本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種抑制骨關(guān)節(jié)炎的microRNA及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病，患病率高，累及超過(guò)半數(shù)的65歲以上人群，列全球致殘疾病第六位，每年有2億多人因?yàn)镺A造成的癥狀而求醫(yī)。OA主要病變是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變，滑膜炎和繼發(fā)性骨贅形成。好發(fā)于負(fù)重大的膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、脊柱及頻繁活動(dòng)的手指關(guān)節(jié)等部位，這與人類直立行走和精細(xì)頻繁的手指活動(dòng)不無(wú)關(guān)系。OA導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨髓腔纖維化以及軟骨下骨硬化，造成患者關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)障礙和關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。OA的發(fā)病原因尚不完全清楚，它的發(fā)生發(fā)展是一種長(zhǎng)期、慢性、漸進(jìn)的病理過(guò)程，年齡、肥胖、機(jī)械損傷和遺傳是主要的危險(xiǎn)因素。隨著老年人口迅速增多，骨關(guān)節(jié)炎對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的影響將更為顯著。目前臨床上大多數(shù)的治療方法如止痛、物理治療和關(guān)節(jié)腔注射等只能緩解疾病的癥狀，并不能阻止軟骨破壞的進(jìn)展和骨贅形成。OA發(fā)展至晚期關(guān)節(jié)軟骨顯著剝脫，關(guān)節(jié)功能喪失并最終致殘，只能進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換。因此需要研發(fā)新的治療手段來(lái)干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)重塑和破壞的關(guān)鍵階段，阻止疾病的進(jìn)展，促進(jìn)關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)。

BMP家族中的生長(zhǎng)分化因子5(Growth and Differentiation Factor 5，GDF-5)參與調(diào)控關(guān)節(jié)的形成。GDF-5促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化，增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化能力。更為重要的是，Miyamoto等發(fā)現(xiàn)GDF-5啟動(dòng)子區(qū)域的rs143383SNP與髖關(guān)節(jié)OA有極強(qiáng)的相關(guān)性，與日本和中國(guó)人的膝關(guān)節(jié)OA也有相關(guān)性，并導(dǎo)致了GDF-5轉(zhuǎn)錄的下調(diào)。接著，rs143383的功能性變異被證實(shí)與白人的膝關(guān)節(jié)OA也存在關(guān)聯(lián)。這是少數(shù)幾個(gè)能達(dá)到全基因組相關(guān)性研究(GWAS)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并在不同研究中無(wú)異質(zhì)性的遺傳變異結(jié)果。上述研究高度提示：GDF-5對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)起著重要作用，本發(fā)明人推斷增加GDF-5的表達(dá) 或者加強(qiáng)它下游的信號(hào)通路可能對(duì)預(yù)防和治療OA有積極意義。

但是，GDF-5能否阻止軟骨基質(zhì)的降解？GDF-5的作用機(jī)制是什么？這些問(wèn)題都亟待解答。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抑制骨關(guān)節(jié)炎的microRNA及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種miR-17或其上調(diào)劑在制備預(yù)防、緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的miR-17上調(diào)劑包括：miR-17模擬物(miR-17 mimic)，miR-17激動(dòng)劑(Agomir-17)。

在另一優(yōu)選例中，所述的miR-17模擬物正向序列如SEQ ID NO:9所示，反向序列如SEQ ID NO:10所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的miR-17激動(dòng)劑的正向序列如SEQ ID NO:11所示，反向序列如SEQ ID NO:12所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的miR-17激動(dòng)劑在其反義鏈中進(jìn)行修飾：3’端膽固醇修飾，3’端四個(gè)硫代骨架修飾，5’端兩個(gè)硫代骨架修飾，，全鏈甲氧基修飾。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物還用于：抑制MMP3、MMP13、NOS2或ADAMTS5的表達(dá)。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種miR-17的用途，用于篩選緩解、預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種預(yù)防、緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物，所述的藥物是miR-17的上調(diào)劑，選自：

miR-17模擬物，其正向序列如SEQ ID NO:9所示，反向序列如SEQ ID NO:10所示；或

miR-17激動(dòng)劑，其正向序列如SEQ ID NO:11所示，反向序列如SEQ ID NO:12所示。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選預(yù)防、緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括：

(1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR-17的體系；和

(2)檢測(cè)所述體系中miR-17的表達(dá)；

其中，若所述候選物質(zhì)可提高miR-17(優(yōu)選顯著提高，如提高20％以上，較佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防、緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在物質(zhì)。

在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(1)包括：在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)miR-17的體系中；和/或

步驟(2)包括：檢測(cè)測(cè)試組的體系中miR-17的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miR-17的體系；

如果測(cè)試組中miR-17的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(優(yōu)選顯著高于，如提高20％以上，較佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)對(duì)照組，就表明該候選物是預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在物質(zhì)。

在另一優(yōu)選例中，所述的候選物質(zhì)可以是：基于miR-17或調(diào)控其表達(dá)的基因或蛋白而設(shè)計(jì)的大分子(如肽、過(guò)表達(dá)載體)或小分子(如化合物)。

在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自：細(xì)胞體系(或細(xì)胞培養(yǎng)物體系)、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于預(yù)防或治療骨代謝疾病有用的物質(zhì)。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。

附圖說(shuō)明

圖1、(左)沿髕韌帶做內(nèi)側(cè)切口打開(kāi)小鼠膝關(guān)節(jié)腔，然后鈍性分離脂肪墊并暴露出內(nèi)側(cè)半月板和內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶(MMTL)；(右)切斷MMTL后，半月板向內(nèi)側(cè)脫位。F＝腓骨；T＝脛骨；ACL＝前交叉韌帶。

圖2、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射GDF-5能阻止DMM引起的骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞(矢狀 位組織學(xué)切片觀察)。

Safranin O染色顯示假手術(shù)(A)或DMM(B，C，D)術(shù)后8周的關(guān)節(jié)軟骨破壞情況。術(shù)后第4周起，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PBS(A，B)或GDF-5(20＝20ng,100＝100ng)(C，D)，每周1次。E、F、G、H是A、B、C、D的局部放大圖。標(biāo)尺為150μm。

圖3、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射GDF-5能阻止DMM引起的骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞(冠狀位組織學(xué)切片觀察)。

Safranin O染色顯示假手術(shù)或DMM術(shù)后8周的關(guān)節(jié)軟骨破壞情況。術(shù)后第4周起，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PBS或GDF-5(20＝20ng,100＝100ng每針注射劑量)，每周1次。標(biāo)尺為150μm。

圖4、GDF-5抑制DMM術(shù)后骨贅的成熟。

Safranin O染色顯示假手術(shù)(A)或DMM(B，C，D)術(shù)后8周的骨贅形成情況。術(shù)后第4周起，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PBS(A，B)或GDF-5(20＝20ng,100＝100ng)(C，D)，每周1次。標(biāo)尺為100μm。

圖5、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射GDF-5能延緩DMM引起的骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞及骨贅成熟(組織學(xué)評(píng)分)。

假手術(shù)或DMM術(shù)后8周的關(guān)節(jié)軟骨的Mankin評(píng)分(n＝18)(A)及骨贅成熟度評(píng)分(n＝9)(B)。術(shù)后第4周起，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PBS或GDF-5(20＝20ng,100＝100ng)，每周1次。與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01(Mann-Whitney U test)。

圖6、GDF-5對(duì)軟骨細(xì)胞表型的調(diào)控。

(A，B)小鼠原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用IL-1β(5ng/ml)或IL-1β與不同濃度GDF-5(100＝100ng/ml，300＝300ng/ml)的混合液刺激，qRT-PCR檢測(cè)分解基因(A)和合成基因(B)的表達(dá)(n＝5)；(C，D)軟骨細(xì)胞用IL-1β(5ng/ml)和/或GDF-5(300ng/ml)刺激，Western blot檢測(cè)分解蛋白(C)和合成蛋白(D)的表達(dá)(n＝4)。與對(duì)照組比較，*P<0.01，**P<0.001(student’s t test)。

圖7、在軟骨細(xì)胞中，GDF-5對(duì)miR-17的調(diào)控作用。

(a)GDF-5(300ng/ml)作用于軟骨細(xì)胞24小時(shí)后，miRNA表達(dá)的變化情況。(b)qRT-PCR檢測(cè)GDF-5和/或IL-1β作用于小鼠軟骨細(xì)胞24小時(shí)后，miR-17的表達(dá)變化。

圖8、miR-17對(duì)IL-1β引起的分解表型的抑制作用。

(a，b)軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR inhibitor NC(100nM)或miR-17 inhibitor 24h后，用IL-1β和/或GDF-5作用于軟骨細(xì)胞36h，qPCR和Western blot檢測(cè)各分解基因的表達(dá)。

(c，d)軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR mimic NC(50nM)或miR-17 mimic 24h后，用IL-1β和/或GDF-5作用于軟骨細(xì)胞36h，qPCR和Western blot檢測(cè)各分解基因的表達(dá)。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。*P<0.01(ANOVA)。

圖9、MMP3、MMP13、NOS2、ADAMTS5的3’UTR熒光素酶實(shí)驗(yàn)。

圖10、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Agomir-17對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療效果。

(左)Safranin O染色顯示DMM術(shù)后8周的冠狀位關(guān)節(jié)軟骨破壞情況。術(shù)后第4周起，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Agomir-NC(1.5nmol)或Agomir-17(1.5nmol)，每周1次。(右)Mankin評(píng)分。n＝9，**P<0.01(Mann-Whitney U test)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)分化因子-5(Growth and Differentiation Factor-5，GDF-5)對(duì)miR-17具有調(diào)控作用，miR-17的上調(diào)對(duì)于緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎具有顯著的效果。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

miR-17及其治療用途

本發(fā)明中，所述的miR-17是具有SEQ ID NO:1所示核酸序列的小核糖核酸：

5’-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’(SEQ ID NO:1)。

所述的miR-17可以被分離自細(xì)胞，或者可通過(guò)人工合成的方式獲得。在得知了miR-17或其前體的序列后，本領(lǐng)域人員可以方便地制備獲得miR-17或 其前體。

基于本發(fā)明的闡述，miR-17是一個(gè)新的、與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)的藥物靶點(diǎn)。針對(duì)miR-17的各種治療手段可以作為防治動(dòng)物(特別是人)的骨關(guān)節(jié)炎的新穎且有效的手段。

并且，miR-17也可以用于作為藥物篩選的靶點(diǎn)，篩選通過(guò)提高miR-17的表達(dá)或活性而緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

miR-17上調(diào)劑的治療用途

基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，所述的miR-17的上調(diào)劑可用于制備緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的組合物，特別是藥物組合物。

所述的miR-17的上調(diào)劑是指任何可提高miR-17或其前體的活性、提高miR-17或其前體的穩(wěn)定性、上調(diào)miR-17或其前體的表達(dá)、增加miR-17或其前體有效作用時(shí)間的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對(duì)于上調(diào)miR-17有用的物質(zhì)，從而可用于緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的miR-17上調(diào)劑是miR-17的模擬物(mimics)或激動(dòng)劑(Agomir)，其具有與所述miR-17相同的效果，或者能夠提高miR-17的表達(dá)或活性。

所述的miR-17的上調(diào)劑可以是經(jīng)修飾的上調(diào)劑，所述的修飾包括：甲氧基化修飾、硫代修飾、膽固醇修飾、烷基修飾、鎖核酸修飾、肽核酸修飾、和/或磷酸骨架由磷脂連接代替的反義核苷酸；較佳地，所述的修飾包括：3’端進(jìn)行膽固醇修飾，5’端兩個(gè)硫代骨架修飾，3’端四個(gè)硫代骨架修飾，全鏈甲氧基修飾。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；較佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的miR-17或其上調(diào)劑(包括模擬物或激動(dòng)劑)，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎。

如本文所用，所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體：它們本身并 不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。

在得知了所述miR-17或其上調(diào)劑的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來(lái)將所述的miR-17或其上調(diào)劑或它們的藥物組合物給藥于哺乳動(dòng)物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等。

本發(fā)明所述的miR-17或其上調(diào)劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來(lái)確定(例如通過(guò)臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于：所述的miR-17或其上調(diào)劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的miR-17或其上調(diào)劑每天以約0.00001mg-50mg/kg動(dòng)物體重(較佳的0.0001mg-10mg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開(kāi)的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。

miR-17作為骨關(guān)節(jié)炎預(yù)后的標(biāo)志物

根據(jù)本發(fā)明人的研究成果，miR-17是一個(gè)新的、與骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)后密切相關(guān)的靶點(diǎn)。針對(duì)miR-17的各種檢測(cè)試劑可以用于骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)后，早期評(píng)估骨關(guān)節(jié)炎治療藥物的療效，優(yōu)化治療方案?？山逵蒻iR-17表達(dá)水平在用藥前后的高低，評(píng)判患者在治療后是否需要長(zhǎng)期用藥。

可采用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-17的存在與否以及表達(dá)情況，這些技術(shù)均包含在本發(fā)明中。例如可用已有的技術(shù)如原位雜交法，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)，Southern印跡法、DNA序列分析等，這些方法可結(jié)合使用。

本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)miR-17的存在與否以及表達(dá)情況的試劑。作為一種優(yōu)選方式，可以采用特異性擴(kuò)增miR-17的引物；或特異性識(shí)別miR-17的探針來(lái)確定miR-17的存在與否。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑是引物，其可特異性擴(kuò)增出miR-17。 更優(yōu)選的，所述的引物包括：SEQ ID NO:3所示的反轉(zhuǎn)錄引物。

針對(duì)miR-17的特異性探針的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)，例如，制備一種探針，其可與miR-17上特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，而不與miR-17以外的其它基因特異性結(jié)合，且所述探針帶有可檢測(cè)信號(hào)。

藥物篩選

在得知了miR-17與骨關(guān)節(jié)炎的密切相關(guān)性后，可以基于該特征來(lái)篩選提高miR-17的表達(dá)(及miR-17的上調(diào)劑)的物質(zhì)。可從所述的物質(zhì)中找到對(duì)于預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎真正有用的藥物。

因此，本發(fā)明提供一種篩選緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括：用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR-17的體系；和檢測(cè)所述體系中miR-17的表達(dá)；若所述候選物質(zhì)可提高miR-17的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在物質(zhì)。所述的表達(dá)miR-17的體系例如可以是細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)體系，所述的細(xì)胞可以是內(nèi)源性表達(dá)miR-17的細(xì)胞；或可以是重組表達(dá)miR-17的細(xì)胞。所述的表達(dá)miR-17的體系還可以是亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系(如動(dòng)物模型，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物的動(dòng)物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察到miR-17的表達(dá)的改變，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)miR-17的體系。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括：對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎真正有用的物質(zhì)。

本發(fā)明對(duì)于miR-17的表達(dá)、活性、存在量的檢測(cè)方法沒(méi)有特別的限制?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的基因定量或半定量檢測(cè)技術(shù)，例如(但不限于)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)，Southern印跡法等。

另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫(kù)，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谔岣適iR-17的表達(dá)和活性，進(jìn)而緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎有用的物質(zhì)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的制備

雄性C57BL/6小鼠從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買，飼養(yǎng)至10周齡，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作方法由同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。制備步驟如下：

(1)小鼠麻醉后，在膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做縱向切口，沿髕韌帶內(nèi)側(cè)打開(kāi)關(guān)節(jié)腔。

(2)鈍性分離髁間區(qū)的脂肪墊，找到連接內(nèi)側(cè)半月板的半月板脛骨韌帶并橫斷，如圖1。

(3)壓迫止血后關(guān)閉切口。

(4)于術(shù)后8周麻醉并處死小鼠，分離出膝關(guān)節(jié)做組織學(xué)檢測(cè)。

(5)小鼠隨機(jī)一側(cè)膝關(guān)節(jié)做DMM，另一側(cè)為對(duì)照關(guān)節(jié)。用于對(duì)照的關(guān)節(jié)包括未手術(shù)關(guān)節(jié)和假手術(shù)(暴露但不切斷韌帶)。

關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射GDF-5治療OA

GDF-5對(duì)DMM的干預(yù)作用：DMM術(shù)4周后，進(jìn)行GDF-5(購(gòu)自peprotech公司Catalog Number:315-24)注射，每周1次，共4次，即術(shù)后8周取材。劑量分為20ng、100ng兩組，以PBS為對(duì)照。進(jìn)行組織學(xué)染色、對(duì)軟骨破壞程度評(píng)分。

番紅(Safranin-O)/固綠(fast green)染色和組織學(xué)評(píng)分

關(guān)節(jié)軟骨的破壞程度通過(guò)Safranin-O/fast green染色情況來(lái)觀察，通過(guò)Mankin評(píng)分(表1)及骨贅成熟度分級(jí)(0＝無(wú)，1＝主要是軟骨樣組織，2＝軟骨內(nèi)骨化，3＝主要是骨組織)來(lái)定量評(píng)價(jià)，評(píng)分由不知曉實(shí)驗(yàn)分組的兩名人員獨(dú)立進(jìn)行。

Safranin-O/fast green染色：

1、石蠟切片脫蠟至水。

2、Safranin-O染20min。

3、1％醋酸漂洗1次。

4、固綠染色3min。

5、水洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明及封片。

組織學(xué)組織病理評(píng)分體系如表1。Mankin評(píng)分是四項(xiàng)得分之和。

表1

小鼠原代軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

小鼠軟骨取自7天齡C57BL/6小鼠膝關(guān)節(jié)。在無(wú)菌操作下，切取包括前后肢的關(guān)節(jié)軟骨組織，并用0.2％的中性膠原酶消化8小時(shí)，離心獲得細(xì)胞沉淀后用含10％FBS的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)皿中。含IL-1β或/和GDF-5的誘導(dǎo)液用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液配制。含IL-1β和GDF-5的誘導(dǎo)液在臨用前用2倍濃度的IL-1β和GDF-5按1:1混合而成。

成熟miRNA定量分析

1.根據(jù)成熟miRNA序列設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)引物，以及定量PCR引物(表3)。

2.將莖環(huán)引物用水稀釋到終濃度1μM。

3.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

4.PCR，U6為內(nèi)參。

表3、RT引物及Real-time PCR引物序列

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞培養(yǎng)液換成無(wú)抗生素的培養(yǎng)液，以24孔板為例，每孔400ul。

2.將25pmol的siRNA(或25pmol的miR-17 mimic或50pmol的miR-17 inhibitor)與50ul無(wú)血清培養(yǎng)液混合均勻。miR mimics是雙鏈RNA，miRinhibitors是單鏈RNA，通用型NC是cel-miR-67的序列，并證實(shí)與人、小鼠的miRNA序列具有最小的相似性。

3.將1ul lipofectamine 2000溶于50ul無(wú)血清培養(yǎng)液中，輕輕混合均勻，室溫放置5min。

4.將兩管液體混合均勻，室溫放置25min。

5.將上述液體加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，并混合均勻。

6.7h后換成無(wú)血清培養(yǎng)液，過(guò)夜后用不同細(xì)胞因子處理。

miRNA模擬物、激動(dòng)劑和抑制物

miRNA模擬物micrON^TM miRNA mimic及micrON^TM miRNA agomir均購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司。

miRNA mimic針對(duì)成熟miRNA序列特殊設(shè)計(jì)，通過(guò)化學(xué)合成方法制備的miRNA模擬物，能夠顯著提高成熟miRNA的表達(dá)。

miRNA agomir特異性針對(duì)成熟miRNA序列，通過(guò)化學(xué)合成方法制備，并采用銳博生物特殊的穩(wěn)定性修飾的成熟miRNA雙鏈RNA，穩(wěn)定性更高，能夠顯著增加細(xì)胞滲入率，提高其抗RNA酶活性，適合進(jìn)行miRNA動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

micrON^TM miRNA mimic Negative Control及micrON^TM miRNA agomir Negative Control選用的是C.elegans的兩個(gè)miRNA，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析表明其與人、小鼠、大鼠的基因組，以及miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中所有miRNA具有最小的同源性，適合用作人、小鼠、大鼠的miRNA實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照。

micrON^TM miRNA mimic(miR-17 mimic)：正向CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG(SEQ ID NO:8)；反向ACCUGCACUGUAAGCACUUUGUU(SEQ ID NO:9)。

micrON^TM miRNA agomir(Agomir-17)：正向CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG(SEQ ID NO:10)；反向ACCUGCACUGUAAGCACUUUGUU(SEQ ID NO:11)。在其反義鏈進(jìn)行修飾，3’端膽固醇修飾，全甲氧修飾，3’端兩個(gè)硫代修飾，5’端4個(gè)硫代修飾。

micrON^TM miRNA mimic Negative Control：正向UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT(SEQ ID NO:12)；反向ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT(SEQ ID NO:13)。

micrON^TM miRNA agomir Negative Control：正向UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT(SEQ ID NO:14)；反向ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT(SEQ ID NO:15)。

miR-17 inhibitor：正向CUACCUGCACUGUAAGCACUUUG(SEQ ID NO:16)。

miR inhibitor NC：UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA(SEQ ID NO:17)。

3’UTR報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)

報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)專門用來(lái)檢測(cè)miRNA與靶基因是否可能存在調(diào)控作用，該報(bào)告系統(tǒng)報(bào)告熒光(hRluc)，其下游構(gòu)建了靶基因3’UTR區(qū)域，通過(guò)對(duì)該熒光的監(jiān)測(cè)，即可驗(yàn)證miRNA對(duì)該靶標(biāo)是否有調(diào)控作用；另有一校正熒光(hluc)作為穩(wěn)定內(nèi)參，用于監(jiān)測(cè)質(zhì)粒表達(dá)效率。

報(bào)告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建：利用PCR方法，根據(jù)Adamts5(mouse)NM_0117823’UTR序列信息設(shè)計(jì)其擴(kuò)增引物，以3T3細(xì)胞基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增Adamts5基因的3’UTR序列31-2515bp的片段。MMP3、MMP13、NOS2的3’UTR序列由上海生工公司進(jìn)行全基因合成。將這些3’UTR序列分別克隆到pmiR-RB-REPORT^TM雙熒光素酶報(bào)告載體(廣州市銳博生物科技有限公司)中，所用載體的報(bào)告熒光為hRluc，校正熒光為hluc(做內(nèi)參校正)。

報(bào)告基因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)錄后可形成螢火蟲(chóng)熒光素酶與靶基因3’UTR區(qū)域組合而成的特殊mRNA，如果miRNA mimic能夠與包含靶基因3’UTR的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，則熒光素酶的表達(dá)活性也受到顯著調(diào)控，故通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的熒光強(qiáng)度即可定量分析miRNA對(duì)靶基因的mRNA調(diào)控效果。

3’UTR突變引物

用于進(jìn)行3’UTR突變的引物如下：

MMP13：正向：5’-TCAGATTTACATCCAGAAATATACAACCAATAAA-3’(SEQ ID NO:18)

反向：5’-TTTATTGGTTGTATATTTCTGGATGTAAATCTGA-3’(SEQ ID NO:19)

MMP3：正向：5’-AAGGATGTTCAGAAGAGTCGTGTAGCTTACACTG-3’(SEQ ID NO:20)

反向：5’-CAGTGTAAGCTACACGACTCTTCTGAACATCCTT-3’(SEQ ID NO:21)

NOS2：正向：5’-CTCCTGACTGAAGCAAGGCGGGTGACCACCAGGA-3’(SEQ ID NO:22)

反向：5’-TCCTGGTGGTCACCCGCCTTGCTTCAGTCAGGAG-3’(SEQ ID NO:23)ADAMTS5：正向：5’-GCCCTTAGTATGTCAGAGCATAAACTTGGTCCTA-3’(SEQ ID NO:24)

反向：5’-TAGGACCAAGTTTATGCTCTGACATACTAAGGGC-3’(SEQ ID NO:25)

實(shí)施例1、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射GDF-5延緩OA軟骨破壞的進(jìn)展

通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射GDF-5來(lái)研究GDF-5對(duì)小鼠OA的治療作用。膝關(guān)節(jié)矢狀位組織學(xué)切片的Safranin O染色證實(shí)GDF-5能阻止DMM術(shù)后骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。假手術(shù)后注射PBS組中兩關(guān)節(jié)面與半月板結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，關(guān)節(jié)面平整，Safranin O染色正常，沒(méi)有OA病理特征(圖2A，E)；DMM術(shù)后注射PBS組中，脛骨平臺(tái)前中部軟骨破壞，深至鈣化區(qū)，股骨內(nèi)髁軟骨表層剝脫，Safranin O染色顯著變淺(圖2B，F(xiàn))；DMM術(shù)后注射GDF-5，劑量為每次20ng組中，脛骨平臺(tái)和股骨可見(jiàn)Safranin O染色變淺區(qū)域，但沒(méi)有造成軟骨結(jié)構(gòu)破壞(圖2C，G)，說(shuō)明此劑量的GDF-5對(duì)軟骨有一定的保護(hù)作用；DMM術(shù)后注射GDF-5，劑量為每次100ng組中，股骨內(nèi)髁軟骨面平整，Safranin O染色深，脛骨平臺(tái)結(jié)構(gòu)完整，中部有小面積的Safranin O染色變淺區(qū)域(圖2D，H)，說(shuō)明此劑量GDF-5保護(hù)軟骨作用更強(qiáng)，不僅阻止了OA的進(jìn)展，由于GDF-5的促合成作用，還對(duì)已發(fā)生的病情有一定逆轉(zhuǎn)作用。

關(guān)節(jié)冠狀位組織學(xué)切片的Safranin O染色同樣說(shuō)明GDF-5能阻止DMM術(shù)后骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，且每次注射劑量為100ng的效果更佳。圖中可見(jiàn)，DMM術(shù)后注射PBS組中，內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨破壞變薄，股骨內(nèi)髁軟骨表層不平整、軟骨細(xì)胞肥大，Safranin O染色顯著變淺，細(xì)胞排列紊亂(圖3)；DMM術(shù)后注射GDF-5，劑量為每次20ng組中，脛骨平臺(tái)和股骨表層可見(jiàn)Safranin O染色變淺區(qū)域，軟骨厚度有一定程度變薄(圖3)；DMM術(shù)后注射GDF-5，劑量為每次100ng組中，脛骨平臺(tái)結(jié)構(gòu)完整，軟骨厚度未變薄，Safranin O染色深，股骨內(nèi)髁軟骨面平整，但部分表層軟骨Safranin O染色變淺(圖3)。

觀察切片中的骨贅形成情況，發(fā)現(xiàn)GDF-5能延緩已形成的骨贅骨化速度。假手術(shù)術(shù)后8周，無(wú)骨贅形成(圖4A)。DMM術(shù)后8周，骨贅已大部分發(fā)生骨化，骨髓腔形成(圖4B)，GDF-5(20ng)組的骨贅骨化程度減弱，形成的骨髓腔較小(圖4C)，GDF-5(100ng)組的骨贅主要是軟骨樣組織，骨化被明顯抑制(圖4D)。

對(duì)GDF-5治療組及PBS組的關(guān)節(jié)冠狀位和矢狀位切片進(jìn)行綜合評(píng)分，以及對(duì)內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)骨贅的成熟度進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯示，GDF-5顯著降低了Mankin評(píng)分，GDF-5能抑制骨贅成熟，GDF-5(100ng)組的作用更強(qiáng)(圖5)。

實(shí)施例2、GDF-5抑制軟骨細(xì)胞的分解表型，增強(qiáng)合成表型

為了研究GDF-5對(duì)小鼠軟骨細(xì)胞表型的影響，本發(fā)明人檢測(cè)GDF-5能否抑制IL-1β造成的分解表型。用IL-1β(5ng/ml)或/和GDF-5(100ng/ml或300ng/ml)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞36h，用qRT-PCR和Western-blot檢測(cè)分解表型和合成表型。

加入300ng/ml的GDF-5后，IL-1β上調(diào)的分解表型被明顯抑制(圖6A，C)，合成表型顯著增強(qiáng)(圖6B，D)，100ng/ml的GDF-5作用效果較弱。

Western-blot結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，GDF-5對(duì)正常軟骨細(xì)胞的合成表型增強(qiáng)的效果不明顯，但是能顯著上調(diào)IL-1β處理后細(xì)胞的合成表型(圖6D)。

實(shí)施例3、GDF-5調(diào)控microRNA-17(miR-17)的表達(dá)

本發(fā)明人針對(duì)小鼠關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)量相對(duì)較高的miRNA，檢測(cè)了它們?cè)贕DF-5作用24小時(shí)前后的軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-17在GDF-5刺激后變化最為顯著(圖7)。本發(fā)明人使用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetscan、miRanda進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)降解因子MMP3、MMP13、NOS2及ADAMTS5是miR-17可能的靶基因。

miR-17由miR-17-92簇編碼，miR-17-92的結(jié)構(gòu)和序列在脊椎動(dòng)物中高度保守并且在哺乳動(dòng)物中有2個(gè)同源基因。

實(shí)施例4、miR-17抑制MMP3、MMP13、NOS2和ADAMTS5等分解蛋白的表達(dá)

為了研究miRNA在GDF-5對(duì)軟骨細(xì)胞表型調(diào)控中的功能，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA的反義核酸鏈(inhibitor)或模擬物(mimic)來(lái)抑制或增強(qiáng)miRNA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染24h后，用IL-1β或/和GDF-5誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞36h。

根據(jù)GDF-5對(duì)軟骨細(xì)胞miRNA的調(diào)控作用，用miR-17 inhibitor抑制miR-17的表達(dá)，然后用IL-1β和GDF-5誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞36h。用qPCR和Western blot檢測(cè)各種分解蛋白的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，GDF-5對(duì)MMP3、MMP13、NOS2和ADAMTS5的抑制作用被部分削弱，而GDF-5對(duì)MMP12的抑制作用沒(méi)有受到影響(圖8a，b)。結(jié)果提示GDF-5對(duì)MMP3、MMP13、NOS2和ADAMTS5的抑制作用有部分是通過(guò)上調(diào)miR-17來(lái)完成的，同時(shí)GDF-5還有其他的作用途徑，而GDF-5對(duì)MMP12的抑制作用則不依賴于miR-17。

用miR-17 mimic過(guò)表達(dá)miR-17后，用IL-1β和/或GDF-5誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞36h，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)分解因子表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-17對(duì)IL-1β上調(diào)的MMP3、MMP13、NOS2和ADAMTS5起抑制作用，而對(duì)MMP12無(wú)抑制作用(圖8c，d)。miR-17與GDF-5聯(lián)合應(yīng)用能增強(qiáng)抑制效果。過(guò)表達(dá)miR-138作為對(duì)照則無(wú)影響(圖8d)。

實(shí)施例5、miR-17直接作用于MMP3、MMP13、NOS2、ADAMTS5的3’UTR

為了明確miR-17是否通過(guò)結(jié)合到MMP3、MMP13、NOS2、ADAMTS5 mRNA的3’UTR來(lái)抑制它們的翻譯，本發(fā)明人通過(guò)生物信息學(xué)軟件找到了上述mRNA中可能的作用位點(diǎn)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-17能結(jié)合到它們的3’UTR區(qū)域，3’UTR特異位點(diǎn)突變(mut UTR)后，miR-17作用消失(圖9)。

實(shí)施例6、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射miR-17延緩小鼠骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展

為驗(yàn)證miR-17在關(guān)節(jié)腔內(nèi)是否能抑制軟骨組織的分解代謝，本發(fā)明人使用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射膽固醇修飾的Agomir-17(每周1次，每次1.5nmol)來(lái)觀察其對(duì)DMM術(shù)后骨關(guān)節(jié)炎有無(wú)影響，從組織學(xué)切片觀察可見(jiàn)，Agomir-17減輕了關(guān)節(jié)軟骨的破壞程度(圖10左)，Mankin評(píng)分比注射Agomir-NC的要顯著降低(圖10右)。

實(shí)施例7、藥物篩選

取小鼠軟骨細(xì)胞，該細(xì)胞可內(nèi)源性表達(dá)miR-17。將該種細(xì)胞作為用于篩選緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物的細(xì)胞模型。

測(cè)試組：用候選物質(zhì)處理的上述細(xì)胞的培養(yǎng)物；

對(duì)照組：不用候選物質(zhì)處理的上述細(xì)胞的培養(yǎng)物。

在處理后適當(dāng)時(shí)間，測(cè)定所述細(xì)胞的miR-17的表達(dá)。如果與對(duì)照組相比，測(cè)試組中的miR-17的表達(dá)顯著上升3倍以上，則說(shuō)明該候選物質(zhì)是潛在的緩解或治療骨關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)。

以Agomir-17、miR-17 mimic以及miR-17 inhibitor分別作為候選物質(zhì)，轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Agomir-17可使得測(cè)試組中的miR-17的表達(dá)顯著上升5倍以上。因此，Agomir-17為一種有用的候選藥物。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。