本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種以海藻酸鈉為主要材料包被藻藍(lán)蛋白，制備載藻藍(lán)蛋白微球的方法。

背景技術(shù)：

藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)是藻膽蛋白(phycobiliproteins)的一種，主要存在于藍(lán)藻(Cyanophyta)、紅藻(Rhodophyta)、隱藻(Cryptophyta)和少數(shù)甲藻(Pyrrophyta)中，是這些藻類進(jìn)行光合作用的捕光色素蛋白之一。其分子量在40ku左右，由α、β兩個(gè)亞基組成。肽鏈上共價(jià)結(jié)合1個(gè)開(kāi)鏈的四吡咯環(huán)輔基。分離純化的水溶藻藍(lán)蛋白在溶液中呈藍(lán)色，并發(fā)出紫色熒光，在波長(zhǎng)620nm具有特異吸收峰，可以A₆₂₀/A₂₈₀表示其純度。因其水溶性、無(wú)毒、清亮且著色力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，藻藍(lán)蛋白被廣泛用于食品著色劑和化妝品的添加劑。另外，藻藍(lán)蛋白帶有熒光，可作為熒光標(biāo)記物制成熒光試劑、熒光探針、熒光示蹤物等，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷、免疫化學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域中。藻藍(lán)蛋白的藥理活性非常廣泛，具有抗癌、抗氧化、治療腦缺血損傷、治療糖尿病等多種生物活性。這為藻藍(lán)蛋白在功能性食物和醫(yī)藥領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)提供了重要的決策依據(jù)，因此藻藍(lán)蛋白具有廣闊的應(yīng)用前景和較高的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但因其對(duì)光、熱和酸堿敏感，穩(wěn)定性差，易失活，限制了其大規(guī)模的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

海藻酸(Alginic acid)是從褐藻中提取的一種親水性多糖類化合物，由甘露糖醛酸(Mannuronic acid，記為M單元)與其立體異構(gòu)體古洛糖醛酸(Guluronic acid，記為G單元)兩種單糖以三種方式(MM段、GG段、MG段)通過(guò)α-(1，4)糖苷鍵連接而成的一種無(wú)支鏈的線性嵌段共聚物。海藻酸鈉在溶液狀態(tài)下能與金屬離子如Ca²⁺、Al³⁺等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其結(jié)果是金屬離子將Na⁺置換出來(lái)，并將海藻酸鈉的長(zhǎng)分子鏈維系在一起而形成凝膠。海藻酸鈉液滴與氯化鈣形成海藻酸鈣凝膠微球的過(guò)程是溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)移過(guò)程，制備過(guò)程溫和，其基本反應(yīng)方程式如下：2nNaAlginate+nCa²⁺→nCa(Alginate)+2nNa⁺

海藻酸鈣凝膠具有良好的生物相容性和生物粘附性，至今已被廣泛地應(yīng)用于藥物的控制釋放和微生物及酶的固定化。海藻酸鈣凝膠微球具有以下特點(diǎn)：(1)溶脹特性，可作為緩控釋給藥的載體。(2)其溶脹特性受pH值的影響，故可防止酸敏感性藥物在胃中被降解。

海藻酸鹽是陰離子聚合物，與陽(yáng)離子聚合物結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)生復(fù)合凝聚，形成復(fù)合凝膠，現(xiàn)已應(yīng)用于制劑的開(kāi)發(fā)。殼聚糖是有甲殼素脫乙酰化后得到的具有優(yōu)良生物降解性和成膜性的天然高分子直鏈多糖，其分子鏈上有大量的伯氨基，而海藻酸鈉的分子鏈上有大量的羧基， 因此殼聚糖和海藻酸鈉可以通過(guò)正、負(fù)電荷吸引形成復(fù)合凝膠，增加殼聚糖-海藻酸鈉凝膠微球的強(qiáng)度，降低海藻酸鈣凝膠微球?qū)H值的敏感度，抑制微球的崩解，從而進(jìn)一步控制藥物釋放。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種海藻酸鈉包被的藻藍(lán)蛋白微球制劑及其制備方法。它采用藻藍(lán)蛋白為包裹物，制備出適合腸道靶向給藥的微球制劑，該方法工藝簡(jiǎn)單、制備過(guò)程易控、制備的微球質(zhì)量穩(wěn)定。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：將藻藍(lán)蛋白溶解于2％(w/v)的海藻酸鈉溶液中，通過(guò)磁力攪拌混勻。將海藻酸鈉藻藍(lán)蛋白混合溶液通過(guò)恒流泵以4ml/min的速度經(jīng)過(guò)6.5#針頭滴入含滴到含氯化鈣的殼聚糖溶液(以1％醋酸、2.0％tween20溶解，NaOH調(diào)節(jié)pH5.0)中，600r/min攪拌30min，4℃靜置1h后，抽濾，用去離子水洗滌微球3次，37℃干燥得微球。

海藻酸鈉濃度(w/v)分別為0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％，殼聚糖濃度(w/v)分別為0.3％、0.5％、0.7％、0.9％，氯化鈣濃度(w/v)分別為1％、1.5％、2％、2.5％，藻藍(lán)蛋白/海藻酸鈉(w/w)分別為1/1、1/2、1/3、1/4，凝固浴pH分別為3、4、5及5.6。

微球的包埋率和載藥量的測(cè)定

取一定質(zhì)量的干燥微球，置于0.2mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)中，振蕩，直至微球完全溶解，離心后吸取上清，經(jīng)稀釋后測(cè)定釋放液的A652和A620，根據(jù)以下公式計(jì)算藻藍(lán)蛋白含量、微球的包埋率和載藥量：其中，A₆₅₂、A₆₂₀表示釋放溶液在652nm和620nm下的吸光度。

本發(fā)明選取的海藻酸鈉是從海藻中提取的一種天然高分子鈉鹽，相對(duì)分子質(zhì)量7～15萬(wàn)，不僅具有可調(diào)節(jié)性、生物相容性、緩釋性、安全性等諸多特點(diǎn)，并且將其作為主要材料制備口服蛋白微球具有以下優(yōu)點(diǎn)：在口服藥物中加入可增大粘度，延長(zhǎng)藥物的釋放時(shí)間，減少不良反應(yīng)；利用微球的溶脹對(duì)pH值的依賴性，使得該制劑在胃中不溶脹，不崩解，而在腸道的中性或稍堿性環(huán)境中崩解，適用于腸道給藥系統(tǒng)。

采用本方法制備得到的微球形態(tài)圓整，大小均勻，粒徑分布窄?？刂苾?yōu)化微球制備條件(海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、氯化鈣濃度、藻藍(lán)蛋白和海藻酸鈉質(zhì)量比和凝固浴pH)，.可使藻藍(lán)蛋白微球包埋率達(dá)到99.78％～99.86％，載藥量達(dá)到40.78％～43.86％，藥物在模擬胃環(huán)境中累計(jì)釋放少于1％，在模擬腸環(huán)境中累計(jì)釋放率大于90％，可實(shí)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白的腸定 向釋放。

附圖說(shuō)明

圖1為未干燥海藻酸鈉藻藍(lán)蛋白微球光學(xué)顯微鏡下形態(tài)。

圖2為干燥海藻酸鈉藻藍(lán)蛋白微球光學(xué)顯微鏡下形態(tài)。

圖3為海藻酸鈉藻藍(lán)蛋白溶脹度曲線。

圖4為海藻酸鈉藻藍(lán)蛋白微球體外累計(jì)釋放曲線，縱坐標(biāo)為藻藍(lán)蛋白累計(jì)釋放率，橫坐標(biāo)為釋放時(shí)間。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合一些實(shí)例對(duì)發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

正交化實(shí)驗(yàn)

以海藻酸鈉濃度(A)、殼聚糖濃度(B)、藻藍(lán)蛋白/海藻酸鈉質(zhì)量比(C)、氯化鈣濃度(D)為主要考查因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，進(jìn)行L9(₃⁴)正交實(shí)驗(yàn)。以包封率(S₁)和載藥量(S₂)為觀察指標(biāo)，綜合指標(biāo)S＝(S₁+S₂)/2，S愈大效果越好。

表一：正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

表二：借助正交助手軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果如下表所示。

由表可知對(duì)殼聚糖海藻酸鈉微球影響最大的是藻藍(lán)蛋白投入量，其次是海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度，最小的是殼聚糖濃度，即，影響殼聚糖海藻酸鈉微球的主要順序是C＞A＞D＞B。經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)的出的最佳實(shí)驗(yàn)組合是A3B1C3D2，即海藻酸鈉濃度2％，殼聚糖濃度0.2％，藻藍(lán)蛋白/海藻酸鈉為1，氯化鈣濃度濃度1.5％。

實(shí)施例2

優(yōu)化工藝條件下制備的殼聚糖海藻酸鈉藻藍(lán)蛋白微球的包封率和載藥量重復(fù)性考察不同批次載藥微球之間包封率的穩(wěn)定性

表三：最優(yōu)工藝條件下制備的6批載藥微球的包封率列于下表所示。

假定η_i隨實(shí)驗(yàn)次數(shù)n成正態(tài)分布，則標(biāo)準(zhǔn)差S為： 當(dāng)置信水平α＝0.1時(shí)，置信區(qū)間為(99.78％，99.86％)。結(jié)果表明90％的概率證明微球中藻藍(lán)蛋白的包封率在99.78％～99.86％之間，說(shuō)明此工藝制備的藻藍(lán)蛋白微球包封率較高，而且具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

實(shí)施例3

不同批次載藥微球之間載藥量的穩(wěn)定性

表四：最優(yōu)工藝條件下制備的6批載藥微球的載藥量列于下表。

假設(shè)L_i隨實(shí)驗(yàn)次數(shù)n成正態(tài)分布，則標(biāo)準(zhǔn)差S為當(dāng)置信水平α＝0.1時(shí)，置信區(qū)間為(40.78％，43.86％)。結(jié)果表明90％的概率證明微球中藻藍(lán)蛋白的載藥量在40.78％～43.86％之間，說(shuō)明此工藝制備的藻藍(lán)蛋白微球包封率較高，而且具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

實(shí)施例4

海藻酸鈉藻藍(lán)蛋白微球形態(tài)和粒徑檢測(cè)

微球形態(tài)的觀察：取少量干燥微球均勻分散于載玻片上，光學(xué)顯微鏡下觀察微球形態(tài)。結(jié)果表明未干燥的藻藍(lán)蛋白微球?yàn)樗{(lán)色，均一圓球形，表面光滑(見(jiàn)圖1)。干燥后藻藍(lán)蛋白微球?yàn)榛疑?，均一圓球形，表面粗糙(見(jiàn)圖2)。

微球平均粒徑測(cè)定：利用生物顯微鏡隨機(jī)測(cè)定50個(gè)載藥微球的粒徑，將微球的算術(shù)平均值作為微球的平均粒徑測(cè)得為1mm。

實(shí)施例5

藻藍(lán)蛋白微球溶脹度的測(cè)定

精確稱取0.2g干燥的微球，分別置于5m1的蒸餾水、模擬腸液和模擬胃液的溶脹介質(zhì)中，于不同的時(shí)間抽濾，除去上清，用濾紙吸干微球表面的水分，測(cè)定其質(zhì)量，至微球?yàn)楹阒?。溶脹度S(％)的計(jì)算公式為：

其中，W_t為t時(shí)間微球的質(zhì)量，W₀為0時(shí)干燥微球的質(zhì)量

如圖3所示，微球在蒸餾水和模擬胃液4h的平均溶脹率分別是227％和544％，在模擬腸液中達(dá)到了2893％，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間模擬腸液中的微球溶解。

實(shí)施例6

藻藍(lán)蛋白微球體外釋放性能測(cè)定

腸環(huán)境：取0.5g干燥的藻藍(lán)蛋白微球加入到100mL模擬腸液(SIF，NaOH 1.60g，KH₂PO₄6.80g，適量蒸餾水溶解后，蒸餾水定容至1000ml，測(cè)定溶液pH為7.4)中，置于37℃的恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速100r/min，每隔一定時(shí)間取5mL溶液，測(cè)其吸光度，計(jì)算藻藍(lán)蛋白濃度，在取樣的同時(shí)補(bǔ)充等量新鮮釋放液，保持模擬腸液的體積不變。

胃環(huán)境：同法測(cè)定在模擬胃液(SGF，NaCl 2.0g，36.5％濃鹽酸7ml，加蒸餾水至1000ml，測(cè)定pH為1.2)下的釋放性能。

如圖4所示，藻藍(lán)蛋白微球在模擬胃液中的累計(jì)釋放率小于1％，在模擬腸液中的累計(jì)釋放率大于90％，微球能夠有效地保護(hù)藻藍(lán)蛋白在胃中不被破壞，達(dá)到了有效地控釋的目的。