本發(fā)明涉及抗胃癌藥物，具體地說是蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物在抗胃癌藥物中的應(yīng)用，所述的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物包括沙蟾毒精，沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，遠華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯，遠華蟾毒精，去乙酰華蟾毒精，華蟾毒它靈-3-辛二酰精氨酸酯，南美蟾毒精-3-辛二酰精氨酸酯，3-去氫蟾毒靈和海蟾蜍毒及它們藥學上可接受的成鹽化合物。

背景技術(shù)：

蟾蜍是一種中醫(yī)臨床常用的藥用原動物，其蟾皮及制劑在治療肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、食道癌及結(jié)腸癌等腫瘤療效確切。目前在臨床抗腫瘤治療應(yīng)用較為廣泛的主要有華蟾素注射液及華蟾素膠囊，其中蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物和極性含氮化合物被認為是蟾皮中的主要有效成分。然而由于蟾皮本身成分的復雜性，在臨床使用中不乏副反應(yīng)的報道，比如過敏反應(yīng)、粒細胞缺乏及心臟毒性較大等，顯著降低了其藥用價值。若能借助于先進的活性篩選評價體系，合理評價化合物的抗腫瘤活性，將有利于開發(fā)新的抗腫瘤藥物。(Natural Product Reports,2011,28,953-969；Nature Reviews Drug Discovery,2008,7,926-935；Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2014,92,105-113；Analytical Methods,2014,6,5183-5190.)

與傳統(tǒng)的二維(2D)培養(yǎng)細胞評價抗腫瘤活性相比，三維(3D)培養(yǎng)細胞篩選評價技術(shù)能夠更為準確的反映腫瘤體內(nèi)的微環(huán)境，如細胞異質(zhì)性、營養(yǎng)物、氧梯度、細胞-細胞作用、基質(zhì)沉淀物和基因表達等，因此其評價結(jié)果與體內(nèi)效果更為的接近。在3D細胞培養(yǎng)技術(shù)中，多細胞形成的三維細胞球是最為方便、典型、通用的技術(shù)。目前形成細胞球的方法主要有自發(fā)聚集、旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、基質(zhì)鍵合板、聚合支架及微孔板法。這些方法各有優(yōu)缺點，但這些方法都不能兼具既簡單、快速又標準化的方法。在本發(fā)明中，我們采用了一種簡單、快速、可重復及標準化的3D細胞球形成技術(shù)，系統(tǒng)研究了蟾皮中蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的抗胃癌活性。(Nature Reviews Molecular Cell Biology,2007,8,839-845；Drug Discovery Today,2009,14,102-107；Carcinogenesis,2011,32,1540-1549；Oncogene,2009,28,461-468；Experimental Cell Research,2013,319,75-87；Nature Protocols,2009,4,309-324.)

目前關(guān)于本發(fā)明中提到的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的抗胃癌活性尚未報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及抗胃癌藥物的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明目的之一是提供具有抗胃癌作用的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物藥物，所述的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物包括沙蟾毒精、沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯、遠華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒精、華蟾毒它靈-3-辛二酰精氨酸酯、南美蟾毒精-3-辛二酰精氨酸酯、 3-去氫蟾毒靈和海蟾蜍毒(分別對應(yīng)于下述的結(jié)構(gòu)式1-9)及它們藥學上可接受的成鹽化合物，其結(jié)構(gòu)如下；目的之二是建立更接近與體內(nèi)療效的3D細胞球篩選模型。

體外細胞實驗表明，本發(fā)明中所述的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物能夠顯著抑制胃癌細胞球的生長，因此可以用于制備治療胃癌的藥物。

附圖說明

圖1不同接種密度的HGC-27細胞經(jīng)3D培養(yǎng)形成的細胞球隨著時間的增長曲線；

圖2不同的蟾蜍二烯內(nèi)酯內(nèi)化合物(10μM)對HGC-27細胞球生長的抑制作用隨時間的變化曲線。1-沙蟾毒精，2-沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，3-遠華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯，4-遠華蟾毒精，5-去乙酰華蟾毒精，6-華蟾毒它靈-3-辛二酰精氨酸酯，7-南美蟾毒精-3-辛二酰精氨酸酯，8-3-去氫蟾毒靈，9-海蟾蜍毒，10-多烯紫杉醇，11-鹽酸表柔比星；

圖3不同蟾蜍二烯內(nèi)酯內(nèi)化合物(10μM)對HGC-27細胞球生長的抑制能 力的比較(第6天)，0為對照組；

圖4不同濃度化合物5-去乙酰華蟾毒精對HGC-27細胞球生長的抑制作用隨時間的變化曲線，濃度單位為μmol/L,簡寫為μM；

圖5化合物5-去乙酰華蟾毒精對HGC-27細胞球生長的抑制作用隨濃度的變化曲線(第6天)，濃度單位為mol/L,簡寫為M。

具體實施方式

現(xiàn)結(jié)合實例，對本發(fā)明做進一步說明。實例僅限于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限定。

實施例1：胃癌3D細胞球篩選模型的建立

沙蟾毒精，沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，遠華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯，遠華蟾毒精，去乙酰華蟾毒精，華蟾毒它靈-3-辛二酰精氨酸酯，南美蟾毒精-3-辛二酰精氨酸酯，3-去氫蟾毒靈和海蟾蜍毒來源于上海源葉生物科技有限公司。

多烯紫杉醇和鹽酸表柔比星購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；胃癌細胞系HGC-27購于中國科學院上海細胞庫；ULA-96孔板購于Corning；倒置顯微鏡購于OLYMPUS。

將處于對數(shù)生長期的HGC-27細胞接種于ULA-96孔板中，密度分別為20000個/孔(20K個/孔),10000個/孔，5000個/孔，2500個/孔，1250個/孔，625個/孔，313個/孔和156個/孔，培養(yǎng)基(RPMI-1640含20％胎牛血清)接種體積為200μL/well,每個細胞密度各2孔，且重復兩次，每隔24h使用倒置顯微鏡記錄3D細胞球的大小，連續(xù)記錄4天。其結(jié)果如圖1所示。根據(jù)3D細胞球連續(xù)4天生長的狀態(tài)及第4天細胞球的大小，確定最佳的細胞密度。最佳的細胞密度一般為細胞球具有最快的生長速度并且在第4天時細胞球的直徑大小落入范圍300μm～500μm之中，因為在此范圍內(nèi)3D細胞球的狀態(tài)更接近與體內(nèi)腫瘤的狀態(tài)，更有利于抗癌藥物的篩選。根據(jù)圖1可以看出滿足上述要求的最佳細胞密度為313個/孔。

實施例2：粗篩蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物對3D細胞球生長的抑制作用

選擇臨床上治療胃癌的典型藥物多烯紫杉醇和鹽酸表柔比星作為陽性對照藥，粗篩9種典型的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物對HGC-27的3D細胞球生長的抑制作用。其中9種典型的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物(作為粗篩藥物)為沙蟾毒精，沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，遠華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯，遠華蟾毒精，去乙酰華蟾毒精，華蟾毒它靈-3-辛二酰精氨酸酯，南美蟾毒精-3-辛二酰精氨酸酯，3-去氫蟾毒靈和海蟾蜍毒。將最佳密度(313個/孔)的細胞接種于ULA-96孔板，培養(yǎng)基(RPMI-1640含20％胎牛血清)接種體積為200μL/well。培養(yǎng)4天，生長至最佳粒徑的3D細胞球之后，每孔置換100μL的新鮮培養(yǎng)基(RPMI-1640含20％胎牛血清)，在22個孔中分別加入單一藥物(包括2種陽性對照藥和9種典型的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物)終濃度為10μM，體積為10μL，每個化合物重復兩次。空白對照組為含0.05％DMSO的培養(yǎng)基(RPMI-1640含20％胎牛血清)處理的3D細胞球，兩個孔做空白對照組。每隔24h使用倒置顯微鏡記錄3D細胞球的大小，連續(xù)記錄6天。其結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，這些蟾蜍二烯內(nèi)酯內(nèi)化合 物對3D細胞球的生長都有一定的抑制作用。以第6天為研究的時間點，比較蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物對3D細胞球生長的抑制能力如圖3所示，發(fā)現(xiàn)研究的這些蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物對3D細胞球生長的抑制能力可與陽性對照藥多烯紫杉醇和鹽酸表柔比星的抑制能力相媲美，其中化合物5-去乙酰華蟾毒精可將細胞球抑制為對照組細胞球大小的39.2％，且這種化合物的抑制能力強于胃癌陽性對照藥的抑制能力，可將其作為抗胃癌藥物的候選化合物。

實施例3：去乙酰華蟾毒精抑制3D細胞球生長的劑量關(guān)系

將抑制能力最強的化合物5-去乙酰華蟾毒精的不同劑量作用于3D細胞球。將最佳密度(313個/孔)的細胞接種于ULA-96孔板，培養(yǎng)基(RPMI-1640含20％胎牛血清)接種體積為200μL/well培養(yǎng)4天，生長至最佳粒徑的3D細胞球之后，每孔置換100μL的新鮮培養(yǎng)基，在16個孔中加入化合物5藥物體積為10μL，化合物的濃度梯度為40μM,20μM,10μM,5μM,2.5μM,1.25μM,0.625μM和0.3125μM，每個濃度重復兩次?？瞻讓φ战M為含0.2％DMSO的培養(yǎng)基(RPMI-1640含20％胎牛血清)處理的細胞球，兩個孔做空白對照組。每隔24h使用倒置顯微鏡記錄3D細胞球的大小，連續(xù)記錄6天，其結(jié)果如圖4所示。以第6天為研究的時間點，研究蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物對3D細胞球生長的抑制劑量關(guān)系如圖5所示。從圖中可以看出，隨著化合物劑量的升高，化合物5-去乙酰華蟾毒精的抑制能力增強，其劑量抑制曲線呈現(xiàn)單相“S”型，對應(yīng)的IC₅₀值為1.21±0.11μM。

通過3D細胞球模型的活性篩選，發(fā)現(xiàn)研究的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物對胃癌的3D細胞球的生長都有一定的抑制作用，其抑制能力可與胃癌陽性對照藥的抑制能力相媲美，其中去乙酰華蟾毒精對胃癌3D細胞球生長的抑制能力最強，其抑制能力強于胃癌陽性對照藥的抑制能力，此活性化合物的發(fā)現(xiàn)為抗胃癌藥物的開發(fā)提供了候選化合物。