本發(fā)明屬于多西他賽的藥物組合物領(lǐng)域，具體涉及多西他賽白蛋白納米粒藥物組合物及其制備方法及應(yīng)用，特別涉及穩(wěn)定性增強(qiáng)的多西他賽白蛋白納米粒藥物組合物及其制備方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景
多西他賽屬于紫杉烷類藥物，其作用機(jī)理主要是多西他賽可干擾細(xì)胞有絲分裂和促使微管裝配并阻止微管分拆，由此抑制腫瘤細(xì)胞分化，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。多西他賽目前已在全球各主要國家獲得了乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌的多種適應(yīng)癥，并且是這些癌癥治療的最常用或標(biāo)準(zhǔn)療法之一。另外，多西他賽還廣泛用于治療胃癌、頭頸部腫瘤、食管癌、卵巢癌等后期臨床研究。日后，對這些適應(yīng)癥的治療有望在歐美獲得批準(zhǔn)。
多西他賽的水溶性較差，目前市售的多西他賽為濃縮輸注用液劑型，常規(guī)推薦劑量方案為每3周1次1小時靜脈輸注75mg/m2，多西他賽注射劑是采用吐溫-80作溶劑溶解多西他賽為1支藥物濃縮液，另同時再配有含13%乙醇的稀釋液一支。但是，由于吐溫-80具有溶血性，靜脈注射時容易引起包括呼吸困難、低血壓、血管性水腫、風(fēng)疹、休克等的過敏反應(yīng)，故臨床給藥時需預(yù)先采用藥物防止過敏，并且吐溫-80黏性大，這給臨床使用帶來極大不便。
為了解決多西他賽注射液毒副作用等缺陷，CN103830181A報(bào)道一種環(huán)糊精包合多西他賽凍干脂質(zhì)體，利用環(huán)糊精包合提高多西他賽穩(wěn)定性，并以脂質(zhì)體微粒系統(tǒng)改善靶向性，降低毒副作用。然而環(huán)糊精本身毒性限制其應(yīng)用。CN101773465A也報(bào)道一種氨基酸穩(wěn)定聚合物膠束系統(tǒng)，開發(fā)多西他賽聚合物膠束；結(jié)果發(fā)現(xiàn)：氨基酸-聚合物膠束的物理外觀可穩(wěn)定5d以上，而無氨基酸的聚合物膠束只能穩(wěn)定30分鐘。然而聚合物膠束本身使用高分子聚合物如mPEG-PLA等靜脈注射液體內(nèi)，降解非常緩慢，甚至長達(dá)1年以上；鑒于這些安全隱患，美國FDA還未有聚合物膠束產(chǎn)品獲批上市，因此這些微粒系統(tǒng)雖然提高靶向性，降低毒副作用，但都鑒于本身缺陷均限制其應(yīng)用。
多西他賽白蛋白納米粒（ABI-008）的專利CN103054798A就公開了在多西他賽、白蛋白的組合物中添加檸檬酸（鹽）提高多西他賽白蛋白納米粒的溶液物理穩(wěn)定性，使其在重建或再水化之后沒有顯示沉淀或沉降的現(xiàn)象至少達(dá)8 小時。
然而，提高多西他賽的穩(wěn)定性，除了控制其物理溶液粒子穩(wěn)定性之外，更為重要的是改善多西他賽化學(xué)降解情況。目前，現(xiàn)有技術(shù)對改善多西他賽的化學(xué)降解方面的研究很少，也尚未得出很好的改善方法。
多西他賽本身在不同情況下可經(jīng)歷多種降解，這些降解產(chǎn)物對其活性和/或毒性有相應(yīng)的變化，甚至是重大的影響。這種影響因素主要有溫度、酸性和堿性溶媒、氧化劑、還原劑和光等。
在堿性，中性或強(qiáng)酸性介質(zhì)中，多西他賽的主要降解途徑之一是7位羥基的差向異構(gòu)化，其通過逆醛醇反應(yīng)生成7-表-多西他賽。
Bornique等人（Drug Metabolism and Disposition, Vol. 30, No.11,pp.1149-1152,2002.）研究了多西他賽和7-表-多西他賽與重組人細(xì)胞色素P4501B1（hCYP1B1）的相互作用。hCYP1B1為人腫瘤細(xì)胞中常見的細(xì)胞色素，主要與化療藥物（包括多西他賽）的耐藥性有關(guān)。他們通過體外實(shí)驗(yàn)證明了7-表-多西他賽可以使hCYP1B1的活性增加7倍多，從而證實(shí)了多西他賽的降解產(chǎn)物7-表-多西他賽可以讓多西他賽的活性降低。
CN101415416A公開了通過添加pKa為2.5至4.5的有機(jī)酸作為多西他賽降解抑制劑來抑制多西他賽、聚山梨酯80的藥物組合物中7-表-多西他賽的產(chǎn)生。
然而，本發(fā)明的發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)證明在多西他賽、白蛋白組合物中加入酒石酸、檸檬酸和抗壞血酸及其他pKa為2.5至4.5的有機(jī)酸等抑制劑并不能有效抑制7-表-多西他賽增長，甚至出現(xiàn)7-表-多西他賽生成的增多，導(dǎo)致化學(xué)穩(wěn)定性差，影響制劑安全性。
CN103054798A公開了在多西他賽、白蛋白的組合物中添加檸檬酸（鹽）等穩(wěn)定劑。其雖然提高多西他賽白蛋白納米粒的溶液物理穩(wěn)定性，沒有提及其對抑制7-表-多西他賽的作用。
本發(fā)明的發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)證明：常規(guī)的穩(wěn)定劑檸檬酸（鹽）等并不能很有效抑制7-表-多西他賽，有時甚至出現(xiàn)增長更快，在存儲過程中，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出2.0%，給臨床用藥的安全性帶來隱患。
在尋求可以抑制7-表-多西他賽生成的方法的過程中，難題在于：在多西他賽白蛋白納米粒存儲過程中，由于白蛋白多肽結(jié)構(gòu)中存在大量氫鍵，不利于多西他賽穩(wěn)定而加速逆醛醇反應(yīng)導(dǎo)致7位羥基的差向異構(gòu)化，形成7-表-多西他賽雜質(zhì)并穩(wěn)定增長。
因此，找到可以抑制7-表-多西他賽生成的方法是本領(lǐng)域亟待解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的之一在于提供一種穩(wěn)定性增強(qiáng)的多西他賽的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括：
多西他賽
白蛋白
氨基酸
其中，白蛋白與多西他賽的質(zhì)量比不大于50；氨基酸與多西他賽的質(zhì)量比不小于0.5，優(yōu)選不小于1。
發(fā)明人驚訝的發(fā)現(xiàn)，氨基酸類物質(zhì)的選擇性加入能夠使得多西他賽白蛋白納米粒長時間穩(wěn)定，顯著抑制了7-表-多西他賽的生成。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例所示，在多西他賽白蛋白納米粒組合物中加入氨基酸可使得7-表-多西他賽的含量在24個月之后，仍然能保持在1 %以下。特別的，當(dāng)所用氨基酸為精氨酸時，在30個月之后，7-表-多西他賽的含量僅為0.72 %。
優(yōu)選的，所述藥物組合物為納米顆粒懸浮液，所述懸浮液中多西他賽濃度至少為1mg/ml，懸浮液中納米顆粒粒徑不大于200nm。
所述氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸中的至少一種，優(yōu)選精氨酸。
本發(fā)明的第二個目的在于提供上述藥物組合物的方法，該方法包括步驟：
1）將多西他賽溶于有機(jī)溶劑中，優(yōu)選乙醇、叔丁醇、丙酮中的一種；
2）用含氨基酸的水溶液溶解白蛋白或稀釋白蛋白溶液，獲得白蛋白氨基酸溶液；
3）將蛋白結(jié)構(gòu)展開劑添加到步驟2）所得的白蛋白氨基酸溶液中，進(jìn)行孵育反應(yīng)；其中，所述蛋白結(jié)構(gòu)展開劑包括巰基乙醇、谷胱甘肽、乙酰半胱氨酸、二硫蘇糖醇中的一種或多種；
4）將步驟1）所得物加入到步驟3）孵育反應(yīng)后所得的溶液中，在加入的同時剪切，即得多西他賽的白蛋白納米顆粒稀溶液；
5）將步驟4）所得的溶液進(jìn)行超濾濃縮，即可得到穩(wěn)定增強(qiáng)的多西他賽白蛋白納米粒的藥物組合物；
在上述過程中，控制白蛋白與多西他賽的質(zhì)量比不大于50；氨基酸與多西他賽的質(zhì)量比不小于0.5，優(yōu)選不小于1。
或該方法包括步驟：
1）將多西他賽溶于有機(jī)溶劑中，優(yōu)選乙醇，叔丁醇、丙酮中的一種或多種；
2）注射用水溶解白蛋白或稀釋白蛋白溶液，獲得白蛋白溶液；
3）將蛋白結(jié)構(gòu)展開劑添加到步驟2）所得的白蛋白溶液中，進(jìn)行孵育反應(yīng)；其中，所述蛋白結(jié)構(gòu)展開劑包括巰基乙醇、谷胱甘肽、乙酰半胱氨酸、二硫蘇糖醇的一種或多種；
4）將步驟1）所得物加入到步驟3）孵育反應(yīng)后所得的溶液中，在加入的同時剪切，即得多西他賽的白蛋白納米顆粒稀溶液；
5）將步驟4）所得的溶液進(jìn)行超濾濃縮，在濃縮液中加入氨基酸，其中氨基酸與多西他賽質(zhì)量比例不小于0.5，優(yōu)選不小于1，即可得到穩(wěn)定增強(qiáng)的多西他賽白蛋白納米粒的藥物組合物；
在上述過程中，控制白蛋白與多西他賽的質(zhì)量比不大于50。
在制備本發(fā)明多西他賽白蛋白納米粒藥物組合物時，氨基酸可以在制備納米粒之前加入（用氨基酸溶解白蛋白），也可以在制備好納米粒后再加入。在本發(fā)明組合物的制備過程中，只要能使得氨基酸能與多西他賽白蛋白納米粒反應(yīng)的任何方法均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的效果。本發(fā)明所列的兩種方法僅僅是主要的兩種方法而已，其它依據(jù)該兩種方法進(jìn)行合理調(diào)整的方法均不背離本發(fā)明精神，均屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明所選的蛋白結(jié)構(gòu)展開劑可以打開白蛋白疏水鍵區(qū)域的物質(zhì)，利于多西他賽與白蛋白結(jié)合；凡是具有此效果的物質(zhì)，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
優(yōu)選的，所述氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸中的至少一種，優(yōu)選精氨酸。
優(yōu)選的，所述藥物組合物為顆粒懸浮液，濃度至少為1mg/ml，懸浮液中顆粒粒徑不大于200nm。
本發(fā)明的另一個目的在于提供本發(fā)明藥物組合物的制劑，包括多西他賽白蛋白納米粒藥物組合物以及藥學(xué)上可接受的載體和/輔料。
優(yōu)選的，所述制劑為凍干粉針劑。
本發(fā)明的一個目的在于提供本發(fā)明組合物制備用于治療或預(yù)防細(xì)胞增殖異常性疾病或病癥的藥物中的用途，所述癌癥包括在前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌和卵巢癌。
本發(fā)明的一個目的在于提供本發(fā)明組合物制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途，所述癌癥包括在前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌和卵巢癌。本發(fā)明的另一目的在于，本發(fā)明的組合物用于治療或預(yù)防細(xì)胞增殖異常性疾病或病癥的方法。
本發(fā)明的有益效果：
1、通過添加氨基酸能顯著抑制多西他賽白蛋納米粒藥物組合物中的7-表-多西他賽雜質(zhì)的生成，提高了多西他賽納米粒藥物組合物的穩(wěn)定性，同時延長了多西他賽納米粒藥物組合物貯存時間；
2、本發(fā)明藥物組合物的制備方法簡單；
3、本發(fā)明可用于前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌和卵巢癌的治療，具有廣泛市場應(yīng)用前景，且本發(fā)明的多西他賽白蛋白納米粒的治療效果優(yōu)于多西他賽普通注射液。
附圖說明
圖1 為多西他賽治療非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的BALB/c裸鼠皮下移植瘤腫瘤模型藥效結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面給出實(shí)施例以對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。有必要在此指出的是以下實(shí)施例不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，如果該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述本發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
多西他賽白蛋白納米粒制劑處方：
；
將1500mg的多西他賽加入200ml的燒杯中，加入100ml的乙醇溶液，超聲溶解后得到油相。用注射用水溶液稀釋人血清白蛋白濃溶液（200mg/ml）配制成6mg/ml溶液，并將500mg谷胱甘肽加入到1250ml，含6mg/ml人血清白蛋白溶液中，在70℃的水浴中孵育6分鐘后，將油相在1,000轉(zhuǎn)/分鐘（rpm）的高速剪切下均勻分散水相中，產(chǎn)生的體系被轉(zhuǎn)移到超濾濃縮裝置里面（PALL，100KD膜包），超濾至多西他賽的濃度為6mg/ml濃縮液，多西他賽白蛋白納米粒的平均粒徑為103nm（Malvern Nano-ZS90）。然后在濃縮液分成4份，分別加入精氨酸，a. 精氨酸與多西他賽的質(zhì)量比為0；b. 精氨酸與多西他賽的質(zhì)量比為0.5；c. 精氨酸與多西他賽的質(zhì)量比為1；d. 精氨酸與多西他賽的質(zhì)量比為20。 然后分別將混合后溶液通過0.22μm的無菌濾頭過濾除菌，使用凍干機(jī)冷凍干燥48h即可。將凍干后樣品用生理鹽水復(fù)溶，復(fù)溶后的樣品在室溫也可穩(wěn)定8小時以上，并測定多西他賽白蛋白納米粒中7-表-多西他賽雜質(zhì)增長趨勢。
實(shí)施例2
將150mg的多西他賽加入100ml的燒杯中，加入10ml的乙醇溶液，超聲溶解后得到油相。用注射用水溶液溶解牛血清白蛋白固體配制成6mg/ml溶液，并將200mg谷胱甘肽和750mg脯氨酸加入到1250ml，含6mg/ml牛血清白蛋白 溶液中，在60℃的水浴中孵育6分鐘后，將油相在1,000轉(zhuǎn)/分鐘（rpm）的高速剪切下均勻分散水相中，產(chǎn)生的體系被轉(zhuǎn)移到超濾濃縮裝置里面（PALL，100KD膜包），超濾至多西他賽的濃度為6mg/ml（最終脯氨酸濃度為0.6mg/ml，脯氨酸與多西他賽質(zhì)量比為0.5）。多西他賽白蛋白納米粒的平均粒徑為113nm（Malvern Nano-ZS90）。 將制備的濃溶液分別通過0.22μm的無菌濾頭過濾除菌，使用凍干機(jī)冷凍干燥48h即可。將凍干后樣品用生理鹽水復(fù)溶，復(fù)溶后的樣品在室溫也可穩(wěn)定8小時以上。
實(shí)施例3
將150mg的多西他賽加入100ml的燒杯中，加入10ml的乙醇溶液，超聲溶解后得到油相；用注射用水溶液溶解重組人血清白蛋白與牛血清白蛋白固體（1:1 w/w）固體配制成10mg/ml溶液，并將50mg谷胱甘肽加入到450ml，含10mg/ml重組人血清白蛋白注射用水溶液中，在60℃的水浴中孵育6分鐘后，將油相在1,000轉(zhuǎn)/分鐘（rpm）的高速剪切下均勻分散水相中，產(chǎn)生的體系被轉(zhuǎn)移到超濾濃縮裝置里面（PALL，100KD膜包），超濾至多西他賽的濃度為6mg/ml，在此濃縮液中加入氨基酸（脯氨酸）與多西他賽質(zhì)量比為1。多西他賽白蛋白納米粒的平均粒徑為110nm（Malvern Nano-ZS90）。 將制備的濃溶液分別通過0.22μm的無菌濾頭過濾除菌，使用凍干機(jī)冷凍干燥48h即可。將凍干后樣品用生理鹽水復(fù)溶，復(fù)溶后的樣品在室溫也可穩(wěn)定8小時以上。
實(shí)施例4
除將乙醇替換為叔丁醇，谷胱甘肽替換為乙酰半胱氨酸，精氨酸替代為賴氨酸（賴氨酸與多西他賽質(zhì)量比為1）之外，其余制備過程與實(shí)施例1一致，最終多西他賽白蛋白納米粒粒徑為124nm。
實(shí)施例5
除將乙醇替換為丙酮和叔丁醇（1:1 v/v），谷胱甘肽替換為巰基乙醇，精氨酸替換為半胱氨酸（半胱氨酸與多西他賽質(zhì)量比為1）之外，其余制備過程與實(shí)施例1一致，最終多西他賽白蛋白納米粒粒徑為132nm。
實(shí)施例6
除將谷胱甘肽替換為二硫蘇糖醇和巰基乙醇（1:1 w/w），精氨酸替換為精氨酸和脯氨酸（氨基酸（精氨酸和脯氨酸質(zhì)量比1：1）與多西他賽質(zhì)量比為1），濃縮后多西他賽的濃度為1mg/ml之外，其余制備過程與實(shí)施例1一致，最終多西他賽白蛋白納米粒粒徑為200nm。
對比實(shí)施例1
將150mg的多西他賽加入50ml的西林瓶中，加入10ml的乙醇溶液，超聲溶解后得到油相。用注射用水溶液稀釋人血清白蛋白濃溶液（200mg/ml）配制成6mg/ml溶液，并將50mg谷胱甘肽分別加入到125ml，含6mg/ml人血清白蛋白的溶液中，在80℃的水浴中孵育6分鐘后，將油相在1,000轉(zhuǎn)/分鐘（rpm）的高速剪切下均勻分散水相中，產(chǎn)生的體系被轉(zhuǎn)移到超濾濃縮裝置里面（PALL，100KD膜包），超濾至多西他賽的濃度為10mg/ml，然后加入酒石酸（鹽），使得最終溶液pH達(dá)7.0，多西他賽濃度為6mg/ml，酒石酸濃度100mM（參考專利CN201210585716的優(yōu)選比例）；將最終樣品溶液通過0.22μm的無菌濾頭過濾除菌，使用凍干機(jī)冷凍干燥48h即可。
對比實(shí)施例2
除將酒石酸替換為檸檬酸，并將其最終濃度設(shè)置為100mM（參考專利CN201210585716的優(yōu)選比例）之外，其余與對比實(shí)施例1一致。
對比實(shí)施例3
除將酒石酸替換為檸檬酸鈉，并將其最終濃度設(shè)置為100mM（參考專利CN201210585716的優(yōu)選比例）之外，其余與對比實(shí)施例1一致。
對比實(shí)施例4
除不添加任何氨基酸之外，其余與實(shí)施例1一致。
實(shí)驗(yàn)例1
對實(shí)施例1-6和對比實(shí)施例1-4進(jìn)行7-表-多西他賽含量的測試。
采用HPLC測定7-表-多西他賽百分比含量：柱Spherisorb RP18 4.6 x250nm，粒徑5μm；流動相：溶液A=乙腈：水（2:3，V/V），溶液B=乙腈；前70分鐘使用溶液A進(jìn)行洗脫，然后使用10%溶液A和90%溶液B洗脫20分鐘；流速為1ml/min；檢測波長227nm，進(jìn)樣量20μl.
加入不同抑制劑后多西他賽與白蛋白組合物中7-表-多西他賽的百分比含量與時間的關(guān)系（2-8℃存儲）見表2。
。
注：用于定義藥物組合物穩(wěn)定性的可接受極限是“7-表-多西他賽的百分比含量≤1.0%”。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在多西他賽與白蛋白組合物添加精氨酸、賴氨酸、脯氨酸、半胱氨酸以及它們?nèi)我獾慕M合形式均可以有效抑制差向異構(gòu)體7-表-多西他賽的增長，而加入pKa為2.5至4.5的有機(jī)酸（鹽）并不能抑制差向異構(gòu)體7-表-多西他賽的增長。
根據(jù)表2數(shù)據(jù)明顯看出：加入pKa為2.5至4.5的有機(jī)酸（鹽）作為抑制劑，不能有效抑制7-表-多西他賽的增長；而加入氨基酸作為抑制劑以后，明顯的抑制7-表-多西他賽的增長。采用精氨酸作為抑制劑的效果最佳：可以在2~8℃的條件下貯存至少24個月，甚至可達(dá)30個月（如本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)例1所示）。
實(shí)驗(yàn)例2
加入不同濃度的精氨酸后多西他賽與白蛋白組合物中7-表-多西他賽的百分比含量與時間的關(guān)系見表3。從表3可以看出，當(dāng)精氨酸與多西他賽比例為0.5、1、20、80時，在30個月內(nèi)都能明顯的抑制7-表-多西他賽的增長。
。
實(shí)驗(yàn)例3
利用實(shí)施例1-d的多西他賽白蛋白納米粒藥物組合物進(jìn)行在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的BALB/c裸鼠皮下移植瘤腫瘤模型下藥效證明實(shí)驗(yàn)，以證明組合物在癌癥治療上的應(yīng)用：篩選合格的A549的BALB/c成瘤動物30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別給予空白生理鹽水組，普通多西他賽注射液組（20mg/kg）,多西他賽白蛋白納米粒組（20mg/kg），尾靜脈注射，連續(xù)4周，29天后動物實(shí)施安樂死。給藥期間每天2次觀察動物一般臨床癥狀，每周進(jìn)行2次體重和瘤徑測量，安樂死后剝?nèi)∧[瘤，稱量腫瘤重量。根據(jù)腫瘤體積大小與時間繪制曲線評價(jià)藥效結(jié)果。
藥效結(jié)果見說明書附圖1。根據(jù)說明書附圖1顯示，多西他賽注射液和實(shí)施例1的多西他賽白蛋白納米粒藥物組合物在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的BALB/c裸鼠皮下移植瘤腫瘤模型中均有顯著抑制腫瘤生長療效，且實(shí)施例1的藥物組合物效果優(yōu)于普通注射液，說明本發(fā)明開發(fā)多西他賽白蛋白納米粒具備治療非小細(xì)胞癌癥應(yīng)用效果。