽堿(pc)和磷脂酰乙醇胺(pe)(來(lái)源：雞蛋，分別磷脂?；D(zhuǎn)移自雞蛋)的混合物制備薄脂質(zhì)膜。以1mg蛋白質(zhì)/850nmol磷脂的比率將病毒膜上清液(2.35ml)加入薄脂質(zhì)膜。將混合物濾過(guò)0.2μm過(guò)濾器并在slide-a-lyzer透析盒中透析，通過(guò)γ輻射滅菌，10kda分子量截止，4℃下，針對(duì)7次更換的2升hne緩沖液，48小時(shí)。收獲病毒體，然后測(cè)量在病毒體中的磷脂濃度。

制備兩親性佐劑，合成的單磷酰脂質(zhì)a類(lèi)似物3-d-phad(公開(kāi)于wo2013/155448)在dmso中的儲(chǔ)備溶液。向含有850nmol磷脂的975μl病毒體，快速添加25μl的含有153nmol3-d-phad的dmso溶液，同時(shí)在渦旋混合器上攪拌樣品。在4℃下過(guò)夜儲(chǔ)存以后，通過(guò)加載在10-60％蔗糖梯度上的平衡密度梯度離心來(lái)分析病毒體的密度，其在sorvallah650轉(zhuǎn)子中在50krpm下旋轉(zhuǎn)66小時(shí)。作為對(duì)照，還在類(lèi)似的梯度上運(yùn)行153nmol的單獨(dú)的3d-p-had。通過(guò)折射測(cè)定法分析來(lái)自梯度的樣品的蔗糖濃度，給出密度、磷酸鹽(脂質(zhì)和3-d-phad兩者)、和蛋白質(zhì)的測(cè)量。如圖1所示，病毒體形成大約1.054-1.0759g/ml的單帶，其含有所有磷酸鹽，同時(shí)游離3-d-phad成帶于大約1.12g/ml。因此，來(lái)自dmso溶液的加入病毒體的大多數(shù)3dphad被并入病毒體。

根據(jù)folch，用氯仿/甲醇來(lái)提取梯度的級(jí)分，然后在merckhptlc60板上通過(guò)薄層色譜法分析。在氯仿:甲醇:水100:75:15(v/v)中運(yùn)行該板。通過(guò)連續(xù)的乙醇、碘、茚三酮和磷鉬酸鹽染色來(lái)可視化脂質(zhì)和3dphad。作為對(duì)照，使用rsv病毒脂質(zhì)的folch提取物、pc和pe來(lái)制備病毒體，并且還在相同的板上運(yùn)行游離的3dphad。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)3-d-phad存在于含有病毒體的級(jí)分中。

實(shí)施例2：使用幾種溶劑將幾種佐劑后插入rsv病毒體

如在實(shí)施例1中描述的，由純化的rsv病毒，菌株a2制備病毒體。收獲病毒體并測(cè)量病毒體中的磷脂濃度。

制備幾種佐劑在幾種溶劑中的儲(chǔ)備溶液：

1)50μldmf中的100nmol3-d-phad

2)50μldmso中的100nmol單磷酰脂質(zhì)a(mpla)

3)50μldmso中的0.3mgn-棕櫚?；?s-2,3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴(lài)氨酰)3-賴(lài)氨酸(脂肽)

將上述佐劑溶液加入各自含有帶有850nmol磷脂的950μl病毒體的四個(gè)管中，并在旋渦上快速混合。在4℃下過(guò)夜儲(chǔ)存以后，通過(guò)在10-60％蔗糖梯度上的平衡密度梯度離心來(lái)分析病毒體的密度，其在sorvallah650轉(zhuǎn)子中在120000g下旋轉(zhuǎn)66小時(shí)。分析來(lái)自梯度的樣品的密度、磷酸鹽(脂質(zhì)和3dphad兩者)和蛋白質(zhì)。如圖3-5所示，在所有梯度上，僅有磷酸鹽(來(lái)自磷脂、3-d-phad或mpla)的單個(gè)峰，還含有蛋白質(zhì)，而通過(guò)sds-page電泳(圖7)發(fā)現(xiàn)，脂肽存在于級(jí)分4-7中，在級(jí)分6(含有最高濃度的病毒體)中為峰值。這表明，在所有情況下，佐劑并入在病毒體中。雖然含有脂肽的病毒體具有大約1.1g/ml的峰值密度，其它病毒體在大約1.04-1.06g/ml處成帶。因此，加入病毒體的不同的佐劑會(huì)不同地影響病毒體的密度，提供它們的并入的進(jìn)一步的證據(jù)。

實(shí)施例3：用含有在病毒體形成期間或之后并入的3-d-phad的rsv病毒體使小鼠免疫。

由純化的呼吸道合胞病毒(rsv)，菌株a2制備兩種不同的病毒體制劑。簡(jiǎn)要地，將病毒在冰上溶解于50mm二己酰基磷脂酰膽堿(dcpc)中30分鐘，然后通過(guò)120000g下的離心30分鐘來(lái)去除病毒核衣殼。收集上清液，并通過(guò)0.1μm過(guò)濾器過(guò)濾。制備兩種薄脂質(zhì)膜，一種(測(cè)試樣品)通過(guò)蒸發(fā)溶劑(氯仿/甲醇2:1(v/v))來(lái)自2:1比率的pc和pe的混合物，；另一種(比較實(shí)施例)另外含有3-d-phad。

以1mg蛋白質(zhì)/850nmol磷脂(測(cè)試樣品)的比率或850磷脂加上200nmol3-d-dphad(比較實(shí)施例)，將病毒膜上清液加入薄脂質(zhì)膜。將混合物濾過(guò)0.2μm過(guò)濾器并在slide-a-lyzer透析盒中透析，通過(guò)γ輻射滅菌，10kda分子量截止，在4℃下，對(duì)7次更換的2升hne緩沖液，48小時(shí)。收獲病毒體并測(cè)量病毒體中的磷脂濃度。向975μl的含有850nmol磷脂其沒(méi)有3-d-phad的水性病毒體組合物快速添加25μl的含有153nmol3-d-phad的dmso溶液，同時(shí)在渦旋混合器上攪拌樣品。因此，比較病毒體制劑含有200nmol的在病毒體形成期間并入的3-d-phad(“并入的”)，而測(cè)試病毒體制劑含有100nmol的在病毒體形成以后添加自溶劑的3-d-phad(“后插入”)。

在第1天和第15天，使用任一種載體對(duì)照(hne緩沖液，145mmnacl，5mmhepes，1mmedta，ph7.4)，“并入的”病毒體制劑，以5μg病毒蛋白和1μg的3-d-phad/小鼠/注射，或“后插入”病毒體制劑，以5μg病毒蛋白和0.5μg的3-d-phad/小鼠/注射，來(lái)各自免疫10只balb/c小鼠的三個(gè)組。

在第28天，如前所述的((kamphuis,t.etal.plosone2012；7(5):e36812)，確定針對(duì)病毒蛋白的igg效價(jià)。如圖7所示，由3-d-phad后插入的病毒體誘導(dǎo)的igg效價(jià)相當(dāng)于并入的3-d-phad病毒體的那些，而后者的病毒體含有兩倍量的佐劑。

在第28天，如前所述的(kamphuis,t.etal.plosone2012；7(5):e36812)，體外確定針對(duì)活病毒的中和抗體效價(jià)。如圖8所示，由3-d-phad后插入的病毒體誘導(dǎo)的igg效價(jià)至少相當(dāng)于并入的3-d-phad病毒體的那些，而后者病毒體含有兩倍量的3-d-phad。