：本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及天麻素/天麻粉在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：肝纖維化是肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(特別是Ⅰ型膠原α1)過(guò)度沉積的病理過(guò)程，它是機(jī)體對(duì)急、慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng)。各種病因引起的慢性肝病及某些有毒物質(zhì)所致的肝臟損傷，均可引起肝細(xì)胞炎癥壞死，并繼發(fā)纖維化的病理特征。肝纖維化(hepaticfibrosis，HF)是向肝硬化甚至原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，在我國(guó)導(dǎo)致肝纖維化的主要疾病是乙型病毒性肝炎。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，人的肝臟一旦發(fā)生纖維化后，是不可能發(fā)生逆轉(zhuǎn)的，而著名的肝病專家Rogking在對(duì)肝纖維化進(jìn)行深入研究后提出，人典型的肝肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的，這對(duì)有效控制肝臟疾病由肝炎向肝硬化、肝癌惡性發(fā)展具有重要意義。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在肝纖維化的發(fā)生機(jī)制、調(diào)節(jié)因素、診斷及治療方面進(jìn)行了大量研究。盡管實(shí)驗(yàn)研究用藥不少，但是至今除針對(duì)引起肝纖維化的病因外，仍然沒(méi)有能用于臨床的高效、無(wú)明顯毒副作用的西藥。臨床實(shí)踐表明，中醫(yī)藥治療肝纖維化在改善臨床癥狀等方面顯示了很大的潛力。目前，我國(guó)臨床使用的抗肝纖維化中藥有：扶正化瘀膠囊、復(fù)方鱉甲軟肝片、大黃蟄蟲丸、小柴胡制劑、強(qiáng)肝膠囊等。所述藥物均為中藥復(fù)方制劑，由多味中藥組成，而且所有復(fù)方制劑中均不含有天麻成分。天麻為蘭科天麻屬植物，其干燥塊莖亦稱天麻(GastrodiaelataBlume)，是一味常用而較名貴的中藥，臨床多用于頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇、抽搐、破傷風(fēng)等癥。天麻素(Gastrodin)是天麻的有效單體成分之一，目前在臨床上主要用于治療心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。天麻素CAS號(hào)62499-27-8，分子式C13H18O7，分子量286.3，分子結(jié)構(gòu)式為：近年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)天麻素/天麻粉的系統(tǒng)生物學(xué)活性研究發(fā)現(xiàn)，作為單味藥的天麻素/天麻粉，具有抗肝纖維化的活性，繼而進(jìn)行了后續(xù)的深入研究工作。所述天麻素/天麻粉在抗肝纖維化中的應(yīng)用，迄今為止，尚未見(jiàn)有國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：本發(fā)明提供了天麻素/天麻粉在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了天麻素/天麻粉為有效成分與藥學(xué)上可接受的載體組成的組合物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用Ⅰ型膠原α1基因COL1A1啟動(dòng)子作為藥物篩選的靶標(biāo)，構(gòu)建了抗肝纖維化藥物細(xì)胞篩選模型，并使用該模型篩選出天麻素/天麻粉對(duì)COL1A1啟動(dòng)子具有顯著的抑制作用。為進(jìn)一步確定天麻素/天麻粉的抗肝纖維化作用，本發(fā)明制備膽總管結(jié)扎的SD大鼠模型，并對(duì)大鼠肝功能、肝組織病理結(jié)構(gòu)、肝組織纖維化程度、膠原纖維含量及氧化應(yīng)激程度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，天麻素/天麻粉能夠抑制肝纖維化的產(chǎn)生。本發(fā)明用于抗肝纖維化治療時(shí)，天麻粉口服給藥，天麻素口服或非口服給藥均屬安全有效的?？诜盟幙梢灾瞥扇魏纬Ｒ?guī)劑型，如片劑、膠囊、散劑、顆粒等；非口服用藥，可制成注射液針劑等。本發(fā)明所述天麻素給藥劑量可根據(jù)服用方式、病情輕重以及患者年齡等因素調(diào)整改變，通常成人口服劑量選自1-100mg/日；成人注射劑量選自1-50mg/日。本發(fā)明用于制備抗肝纖維化藥物時(shí)，其輔料及制備方法可選用藥學(xué)上可接受的任何形式。附圖說(shuō)明：圖1-天麻素對(duì)Ⅰ型膠原蛋白α1啟動(dòng)子活性的抑制作用其中：*p<0.05與對(duì)照組(給藥濃度為零)相比。圖2-天麻素對(duì)大鼠肝臟組織病理結(jié)構(gòu)的影響其中：A為假手術(shù)組大鼠肝臟組織切片HE染色結(jié)果；B為模型組大鼠肝臟組織切片HE染色結(jié)果；C為給藥天麻素組大鼠肝臟組織切片HE染色結(jié)果；D為對(duì)所有動(dòng)物組織膽管增生情況的統(tǒng)計(jì)圖；E為對(duì)所有動(dòng)物組織壞死情況的統(tǒng)計(jì)圖*p<0.05，**p<0.01與BDL組相比；##p<0.01與假手術(shù)組相比。圖3-天麻素對(duì)大鼠肝纖維化程度的影響其中：A為假手術(shù)組大鼠肝臟組織切片天狼星紅染色結(jié)果；B為模型組大鼠肝臟組織切片天狼星紅染色結(jié)果；C為給藥天麻素組大鼠肝臟組織切片天狼星紅染色結(jié)果；D為對(duì)所有動(dòng)物組織天狼星紅染色面積的統(tǒng)計(jì)圖*p<0.05與BDL組相比；##p<0.01與假手術(shù)組相比。圖4-天麻素對(duì)大鼠肝臟組織羥脯氨酸含量的影響其中：*p<0.05與BDL組相比；##p<0.01與假手術(shù)組相比。圖5-天麻素對(duì)大鼠肝臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響其中：*p<0.05與BDL組相比；##p<0.01與假手術(shù)組相比。圖6-天麻粉對(duì)Ⅰ型膠原蛋白α1啟動(dòng)子活性的抑制作用其中：*p<0.05，**p<0.01與對(duì)照組(給藥濃度為零)相比。圖7-天麻粉對(duì)大鼠肝臟組織病理結(jié)構(gòu)的影響其中：A為假手術(shù)組大鼠肝臟組織切片HE染色結(jié)果；B為模型組大鼠肝臟組織切片HE染色結(jié)果；C為給藥天麻粉組大鼠肝臟組織切片HE染色結(jié)果；D為對(duì)所有動(dòng)物組織壞死情況的統(tǒng)計(jì)圖**p<0.01與BDL組相比；##p<0.01與假手術(shù)組相比。圖8-天麻粉對(duì)大鼠肝纖維化程度的影響其中：A為假手術(shù)組大鼠肝臟組織切片天狼星紅染色結(jié)果；B為模型組大鼠肝臟組織切片天狼星紅染色結(jié)果；C為給藥天麻粉組大鼠肝臟組織切片天狼星紅染色結(jié)果；D為對(duì)所有動(dòng)物組織天狼星紅染色面積的統(tǒng)計(jì)圖##p<0.01與假手術(shù)組相比。圖9-天麻粉對(duì)大鼠肝臟組織羥脯氨酸含量的影響其中：##p<0.01與假手術(shù)組相比。具體實(shí)施方式：下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但所述內(nèi)容是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定?！秾?shí)施例1》天麻素抑制Ⅰ型膠原蛋白α1啟動(dòng)子活性試驗(yàn)1.1構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白α1啟動(dòng)子COL1A1P的單克隆細(xì)胞株LX2-COL采用基因組DNA提取試劑盒，提取LX2細(xì)胞(MountSinaiSchoolofMedicine)的基因組DNA。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)人全基因組信息Ⅰ型膠原α1基因COL1A1序列(序列號(hào)：NC_000017.11)前約2400bp，作為COL1A1啟動(dòng)子序列。應(yīng)用primerpremier5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)COL1A1啟動(dòng)子的引物，上下游引物序列分別為5’AAGAGCTCGTGGGAAAGCCTGGATGG3’(含SacⅠ酶切位點(diǎn))，5’AAAGATCTTTTGGGACTTACTGTCTTCGT3’(含BglⅡ酶切位點(diǎn))。以LX2細(xì)胞的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段Ⅰ型膠原α1基因COL1A1啟動(dòng)子，并利用瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定PCR產(chǎn)物。將Ⅰ型膠原α1基因COL1A1啟動(dòng)子片段與pGL4.17[luc2/Neo]載體經(jīng)SacⅠ和BglⅡ雙酶切后連接，連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在LB固體平板，37℃倒置培養(yǎng)16-20h，挑取氨芐青霉素抗性單克隆，提取質(zhì)粒DNA。利用菌落PCR、酶切等技術(shù)初步鑒定陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒，命名為pGL4.17-COL1A1P在含10％胎牛血清的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)LX2細(xì)胞。按照每孔5×104個(gè)細(xì)胞鋪于48孔板，培養(yǎng)24h在6孔板中培養(yǎng)LX2細(xì)胞達(dá)到接近90％-95％匯合時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。24h后，加入濃度梯度G418(AMERCO)，最終選擇濃度為100μg·mL-1的G418繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染pGL4.17-COL1A1P質(zhì)粒的LX2細(xì)胞，并及時(shí)換液。待6孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿后，鋪單細(xì)胞到96孔板。待單細(xì)胞長(zhǎng)成克隆(約1周-2周)，加D-熒光素(ThermoFisher)至終濃度60μg·mL-1，利用活體生物發(fā)光成像系統(tǒng)(IVIS200，Xenogen)拍攝，選擇信號(hào)最強(qiáng)的單克隆細(xì)胞株LX2-COL，并擴(kuò)大培養(yǎng)。1.2將以上構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白α1啟動(dòng)子COL1A1P的單克隆細(xì)胞LX2-COL鋪于96孔白板，每孔2×104個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞匯合度約90％后，無(wú)血清培養(yǎng)24h，加TGF-β1(2ng/ml)誘導(dǎo)，同時(shí)加入濃度梯度的天麻素(市售產(chǎn)品)，濃度分別為1μg/ml、3μg/ml、30μg/ml，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按照Bright-GloTMLuciferaseAssaySystem說(shuō)明書操作步驟，24h后吸棄培養(yǎng)基，加入任意培養(yǎng)基50μl/孔。加入熒光素酶底物50μl/孔，2min后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著天麻素濃度的升高，熒光強(qiáng)度減弱，且在天麻素濃度為3μg/ml和30μg/ml時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖1)。表明，天麻素在濃度為3μg/ml和30μg/ml時(shí)，對(duì)COL1A1啟動(dòng)子活性有明顯的抑制作用。《實(shí)施例2》SD大鼠膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化模型制備選體重在180-220g的SD雄性大鼠19只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、天麻素給藥(500mg/kg)組，其中假手術(shù)組5只，模型組7只，天麻素組7只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食12h后，用異氟烷麻醉動(dòng)物進(jìn)行手術(shù)。其中模型組和給藥組做膽總管結(jié)扎(BDL)，在無(wú)菌操作下，作上腹正中切口，抬高肝緣，拉開(kāi)十二指腸，分離總膽管2-3cm。在近十二指腸處和近肝門處用000號(hào)絲線各結(jié)扎兩道，從中間剪斷膽總管。假手術(shù)組僅作上腹正中切口并縫合，不做膽總管結(jié)扎。動(dòng)物麻醉清醒后，正常飲食，自由飲水，肌注青霉素3天，以防感染，實(shí)驗(yàn)溫度(22±2)℃。造模后第2天開(kāi)始灌胃給藥，分別給予生理鹽水(假手術(shù)組、模型組)和天麻素500mg/kg(天麻素給藥組)，每天1次，給藥14天?！秾?shí)施例3》天麻素對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠血清ALT/AST水平升高的抑制作用取樣前禁食12h，用10％水合氯醛麻醉大鼠，取腹主動(dòng)脈血。800rpm離心5min，取血清進(jìn)行谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性檢測(cè)。結(jié)果顯示，天麻素能夠明顯抑制大鼠血清中ALT和AST的含量(表1)，表明天麻素能夠改善大鼠肝功能。表1.天麻素對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠血清ALT/AST水平的影響**p<0.01與BDL組相比；##p<0.01與假手術(shù)組相比。《實(shí)施例4》天麻素對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)改變的抑制作用取樣前禁食12h，處死大鼠，取肝臟組織，切下肝大葉組織塊放入10％福爾馬林中固定。經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋、切片、烤片等制作石蠟切片。利用蘇木素-伊紅(HE)染色液進(jìn)行染色，觀察大鼠肝臟組織病理結(jié)構(gòu)變化情況。結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠肝臟組織肝細(xì)胞規(guī)則排列，肝小葉完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膽管增生情況；BDL后大鼠肝臟組織病理結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，膽管增生十分明顯，組織壞死明顯增多；天麻素給藥組的大鼠肝組織結(jié)構(gòu)得到明顯改善，膽管增生情況得到顯著抑制，組織壞死程度明顯降低(圖2)。表明，天麻素能夠明顯改善BDL大鼠肝臟組織的病理結(jié)構(gòu)?！秾?shí)施例5》天麻素對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的抑制作用將石蠟切片用天狼星紅染色，觀察大鼠肝臟組織纖維化情況。結(jié)果顯示，BDL后大鼠肝臟組織纖維化程度明顯增加，天麻素給藥后，纖維化程度得到明顯抑制(圖3)。表明，天麻素能夠明顯抑制BDL誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化?！秾?shí)施例6》天麻素對(duì)大鼠肝臟組織中羥脯氨酸含量的影響取樣前禁食12h，處死大鼠，取肝臟組織，精確稱取30-100mg，按照羥脯氨酸測(cè)試盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書進(jìn)行操作。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，BDL組大鼠肝臟組織中羥脯氨酸含量明顯升高；與BDL組相比，給藥天麻素后，大鼠肝臟組織中羥脯氨酸含量顯著降低(圖4)。表明，天麻素能夠明顯降低肝臟組織中羥脯氨酸的含量，即天麻素能夠明顯抑制BDL大鼠中膠原纖維的產(chǎn)生?！秾?shí)施例7》天麻素對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用取樣前禁食12h，處死大鼠，取肝臟組織，切成小塊于液氮中暫時(shí)保存，隨后轉(zhuǎn)移到-80℃保存。準(zhǔn)確稱取組織重量，按照重量(g)：體積(ml)＝1:9的比例加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，于冰浴中研磨，制備勻漿，3000-4000rpm，離心10-15min，取10％勻漿上清待測(cè)。按照丙二醛、一氧化氮(一步法)、超氧化物歧化酶測(cè)試盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)的操作步驟，檢測(cè)肝組織中的丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量變化。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組的大鼠相比，BDL組的大鼠肝臟組織中MDA與NO含量明顯升高，SOD含量明顯降低；與BDL組相比，天麻素給藥后，大鼠肝臟組織中MDA與NO含量顯著降低，SOD含量顯著升高(圖5)。表明，天麻素能夠明顯抑制大鼠肝臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)?！秾?shí)施例8》天麻粉抑制Ⅰ型膠原蛋白α1啟動(dòng)子活性按照《實(shí)施例1》中所述方法，檢測(cè)天麻粉(市售產(chǎn)品，粒度250-800目)對(duì)Ⅰ型膠原蛋白α1啟動(dòng)子活性的抑制作用，其中天麻粉的濃度梯度為1μg/ml、30μg/ml、100μg/ml。結(jié)果顯示，隨著天麻粉濃度的升高，熒光強(qiáng)度減弱，且在天麻粉濃度為30μg/ml和00μg/ml時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖6)。表明，天麻粉在濃度為30μg/ml和00μg/ml時(shí)，對(duì)COL1A1啟動(dòng)子活性有明顯的抑制作用?！秾?shí)施例9》天麻粉對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠血清ALT/AST水平升高的抑制作用按照《實(shí)驗(yàn)例2》及《實(shí)施例3》中的方法，檢測(cè)天麻粉對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠血清ALT/AST水平的影響。其中，天麻粉的灌胃給藥量為每只大鼠每天5g/kg。結(jié)果顯示，天麻粉能夠明顯抑制大鼠血清中ALS和AST的含量(表2)。表明，天麻粉能夠改善大鼠肝功能。表2.天麻粉對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠血清ALT/AST水平的影響**p<0.01與BDL組相比；##p<0.01與假手術(shù)組相比?！秾?shí)施例10》天麻粉對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織病理結(jié)構(gòu)的影響按照《實(shí)施例4》所述方法，觀察天麻粉對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)改變的影響。結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠肝臟組織細(xì)胞規(guī)則排列，肝小葉完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膽管增生情況；BDL后大鼠肝臟組織病理結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，膽管增生十分明顯，組織壞死明顯增多；天麻粉給藥組的大鼠肝組織結(jié)構(gòu)得到改善，組織壞死程度明顯降低(圖7)。表明，天麻粉明顯改善BDL大鼠肝臟組織的壞死情況?！秾?shí)施例11》天麻粉對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的影響將石蠟切片用天狼星紅染色，觀察大鼠肝臟組織纖維化情況。結(jié)果顯示，BDL后大鼠肝臟組織纖維化程度明顯增加，天麻粉給藥后，纖維化程度得到改善，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8)。表明，天麻粉對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有一定的抑制作用?！秾?shí)施例12》天麻粉對(duì)大鼠肝臟組織中羥脯氨酸含量的影響按照《實(shí)施例6》中所述方法，檢測(cè)天麻粉對(duì)大鼠肝臟組織中羥脯氨酸含量的影響。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，BDL組大鼠肝臟組織中羥脯氨酸含量明顯升高；與BDL組相比，天麻粉給藥后，大鼠肝臟組織中羥脯氨酸含量降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖9)。表明，天麻粉對(duì)大鼠肝臟中膠原纖維的產(chǎn)生有一定的抑制作用。