本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種從山木瓜中提取的化合物的醫(yī)藥用途及其藥物組合物。

背景技術(shù)：

食管癌，是世界上致死率較高的惡性腫瘤之一。中國為世界上食管癌的主要發(fā)生國家之一，其發(fā)生率與日俱增。食管癌主要有兩種主要形式：食管鱗癌和食管腺癌。其中，食管鱗癌占已知食管癌數(shù)量的90％。食管癌的主要致死原因為轉(zhuǎn)移，其主要轉(zhuǎn)移部位為肺，肝，骨等部位。盡管人們尋找大量的方法治療食管癌，但因轉(zhuǎn)移的復(fù)雜性而見效甚微。故，針對食管癌的治療在世界上成為了難題。

藤黃屬植物在我國有21種，分布于廣東，廣西，云南等南部省區(qū)。研究表明，藤黃屬植物是尋找抗腫瘤候選藥物的重要源泉。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在提供一種山木瓜中提取的雙口山酮化合物Griffipavixanthone的新的醫(yī)藥用途及其藥物組合物和保健品。

具體地說，本發(fā)明的第一方面是提供了式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物在制備預(yù)防或治療食管癌轉(zhuǎn)移的藥物或保健品中的應(yīng)用：

在一優(yōu)選例中，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物是作為唯一的原料藥應(yīng)用于預(yù)防或治療食管癌轉(zhuǎn)移的藥物或保健品的制備中。

在另一優(yōu)選例中，所述的食管癌選自人食管癌細胞Eca109或人食管癌細胞KYSE150。

在另一優(yōu)選例中，所述的食管癌轉(zhuǎn)移為食管癌的肺轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的第二方面是提供了式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物在制備預(yù)防 或治療食管癌的藥物或保健品中的應(yīng)用。

在一優(yōu)選例中，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物是作為唯一的原料藥應(yīng)用于預(yù)防或治療食管癌的藥物或保健品的制備中。

在另一優(yōu)選例中，所述的食管癌選自人食管癌細胞Eca109或人食管癌細胞KYSE150。

本發(fā)明的第三方面是提供了一種可防治食管癌的藥物組合物，它包含治療有效量的式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物。

本發(fā)明還提供了一種可防治食管癌的保健品，它包含治療有效量的式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物。

本發(fā)明各個方面的細節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利要求的描述，本發(fā)明的特點、目的和優(yōu)勢將更為明顯。

附圖說明

圖1為Griffipavixanthone及陽性對照索拉菲尼(Sorafeinib,SFB)抑制人食管癌Eca109和KYSE150細胞株劃痕遷移的顯微鏡照片。

圖2為不同濃度的Griffipavixanthone抑制人食管癌細胞Eca109和KYSE150小室遷移24小時后的統(tǒng)計分析圖(**P<0.01,***P<0.001)，縱軸為穿孔的細胞百分比(與對照組相對比)，橫軸為Griffipavixanthone的濃度。

圖3為不同濃度的Griffipavixanthone抑制人食管癌細胞Eca109和KYSE150小室遷移24小時后染色圖。

圖4為Griffipavixanthone抑制人食管癌細胞Eca109和KYSE150小室侵襲24小時后的統(tǒng)計分析圖(*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001)，縱軸為穿過基底膜的細胞百分比(與對照組相對比)，橫軸為Griffipavixanthone(GPX)的濃度。

圖5為不同濃度的Griffipavixanthone作用Eca109和KYSE150細胞24小時后的抑制人食管癌細胞侵襲的染色圖。

圖6為Griffipavixanthone作用48小時后抑制Eca109和KYSE150食管癌細胞克隆增殖的染色圖。

圖7a、7b、7c和7d為Griffipavixanthone及索拉菲尼(陽性對照)作用48小時后誘導(dǎo)Eca109和KYSE150食管癌細胞G2/M周期阻滯的流式圖。

圖8a、8b和8c為不同濃度的Griffipavixanthone及索拉菲尼(陽性對照)誘導(dǎo)Eca109和KYSE150食管癌細胞周期阻滯統(tǒng)計圖(*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001)。

圖9為尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型的動物隔天注射Griffipavixanthone(20mg/kg)35天后， Griffipavixanthone減少肺結(jié)節(jié)個數(shù)及減少肺結(jié)節(jié)面積的肺組織及其HE染色圖。

圖10為尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型的動物隔天注射Griffipavixanthone(20mg/kg)35天后，體內(nèi)肺結(jié)節(jié)個數(shù)的統(tǒng)計圖(*P<0.05，**P<0.01)。

圖11為尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型的動物隔天注射Griffipavixanthone(20mg/kg)35天后，肺重統(tǒng)計圖(*P<0.05，**P<0.01)。

具體實施方式

本發(fā)明的問世部分是基于這樣一個發(fā)現(xiàn)：從藤黃屬植物山木瓜中提取的雙口山酮化合物Griffipavixanthone可以顯著抑制食管癌細胞的生長、遷移和侵襲。因此，該化合物有望開發(fā)成為一種預(yù)防或者治療食管癌的藥物或保健品。

進而，本發(fā)明的第一方面是提供了式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物在制備預(yù)防或治療食管癌轉(zhuǎn)移的藥物或保健品中的應(yīng)用

較優(yōu)選地，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物是作為唯一的原料藥應(yīng)用于預(yù)防或治療食管癌轉(zhuǎn)移的藥物或保健品的制備中。

較優(yōu)選地，所述的食管癌選自人食管癌細胞Eca109或人食管癌細胞KYSE150。

較優(yōu)選地，所述的食管癌轉(zhuǎn)移為食管癌的肺轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的第二方面是提供了式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物在制備預(yù)防或治療食管癌的藥物或保健品中的應(yīng)用。

較優(yōu)選地，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物是作為唯一的原料藥應(yīng)用于預(yù)防或治療食管癌的藥物或保健品的制備中。

較優(yōu)選地，所述的食管癌選自人食管癌細胞Eca109或人食管癌細胞KYSE150。

本發(fā)明的第三方面是提供了一種可防治食管癌的藥物組合物，它包含治療有效量的式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物。

本發(fā)明還提供了一種可防治食管癌的保健品，它包含治療有效量的式(Ⅰ)化合物，或其可藥用鹽、前藥或水合物。

如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，本發(fā)明的雙口山酮化合物Griffipavixanthone具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式：

分子式C₃₆H₂₈O₁₂，分子量652.62，CAS號：219649-95-3

本發(fā)明的Griffipavixanthone可通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法從藤黃屬植物山木瓜枝Garcinia esculenta Y.H.等中提取獲得，亦可通過商業(yè)途徑購買或者利用市售原料，或通過現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)的化合物合成方法合成獲得。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有公知技術(shù)可以合成本發(fā)明的上述化合物。合成的本發(fā)明的上述化合物可以進一步通過柱色譜法、高效液相色譜法或結(jié)晶等方式進一步純化。其純度均符合藥用標準。

本發(fā)明的上述化合物包括但不限于其旋光異構(gòu)體、外消旋體和其他混合物。在那些情況下，單獨的對映體或非對映體，即光學(xué)活性形式可通過不對稱合成或通過外消旋體的拆分而獲得。外消旋體的拆分例如可通過常規(guī)方法如在拆分劑存在的情況下的結(jié)晶或使用例如手性高壓液相色譜(HPLC)柱的色譜法來實現(xiàn)。另外，這種化合物包括Z-和E-形式(或順式和反式形式)的具有碳碳雙鍵的化合物。在本文的上述化合物以多種互變異構(gòu)形式存在的情況下，其包括化合物的所有互變異構(gòu)形式。這種化合物還包括多晶型物和包合物的晶體形式。

本發(fā)明的上述化合物還包括其晶體和無定形形式，所述形式包括化合物的例如多晶型物、假多晶型物、溶劑合物、水合物、未溶劑合的多晶型物(包括無水物)、構(gòu)象多晶型物和無定形形式，以及它們的混合物?！熬w形式”、“多晶型物”和“新型形式”在本發(fā)明中可以互相交換使用，且旨在包括本發(fā)明化合物的所有晶體和無定形形式，所述形式包括例如多晶型物、假多晶型物、溶劑合物、水合物、未溶劑合的多晶型物(包括無水物)、構(gòu)象多晶型物和無定形形式，以及它們的混合物，除非指的是一種特定的晶體或無定形形式。本發(fā)明的化合物還包括所述化合物的藥用形式，所述形式包括螯合物、非共價絡(luò)合物、前藥及其混合物。

“藥用鹽”包括但不限于與無機酸的鹽，如鹽酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、亞磺酸鹽、硝酸鹽以及類似的鹽；以及與有機酸的鹽，如蘋果酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸 鹽、2-羥乙基磺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽和烷羧酸鹽如乙酸鹽、其中n＝0～4的HOOC-(CH₂)n-COOH以及類似的鹽。類似地，藥用陽離子包括但不限于納、鉀、鈣、鋁、鋰和銨。

另外，如果本發(fā)明的上述化合物作為酸加成鹽而獲得，則通過使酸鹽的溶液堿化可獲得游離堿。相反，如果產(chǎn)物是游離堿，則按照由堿性化合物制備酸加成鹽的常規(guī)程序，通過將游離堿溶解于合適的有機溶劑中并用酸對所述溶液進行處理可以產(chǎn)生加成鹽，特別是藥用加成鹽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會確認可用于制備無毒的藥用加成鹽的多種合成方法。

如上所述，前藥也落在本發(fā)明的上述化合物的范圍內(nèi)。在一些實施方式中，本發(fā)明所述的“前藥”包括當對患者給藥時，例如在前藥的代謝加工時，變成本發(fā)明的上述化合物的任何化合物。前藥的實例包括本發(fā)明的上述的化合物中官能團如羧酸基團的衍生物。羧酸基團的示例性前藥包括但不限于羧酸酯如烷基酯、羥烷基酯、芳烷基酯和芳氧基烷基酯。

“溶劑合物”由溶劑和化合物的相互作用而形成。術(shù)語“化合物”旨在包括化合物的溶劑合物。類似地，“鹽”包括鹽的溶劑合物。合適的溶劑合物是藥用溶劑合物，如包括一水合物和半水合物的水合物。

“螯合物”由化合物在兩個(或多個)點處對金屬離子的配位而形成。術(shù)語“化合物”旨在包括化合物的螯合物。類似地，“鹽”包括鹽的螯合物。

“非共價絡(luò)合物”由化合物和另一種分子的相互作用而形成，其中在化合物和所述分子之間不形成共價鍵。例如，絡(luò)合可通過范德華相互作用、氫鍵和靜電相互作用(也稱作離子鍵合)而發(fā)生。這種非共價絡(luò)合物也包括在術(shù)語“化合物”中。

本發(fā)明的Griffipavixanthone可以單獨使用或以藥物組合物的形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的本發(fā)明的Griffipavixanthone及可藥用載體。較佳的，本發(fā)明的藥物組合物含有0.1～99.9％重量百分比的作為活性成分的本發(fā)明的Griffipavixanthone。“可藥用載體”不會破壞本發(fā)明的Griffipavixanthone的藥學(xué)活性，同時其有效用量，即能發(fā)揮藥物載體作用時的用量對人體無毒。

所述可藥用載體包括但不限于：軟磷脂、硬脂酸鋁、氧化鋁、離子交換材料、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)、吐溫或其他表面活化劑、血清蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅酸鎂、飽和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

其他常用的藥物輔料如粘合劑(如微晶纖維素)、填充劑(如淀粉、葡萄糖、無水乳糖和 乳糖珠粒)、崩解劑(如交聯(lián)PVP、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素)、潤滑劑(如硬脂酸鎂)以及吸收促進劑、吸附載體、香味劑、甜味劑、賦形劑、稀釋劑、潤濕劑等。

本發(fā)明的Griffipavixanthone以及其藥物組合物可按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備并可以通過腸道或非腸道或局部途徑給藥。口服制劑包括膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等；非腸道給藥制劑包括注射液等；局部給藥制劑包括霜劑、貼劑、軟膏劑、噴霧劑等。優(yōu)選為口服制劑。

本發(fā)明的Griffipavixanthone以及其藥物組合物的給藥途徑可以為口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或皮下、皮膚粘膜、靜脈、尿道、陰道等。

除了制成藥劑之外，亦可在本發(fā)明的Griffipavixanthone中加入抗氧化劑、色素、酶制劑等各種食品添加劑，按本領(lǐng)域的常規(guī)方法制成保健食品。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數(shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本專利說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

實施例1從山木瓜中提取獲得Griffipavixanthone

1.1實驗材料

山木瓜枝于2010年8月采集于中國云南怒江。由周元川教授鑒定為Garcinia esculenta Y.H.L的枝。植物標本存放于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(植物標本號：20100801)。

1.2實驗方法

山木瓜枝干燥后粉碎(4kg)，用石油醚滲濾提取(5×20L，每次2天)。將提取液合并后減壓濃縮至干，得到石油醚部位(組份I，40g)。滲濾提取剩下的藥渣用80％乙醇熱回流提取(v/v，5×20L)。將提取液合并后減壓濃縮至干，殘渣用水溶解(5L)，形成混懸液，然后 用乙酸乙酯萃取(5×5L)，分別得到組份II(50g，乙酸乙酯部位)和III(萃取剩下的水部位)。提取剩下的藥材用蒸餾水熱回流提取(5×20L)得到組份IV。

乙酸乙酯部位經(jīng)MCI吸附后(組份II)，依次用30％，60％，90％，100％EtOH和EtOAc洗脫，分別得到組份IIA-IIE。其中組份IIC(14g)用C₁₈柱進行分離，用MeOH-H₂O(60:40-100:0)進行梯度洗脫，通過TLC點板合并得到9個組份(IIC1-IIC9)。組份IIC6進一步用C18進行分離，MeOH-H₂O梯度洗脫(45:55-100:0)得到組份IIC6a-IIC6d。組份IIC6c用Sephadex LH-20進行純化，甲醇梯度洗脫得到化合物Griffipavixanthone(108mg)。

1.3實驗結(jié)果

從山木瓜中分離得到的化合物Griffipavixanthone，經(jīng)核磁及質(zhì)譜檢測，化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示：

實施例2Griffipavixanthone抑制人食管癌細胞劃痕遷移

2.1實驗材料

人食管癌細胞Eca109購自上海中國科學(xué)院生化細胞所，KYSE150由上海復(fù)旦大學(xué)癌癥中心贈予。

RPMI1640購自美國Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和鏈霉素購自美國Invitrogen公司，索拉菲尼購自Selleck Chemicals公司。

2.2實驗方法

人食管癌細胞Eca109和KYSE150用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

人食管癌細胞Eca109和KYSE150于對數(shù)生長期接種于24孔板(1×10⁵個細胞/孔)，等細胞單層長滿后，用100μl槍頭劃痕，計為0小時，同時加入不同濃度的藥物和索拉菲尼(20μM/孔)，分別于36和12小時候后觀察，并在顯微鏡下成像。

2.3實驗結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，Griffipavixanthone與索拉菲尼都能夠顯著性地抑制Eca109和KYSE150 細胞劃痕遷移，說明Griffipavixanthone能夠濃度依賴性地抑制人食管癌細胞Eca109和KYSE150遷移。

實施例3Griffipavixanthone抑制人食管癌細胞小室遷移。

3.1實驗材料：

RPMI1640購自美國Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和鏈霉素購自美國Invitrogen公司。

Transwell購自于美國Corning公司。

3.2實驗方法：

人食管癌細胞Eca109和KYSE150用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

人食管癌細胞Eca109和KYSE150(5×10⁴個細胞/孔)接種于小室(8μm孔徑)上室中。上室無血清，下室10％血清。藥物與細胞作用24小時后，取出小室，棄培養(yǎng)基，用棉簽輕輕地擦去上室未遷移細胞，固定于4％多聚甲醛，用0.1％結(jié)晶紫染色，并于顯微鏡下計數(shù)，照片如圖3所示。實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，以O(shè)ne-Way ANOVA方式進行方差分析，兩兩比較采用Student’s t-test法，**P<0.01，***P<0.001為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異標準。

3.3實驗結(jié)果

結(jié)果如圖2和圖3所示，Griffipavixanthone于5，10，15，20μM濃度下，能夠濃度依賴性地抑制Eca109和KYSE150細胞小室遷移。

實施例4Griffipavixanthone抑制人食管癌細胞侵襲

4.1實驗材料：

RPMI1640購自美國Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和鏈霉素購自美國Invitrogen公司。

Transwell購自于美國Corning公司。Matrigel購自于美國BD公司。

4.2實驗方法：

人食管癌細胞Eca109和KYSE150用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

細胞遷移實驗所用小室(8μm孔徑)用Matrigel孵育2h后，人食管癌細胞Eca109(1×10⁵個細胞/孔)接種于無血清小室上室中，下室10％血清。細胞在藥物作用于24小時后，取出 小室，棄培養(yǎng)基，用棉簽輕輕地擦去上室未侵襲細胞，固定于4％多聚甲醛，用0.1％結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下計數(shù)。實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，以O(shè)ne-Way ANOVA方式進行方差分析，兩兩比較采用Student’s t-test法，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異標準。

4.3實驗結(jié)果

結(jié)果如圖4和圖5所示，Griffipavixanthone于5，10，15，20μM濃度下能夠濃度依賴性地抑制Eca109和KYSE150細胞侵襲。實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，以O(shè)ne-Way ANOVA方式進行方差分析，兩兩比較采用Student’s t-test法，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異標準。

實施例5Griffipavixanthone抑制人食管癌克隆增殖

5.1實驗材料：

RPMI1640購自美國Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和鏈霉素購自美國Invitrogen公司。

5.2實驗方法：

人食管癌Eca109和KYSE150細胞用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

將人食管癌細胞Eca109(500個細胞/孔)和KYSE150(250個細胞/孔)接種于6孔板中。Griffipavixanthone或者索拉菲尼(20μM/孔)作用48小時后，細胞繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。在第7天，細胞用4％多聚甲醛固定，用0.1％結(jié)晶紫染色，并于顯微鏡下拍照呈像。

5.3實驗結(jié)果

結(jié)果如圖6所示，Griffipavixanthone于5，10，15，20μM濃度下能夠抑制Eca109和KYSE150的克隆增殖，相同結(jié)果也可以在索拉菲尼組觀察到。說明Griffipavixanthone能夠濃度依賴性地抑制人食管癌細胞增殖。

實施例6Griffipavixanthone誘導(dǎo)人食管癌細胞周期阻滯

6.1實驗材料：

RPMI1640購自美國Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和鏈霉素購自美國Invitrogen公司。

6.2實驗方法：

人食管癌Eca109和KYSE150細胞用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶消 化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

將人食管癌細胞Eca109和KYSE150(2×10⁵個細胞/孔)接種于6孔板中。待Griffipavixanthone或者索拉菲尼(20μM/孔)作用48小時后，收集細胞，固定于70％乙醇中，在4℃冰箱中過夜。細胞用含RNaseA酶的PI在37℃中孵育30分鐘，并用流式細胞儀觀測分析。

6.3實驗結(jié)果

結(jié)果如圖7(a、b、c、d)和圖8(a、b、c)所示，Griffipavixanthone于5，10，15，20μM濃度下能夠誘導(dǎo)Eca109和KYSE150細胞G2/M周期阻滯，與索拉菲尼的效果一致，說明Griffipavixanthone能夠通過誘導(dǎo)G2/M期阻滯，從而濃度依賴性地抑制人食管癌細胞增殖。實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，以O(shè)ne-Way ANOVA方式進行方差分析，兩兩比較采用Student’s t-test法，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異標準。

實施例7Griffipavixanthone抑制體內(nèi)食管癌的肺轉(zhuǎn)移

7.1實驗材料：

RPMI1640購自美國Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和鏈霉素購自美國Invitrogen公司。

Bouin’s solution購自美國Sigma公司。

7.2實驗方法：

人食管癌KYSE150細胞用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

將人食管癌KYSE150細胞(1×10⁶個細胞/只)尾靜脈注射于6周齡雄性裸鼠體內(nèi)。將小鼠隨機分為三組，每組8只，隔天腹腔注射溶劑對照(DMSO)、Griffipavixanthone(20mg/kg)和5-FU(20mg/kg)。35天后，將肺從體內(nèi)取出，稱重，用Bouin’s solution固定，切片，HE染色，并統(tǒng)計肺結(jié)節(jié)個數(shù)。

7.3實驗結(jié)果

結(jié)果如圖9、10和11所示，Griffipavixanthone于20mg/kg濃度下顯著地抑制KYSE150體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移，能使肺結(jié)節(jié)個數(shù)減少，肺重和肺結(jié)節(jié)面積變小。說明Griffipavixanthone可以抑制食管癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移。實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，以O(shè)ne-Way ANOVA方式進行方差分析，兩兩比較采用Student’s t-test法，*P<0.05，**P<0.01，為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異標準。

本發(fā)明所涉及的多個方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神之前提下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可對其進行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請所附權(quán)利要求的覆蓋范圍。