本發(fā)明涉及的是一種生物工程領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種利用靈芝液體發(fā)酵技術(shù)誘導菌絲分泌錳過氧化物酶，然后通過粗酶液輔助靈芝孢子粉破壁的應用方法。

背景技術(shù)：

靈芝孢子(Ganoderma spore)是靈芝子實體在生長成熟期從菌蓋背面菌褶中彈射出來的極其微小的卵形生殖細胞—擔孢子，每個靈芝孢子只有4‐6個微米，是活體生物體，雙壁結(jié)構(gòu)，外被堅硬的幾丁質(zhì)纖維素所包圍。靈芝孢子粉中含有豐富的多糖、生物堿、有機鍺及萜類化合物等多種藥理活性成份，能明顯提高人體的免疫機能，促進IgM和IgG的產(chǎn)生，有抗病毒、防癌變、抑腫瘤等功能(Jin H，Jin F，Jin JX，Xu J，Tao TT，Liu J，Huang HJ.Protective effects of Ganoderma lucidum spore on cadmium hepatotoxicity in mice.Food Chem Toxicol.2013，52:171‐5.Sliva D，Sedlak M，Slivova V，Valachovicova T，Lloyd FP Jr，Ho NW.Biologic activity of spores and dried powder from Ganoderma lucidum for the inhibition of highly invasive human breast and prostate cancer cells.J Altern Complement Med.2003,9(4)：491‐7.)。靈芝孢子細胞壁由葡聚糖、幾丁質(zhì)等不溶于水的多糖類高分子構(gòu)成，具有耐酸抗堿，耐壓抗熱，耐酶抗消化等性質(zhì)，孢子進入腸胃后，有效成分無法被人體吸收利用，影響其功效的發(fā)揮(參考文獻：陳體強.原木靈芝孢子研究(Ⅳ)—未破壁孢子與破壁孢子的比較.食用菌學報，1999，6(3):21‐26)；據(jù)有關(guān)試驗表明，一個人若直接食用不經(jīng)破壁處理的靈芝孢子，人體僅能利用12.0％左右的有效成分，而服用破壁后的孢子粉，利用率可達到95.0％以上(Zhang SQ，Zhu JJ，Wang CZ，et al.Development of wall breaking method of Ganoderma lucidum spores.Transact Chin Soci Agricul Machinery，2004，35(2):160‐162)。由此可見，靈芝孢子粉破壁率的大小就是能否最大程度上利用孢子粉有效成分的關(guān)鍵所在。因此，靈芝孢子粉在食用(或藥用)時，通常均要進行破壁處理。

靈芝孢子粉的破壁工藝大致可分為5類：(1)生物法：主要包括溶菌法、激活孢子、酶解法等。(2)化學法：包括酸或堿降解、溶劑浸泡等。(3)物理法：包括超聲波、微波、低溫、脆化等方法。(4)機械法。擠壓、碾壓、氣流粉碎、撞擊、噴射粉碎等方法。(5)綜合法：指結(jié)合上述多種方法的新型聯(lián)用技術(shù)(趙潔勝魏聯(lián)虞燕萍王翔譚榮德敖雷。靈芝孢子粉破壁率的檢驗方法研究進展。中國醫(yī)藥指南.2013,11(5)：431‐433)。從理論上分析，盡管目前有多種方法對靈芝孢子進行破壁處理，但最常用的還是其中的三類方法：機械、物理、化學和生物方法。其 中機械方法、物理方法主要是利用剪切力破壞細胞壁，化學方法是利用去污劑之類的試劑，而生物學方法主要是應用酶來消化細胞壁結(jié)構(gòu)(夏志蘭，王春暉，姜性堅，李元文，熊興耀.靈芝孢子粉生物酶破壁技術(shù)的研究.食用菌學報.2005，12(1)：14‐18)。目前來看，機械法比較快捷，使用該方法研磨配合冷凍干燥的破壁效果是最好的(Zhao D，Chang MW，Li JS，Suen W，Huang J.Investigation of ice‐assisted sonication on the microstructure and chemical quality of Ganoderma lucidum spores.J Food Sci.2014，79(11)：E2253‐65.)，因此，在各類靈芝孢子粉加工中最常用；但這類方法破壁率不高，破壁后的孢子有可能會帶入過量的重金屬雜質(zhì)，且有效成分受到嚴重破壞，以此為原料開發(fā)的藥品功效不高?；瘜W方法對于破壞細胞膜更有用，而利用商業(yè)化生產(chǎn)的純酶破壁雖然有效，但操作繁瑣，價格昂貴，不適合大量在生產(chǎn)上使用。因此，高效能的孢子破壁技術(shù)和破壁后有效成分的保護技術(shù)已成為靈芝孢子新藥開發(fā)和利用的重要因素。

經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利公開號CN1165032公開日1997.11.19，公開了一種靈芝孢子粉的破壁方法，該技術(shù)利用溶菌酶，蝸牛酶，纖維素酶或半纖維素酶中的一種或多種復合酶對靈芝孢子粉進行處理，用超聲波進行破碎處理完成破壁過程，其破壁率達90％以上。

中國專利公開號CN102960731A公開日2013.03.13，公開了一種抗氧化的破壁靈芝孢子粉的制備方法及產(chǎn)品，該技術(shù)將破壁靈芝孢子粉與幾丁聚糖食醋膠體溶液充分混合，使破壁靈芝孢子粉充分吸附幾丁聚糖食醋膠體溶液；再將吸附有幾丁聚糖食醋膠體溶液的破壁靈芝孢子粉進行干燥，得到抗氧化的破壁靈芝孢子粉；這種方法在破壁靈芝孢子粉表面附上ー層殼聚糖保護膜，有效隔絕破壁靈芝孢子粉與外部環(huán)境空氣的接觸，因此提高了破壁靈芝孢子粉的抗氧化能力，有效地防止產(chǎn)品過氧化值升高，延長了保存期限，且提高了產(chǎn)品質(zhì)量。

上述現(xiàn)有技術(shù)利用生物酶對靈芝孢子粉破壁，提高了破壁率，利用破壁靈芝孢子粉與幾丁聚糖食醋膠體溶液充分混合，解決了破壁靈芝孢子粉氧化的問題，有效保護了破壁孢子粉中的有效成分。前者在破壁率提高的同時，增加了成本，超聲波破壁有可能引起部分有效成分的降解；后者僅注重了破壁后有效成分的保護，并未涉及在破壁過程中如何保護有效成分；且兩者在生產(chǎn)的過程中有增加破壁的成本的問題。因此，有必要尋找一種簡單經(jīng)濟的方法，在破壁的過程中保護孢子原有的活性成分，甚至增加孢子粉中活性成分的含量，并把這種方法用于生產(chǎn)，服務健康事業(yè)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于靈芝菌絲分泌酶的靈芝孢子粉優(yōu)化破壁方法，依據(jù)生物轉(zhuǎn)化原理利用靈芝菌絲誘導產(chǎn)酶、并利用粗酶液輔助靈芝孢子粉的破壁，靈芝菌絲發(fā)酵粗酶液‐孢子粉的復合物中靈芝β‐葡聚糖和三萜類成分的含量明顯增加，且安全、 易于吸收，可用于保健食品和藥物開發(fā)等

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明通過將靈芝孢子粉和基于靈芝菌絲體接種發(fā)酵得到的粗酶液混合配制成懸浮液，經(jīng)破壁均質(zhì)處理后濃縮干燥得到破壁孢子粉。

所述的粗酶液是指：采用靈芝菌絲體依次在誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)基、靈芝預培養(yǎng)培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)后得到的上清液，其MnP酶活力為：靈芝Ganoderma lucidum51562酶活大于232.38(U/g)，靈芝Ganoderma lucidum00679酶活大于871.44(U/g)。

所述的接種發(fā)酵包括：

①預培養(yǎng)，是指在無菌條件下，將靈芝液體菌種按照5％‐10％的量(v/v)接入誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)；

所述的誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)基，即PDA固體培養(yǎng)基，通過以下方式制備得到：去皮馬鈴薯200g用700‐800mL蒸餾水煮30‐40min至爛，用4層紗布過濾后溶入葡萄糖20g，KH₂PO₄5g，MgSO₄·7H₂O 3g，維生素B₁0.01g，定容至1000mL，調(diào)pH值至6.5‐7.0，加入瓊脂粉16～18g，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高壓滅菌，冷至60℃時倒平板。

所述的誘導培養(yǎng)是指：在25‐30℃環(huán)境下培養(yǎng)8‐10d。

②擴大培養(yǎng)，是指將預培養(yǎng)后的菌種接入含有20～25％(培養(yǎng)液:培養(yǎng)容器v/v)液態(tài)的靈芝預培養(yǎng)培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)兩階段旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)后取上清液得到。

所述的靈芝預培養(yǎng)培養(yǎng)基通過以下方式制備得到：稱取蔗糖35g，蛋白胨(NIHONSEIYAKU公司)5g；酵母粉(MERCK公司)25g；KH₂PO₄·H₂O 1g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；維生素B₁0.05g于燒杯中，加入800mL去離子水，充分攪拌溶解，再補水至1000mL；調(diào)pH值到5.5，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高壓滅菌。

所述的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)是指：在28℃恒溫振蕩器中120rpm培養(yǎng)4‐7d，具體為：用接種鏟將1cm²左右的平板菌種接至裝有20‐40mL液體靈芝預培養(yǎng)培養(yǎng)基的150mL三角瓶中搗碎；靜置2‐3d活化后，將三角瓶放入28℃恒溫振蕩器中120rpm培養(yǎng)4‐6d；然后將150mL三角瓶中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入500mL或1L三角瓶中(前者加入100mL，后者加入200mL液體靈芝預培養(yǎng)培養(yǎng)基)放入28℃恒溫振蕩器中120rpm培養(yǎng)5‐7d，備用。

③發(fā)酵，是指將步驟②得到的上清液加入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)后離心處理得到上清液。

所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，即靈芝菌株MnP產(chǎn)酶培養(yǎng)基，其每升組分含量為：磷酸二氫鉀1.0g，磷酸氫二鉀0.4g，硫酸鎂0.5g，氯化鈣0.013g，酵母膏0.1g，氮元素26mmol(硝酸銨0.5g；L‐天冬酰胺1.5g)，維生素B₁0.0025g，吐溫‐802.0mL，微量元素溶液1.0mL，葡 萄糖(1％W/V)10g，用氫氧化鉀(2mol/L)和鹽酸(2mol/L)將培養(yǎng)基調(diào)至pH 6.0。其中微量元素溶液配方如下(1L)：檸檬酸鐵4.8g，七水硫酸鋅2.64g，四水二氯化錳2.0g，六水二氯化鈷0.4g，五水硫酸銅0.4g。

所述的離心處理是指：在4℃環(huán)境下以3000g離心機中離心5min。

所述的靈芝菌絲體是指：經(jīng)過復壯、液體培養(yǎng)后獲得的懸浮在培養(yǎng)液中的靈芝菌絲體和培養(yǎng)液的復合體。

所述的破壁均質(zhì)是指：將收集的孢子粉加入粗酶液中，經(jīng)充分震蕩后通過高壓均質(zhì)實現(xiàn)破壁，得到孢子粉懸濁液。

所述的充分震蕩是指：在25‐28℃的恒溫搖床中充分震蕩6‐12h。

所述的高壓均質(zhì)是指：在4℃、1000MPa的環(huán)境下均質(zhì)破壁并循環(huán)5次。

所述的濃縮干燥是指：濃縮時采用減壓濃縮，溫度在55℃以下；使用微波真空低溫干燥機干燥，干燥溫度在55℃以下。

所述的靈芝是指：我國衛(wèi)生部2001年發(fā)布的《可用于保健食品的真菌菌種名單》中的赤靈芝(Ganoderma lucidum)、紫芝(Ganoderma sinensis)或松杉靈芝(Ganoderma tsugae)，進一步優(yōu)選為公開購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC)的靈芝51562或靈芝00679菌株。

所述的靈芝孢子粉是指：在靈芝子實體生長發(fā)育達到成熟后，從菌管中彈出的一種用于繁殖的擔孢子。

技術(shù)效果

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果包括：

(1)本發(fā)明利用靈芝菌絲在特殊的培養(yǎng)基上液體發(fā)酵產(chǎn)生的粗酶液(其中含錳過氧化物酶等多種酶)破壁靈芝孢子粉，比單一的商業(yè)化酶破壁效果好，成本低。

(2)改善活性成分，增加藥用效果。誘導產(chǎn)酶的靈芝菌絲，在產(chǎn)酶的同時能分泌多重活性成分在培養(yǎng)液中，利用該方法破壁孢子粉后檢測的靈芝多糖、三萜含量，比未經(jīng)破壁的孢子粉重的含量明顯提高。

(3)高壓均質(zhì)機均質(zhì)過程在4℃條件下進行，避免加工過程高溫帶來的有效成分的損失，最大限度地保留了孢子粉中原有的活性成分。

(4)避免其它物理方法加工過程中由于粉碎技術(shù)帶來的金屬離子超標帶來的安全隱患。

附圖說明

圖1為本發(fā)明工藝示意圖。

圖2為實施例葡萄糖的標準曲線示意圖。

圖3為實施例熊果酸溶液的標準曲線示意圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例1

本實施例涉及靈芝液體菌種的制備，具體包括以下步驟：

步驟1.培養(yǎng)基的制作

(1)PDA固體培養(yǎng)基制作

配制方法：去皮馬鈴薯200g用700‐800mL蒸餾水煮30‐40min至爛，用4層紗布過濾后溶入葡萄糖20g，KH₂PO₄5g，MgSO₄·7H₂O 3g，維生素B₁0.01g，定容至1000mL，調(diào)pH值至6.5‐7.0，加入瓊脂粉16～18g，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高壓滅菌，冷至60℃時倒平板，4℃保存。

(2)靈芝預培養(yǎng)培養(yǎng)基制作

配制方法：稱取蔗糖35g，蛋白胨(NIHON SEIYAKU公司)5g；酵母粉(MERCK公司)25g；KH₂PO₄·H₂O 1g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；維生素B₁0.05g于燒杯中，加入800mL去離子水，充分攪拌溶解，再補水至1000mL；調(diào)pH值到5.5，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高壓滅菌，4℃保藏。

步驟2.預培養(yǎng)：由試管斜面或培養(yǎng)皿平板固體培養(yǎng)基上的靈芝(Ganoderma lucidum，菌株編號51562以及00679，均公開購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC))菌絲按照常規(guī)方法接至PDA固體培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)7d；

步驟3.擴大培養(yǎng)：用接種鏟將1cm²左右的平板菌種接至裝有20‐40mL液體靈芝預培養(yǎng)培養(yǎng)基的150mL三角瓶中搗碎；靜置2‐3d活化后，將三角瓶放入28℃恒溫振蕩器中120rpm培養(yǎng)4‐6d；然后將150mL三角瓶中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入500mL或1L三角瓶中(前者加入100mL，后者加入200mL液體靈芝預培養(yǎng)培養(yǎng)基)放入28℃恒溫振蕩器中120rpm培養(yǎng)5‐7d，備用。

經(jīng)上述擴大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液清涼透明、菌絲球濃密，且均勻地懸浮在培養(yǎng)液中，培養(yǎng)結(jié)束。獲得的菌絲球懸浮液可用于固體發(fā)酵的液體菌種。

實施例2

本實施例涉及靈芝發(fā)酵培養(yǎng)誘導產(chǎn)酶及粗酶液的制備，具體包括以下步驟：

步驟1、培養(yǎng)基的制作

(1)靈芝菌株MnP產(chǎn)酶培養(yǎng)基(1L)：磷酸二氫鉀1.0g，磷酸氫二鉀0.4g，硫酸鎂0.5g，氯化鈣0.013g，酵母膏0.1g，氮元素26mmol(硝酸銨0.5g；L‐天冬酰胺1.5 g)，維生素B₁0.0025g，吐溫‐802.0mL，微量元素溶液1.0mL，葡萄糖(1％W/V)10g，用氫氧化鉀(2mol/L)和鹽酸(2mol/L)將培養(yǎng)基調(diào)至pH 6.0。其中微量元素溶液配方如下(1L)：檸檬酸鐵4.8g，七水硫酸鋅2.64g，四水二氯化錳2.0g，六水二氯化鈷0.4g，五水硫酸銅0.4g。

(2)培養(yǎng)基的制作：按照上述配方配制好培養(yǎng)基后，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高壓滅菌，4℃保存。

步驟2、靈芝菌絲體誘導產(chǎn)酶及粗酶液的制備

用移液管取10mL實施例1中制備得到的預培養(yǎng)的含菌球的液體，加入含100mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，放入28℃恒溫搖床中120rpm培養(yǎng)5‐8d，再置于4℃，3000g離心機中離心5min，取上清液，即為靈芝菌絲誘導產(chǎn)生的粗酶液。

粗酶液的質(zhì)量以測定錳過氧化物酶(MnP)的活性而定。

步驟3、MnP酶活力測定方法

(1)MnP活力定義：定義1min催化1μmol底物的酶量為一個酶活單位(U)。

(2)操作步驟：準確移取100mM丙二酸‐丙二酸鈉緩沖液0.5mL于容積為1.4mL的比色皿中，加入10mM MnSO₄溶液0.1mL。準確加入待測酶液XμL(X＝0‐50)，加入無菌水(400‐X)μL。30℃水浴加熱，加入濃度為10mM H₂O₂溶液0.01mL啟動反應，迅速測定270nm處的吸光度，1min后再測定一次，計算二者之差，即為每分鐘的吸光度變化(OD₂₇₀變化)。

(3)Mnp活力計算：每升酶液所含有的酶活量計算公式如下：

$\left(\mathrm{MnP}\right)=\frac{{\mathrm{\ΔOD}}_{270}/1\mathrm{cm}}{{11590\mathrm{mol}}^{-1}\×{L\×\mathrm{cm}}^{-1}}\×\frac{{10}^6\mathrm{\μmol}}{\mathrm{mol}}\×\frac{{10}^{-3}L}{\mathrm{mL}}\×1.01\mathrm{mol}\÷\frac{X}{{10}^6}L$

$=\frac{{\mathrm{\ΔOD}}_{270}}{11.59}\×1.01\×\frac{{10}^6}{X}(V/L)$

其中，錳過氧化物酶氧化Mn²⁺為Mn³⁺，Mn³⁺與丙二酸形成的復合物在270nm下的摩爾吸光系數(shù)為11590mol·L·cm_‐¹。

對經(jīng)過產(chǎn)酶培養(yǎng)2種靈芝菌絲得到的含MnP酶液進行酶活力的測定，得到兩種酶液中的MnP酶活力為：靈芝Ganoderma lucidum51562為232.38(U/g)，靈芝Ganodermalucidum00679為871.44(U/g)。

實施例3

本實施例涉及利用粗酶液破壁靈芝孢子粉，具體包括以下步驟：

步驟1、破壁方法

稱取10g靈芝孢子粉分別置于150mL的三角瓶中，再加入50‐100mL利用赤芝(Ganoderma lucidum)(編號：00679)以及靈芝(Ganoderma lucidum)(編號：51562)菌絲制備的 粗酶液制成懸浮液，并標記為C和B號樣品；然后將三角瓶置于25‐28℃恒溫搖床中充分震蕩，反應時間為6‐12h，反應完畢后，懸浮液混勻，4℃下利用高壓均質(zhì)機在1000MPa的壓力下均質(zhì)破壁，循環(huán)5次。處理過的孢子粉懸濁液用于進一步的加工。

步驟2、破壁率的測定

取破壁前的孢子粉1g，放在曲面玻璃上，進行4小時的真空干燥(≤50℃)，用分析天平(精度±0.1μg)分別稱取干燥孢子粉2μg，放入10mL的試管中，用移液器分別在試管中加入2mL的蒸餾水，并振蕩攪拌5min成懸濁液待用。用移液器分別吸取少許制備的破壁前后的孢子粉懸濁液滴入血球計數(shù)板上，并在顯微鏡下觀察，并按規(guī)定計數(shù)帶入公式：(A–B)/A₀。A為破壁前完整的孢子數(shù)，B為破壁后完整的孢子數(shù)。

結(jié)果顯示：孢子粉的破壁率≥95％。

實施例4

本實施例涉及靈芝孢子粉破壁前后多糖含量的測定(苯酚硫酸法)，具體包括以下步驟：

采用實施例3中收集的樣品進行下列實驗。

步驟1.標準曲線的繪制

精密稱取一定重量的樣品,于105℃干燥至恒重；準確稱取已干燥恒重的葡萄糖0.5000g，加水溶解，定容至50mL，作為葡萄糖標準儲備液(此溶液1mL含10.0mg葡萄糖)。準確吸取葡萄糖標準儲備液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，作為葡萄糖標準使用液(此溶液1mL含0.10mg葡萄糖)。

準確吸取葡萄糖標準使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL(相當于葡萄糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.l0mg)分別置于25mL比色管中，準確補充水至2.0mL，加入50mg/mL的苯酚溶液1.0mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL，于旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻后用分光光度計在490nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

步驟2.待測樣品溶液的制備：

①樣品提?。簻蚀_稱取三種待測樣品2.0g(精準至0.0001g)混勻，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，于沸水浴上加熱2h，冷卻至室溫后補水定容至100mL，混勻后過濾，棄去初濾液，收集余下濾液供沉淀多糖。

②沉淀粗多糖：準確吸?、僦薪K濾液5.0mL以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘渣用80％(v/v)乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄上清液，反復操作3～4次。殘渣用水溶解并 定容至5.0mL，混勻后，供沉淀葡聚糖。

③沉淀葡聚糖：準確吸?、谥薪K溶液2mL置于20mL離心管中，加入100g/L氫氧化鈉溶液2.0mL、銅試劑溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷卻，以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用10％(v/v)硫酸溶液2.0mL溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度定容，混勻。此溶液為樣品測定液。

步驟3.葡聚糖糖含量測定

準確吸取樣品測定液2.0mL置于25mL比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL于旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻至室溫，用分光光度計在490nm波長處，以試劑空白為參比，1cm比色皿測定吸光度值。依據(jù)標準曲線計算樣品中葡萄糖含量。同時做樣品空白實驗。

測定結(jié)果

(1)回歸方程。按照王亞光《保健食品功效成分檢測方法》(中國輕工業(yè)出版社，2002)報道的方法，以葡萄糖糖質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，見圖2。葡萄糖含量和吸光度值經(jīng)回歸處理，回歸方程為y＝2.9191x+0.0834，R²＝0.9924(n＝7)，含量在0～0.1mg范圍內(nèi)線性比較好。

葡萄糖質(zhì)量和吸光度值經(jīng)回歸處理，回歸方程為y＝2.9191x+0.0834，R²＝0.9924(n＝7)，含量在0～0.1mg范圍內(nèi)線性比較好。

(2)樣品中β‐葡聚糖含量測定。通過添加酶液對孢子粉進行破壁測定其多糖含量，結(jié)果見表1。

表1 靈芝孢子粉破壁后多糖含量分析結(jié)果如下表所示。

注：表中樣品A為未添加酶液，B為添加靈芝Ganoderma lucidum51562菌絲產(chǎn)MnP酶液，C為添加靈芝Ganoderma lucidum00679菌絲產(chǎn)MnP酶液。

多糖作為靈芝抱子粉的有效生物活性成分之一，本實驗含量最高的是通過添加赤芝的酶液達到了0.082mg/mL，不添加酶液的含量最低0.065mg/mL，這說明添加粗酶液破壁靈芝孢子粉較未添加酶液破壁的孢子粉，多糖含量有明顯提高。

實施例5

本實施例涉及靈芝孢子粉破壁前后三萜類物質(zhì)含量的測定，具體包括以下步驟：

步驟1、標準曲線的繪制

精密吸取熊果酸標準對照溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，在548nm處測定吸光值，以熊果酸的毫克數(shù)為橫坐標，吸光值為縱坐標，作圖得到標準曲線與回歸方程，見圖2，回歸方程為y＝0.87211x+0.0580，R²＝0.9644(n＝5)，表示含量在0.0146～0.073mg范圍內(nèi)線性比較好。

步驟2、樣品吸光值及三萜含量分析結(jié)果

按照常規(guī)方法，對添加酶液輔助破壁靈芝孢子粉后，樣品中三萜的含量進行了測定，其結(jié)果見表2。

表2 靈芝孢子粉破壁后三萜類物質(zhì)含量測定結(jié)果

表3中樣品A為未添加酶液，B為添加靈芝Ganoderma lucidum51562菌絲產(chǎn)MnP酶液，C為添加靈芝Ganoderma lucidum00679菌絲產(chǎn)MnP酶液。

不添加酶液破壁孢子粉的三萜含量2.297mg/mL，而添加酶液破壁后三萜的含量都在3.0mg/mL以上，且都高于不添加酶液破壁的的孢子粉三萜含量，表明添加酶液破壁后的孢子粉較未添加酶液破壁的孢子粉，三萜類活性物質(zhì)含量明顯提高，這說明添加酶液對孢子粉的破壁有顯著提高三萜類物質(zhì)含量的效果。