本發(fā)明涉及組織工程學(xué)及三維打印技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種冰膠三維結(jié)構(gòu)體、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

醫(yī)療行業(yè)面臨著許多緊迫的問(wèn)題。例如，每年都有大量患有嚴(yán)重心臟、腎臟、肝臟、肺等疾病的患者等待器官移植，而且由于可供移植的器官來(lái)源有限，其中大多數(shù)患者最終都因等不到移植而死亡。因此，對(duì)適用于創(chuàng)傷修復(fù)、組織增大、器官修復(fù)和器官置換的可植入組織和器官存在迫切的需求。此外，對(duì)能促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)技術(shù)應(yīng)用的材料、工具和技術(shù)存在需求。

三維打印(3D打印)技術(shù)是近年來(lái)快速發(fā)展并且越來(lái)越引人注目的一種新興的成型技術(shù)。它是一種以數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)的直接制造技術(shù)，幾乎可以制造任意形狀三維實(shí)體。3D打印運(yùn)用粉末狀金屬或塑料等可粘合材料，通過(guò)逐層堆疊累積的方式來(lái)構(gòu)造物體，即“積層制造”。3D打印與傳統(tǒng)的機(jī)械加工技術(shù)不同，經(jīng)由與自動(dòng)的或半自動(dòng)的、計(jì)算機(jī)輔助的三維成型裝置相匹配的方法，利用可成型材料進(jìn)行三維精確沉積，直接獲得實(shí)體。

冰膠(cryogel)又稱為冰凍凝膠，是指在低于溶劑正常冰點(diǎn)的溫度下所形成的由聚合物、蛋白質(zhì)、凝膠等構(gòu)成的結(jié)構(gòu)體。由于在冷凍過(guò)程中，所產(chǎn)生的冰晶純度要遠(yuǎn)高于初始溶液，相當(dāng)于溶液中所含的溶質(zhì)被濃縮在剩余未結(jié)冰的溶液中，而溶質(zhì)的濃縮又導(dǎo)致了剩余溶液冰點(diǎn)的下降，這一過(guò)程也被稱為冰凍濃縮(cryoconcentration)。冰凍濃縮導(dǎo)致溶液的冷凍過(guò)程不是均一的，因而在最后形成的固體中溶質(zhì)的分布也不是均一的。利用這一性質(zhì)，先將聚合物、蛋白質(zhì)、凝膠 等的水溶液冷凍成固體，在冰點(diǎn)下保存，然后解凍，從而形成具有多孔結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)體(即冰膠)。冰膠具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如較高的貫通孔隙率和多孔性，可以負(fù)載藥物、細(xì)胞和/或生物材料以用作藥物、細(xì)胞載體和/或治療性植入物(例如支架)，生物相容性高，彈性好，機(jī)械性能好等?，F(xiàn)有的冰膠制備技術(shù)依賴模具成形，存在內(nèi)部結(jié)構(gòu)不可控、材料分布不可控、難以構(gòu)建尺寸較大的三維結(jié)構(gòu)體并保證內(nèi)部細(xì)胞存活等等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種冰膠三維結(jié)構(gòu)體、其制備方法及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種制備冰膠三維結(jié)構(gòu)體的方法，包括以下步驟：

(a)將冰膠原料與交聯(lián)溶液混合得到冰膠前體溶液，其中所述冰膠原料包含選自以下的一種或多種物質(zhì)：明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖、層連接蛋白、纖連接蛋白和纖維蛋白等；所述交聯(lián)溶液包括選自以下的一種或多種物質(zhì)：氯化鈣溶液、京尼平溶液、戊二醛溶液、已二酸二酰肼、環(huán)氧氯丙烷、碳化二亞胺、凝血酶等；

(b)將所述冰膠前體溶液三維打印成預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；

(c)冷凍所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，從而得到冷凍的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；以及

(d)干燥所述冷凍的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，從而得到冰膠三維結(jié)構(gòu)體。

本發(fā)明提供的一種制備冰膠三維結(jié)構(gòu)體的方法，包括以下步驟：

(a)將多種冰膠原料分別配制成多種冰膠前體溶液，其中至少一種冰膠前體溶液是將冰膠原料與交聯(lián)溶液混合得到冰膠前體溶液；

所述冰膠原料包含選自以下的一種或多種物質(zhì)：明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋 白、透明質(zhì)酸、殼聚糖、層連接蛋白、纖連接蛋白和纖維蛋白等；所述交聯(lián)溶液包括選自以下的一種或多種物質(zhì)：氯化鈣溶液、京尼平溶液、戊二醛溶液、已二酸二酰肼、環(huán)氧氯丙烷、碳化二亞胺、凝血酶等；

(b)將所述多種冰膠前體溶液分別通過(guò)多個(gè)噴頭三維打印成預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；

(c)冷凍所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，從而得到冷凍的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；以及

(d)干燥所述冷凍的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，從而得到冰膠三維結(jié)構(gòu)體。

前述方法包括以下步驟：

(a1)將第一冰膠原料與交聯(lián)溶液混合得到第一冰膠前體溶液；

(a2)將第二冰膠原料或第二冰膠原料與交聯(lián)溶液混合配制成第二冰膠前體溶液；

(b)將所述第一冰膠前體溶液和第二冰膠前體溶液分別通過(guò)第一噴頭和第二噴頭三維打印成預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；

(c)冷凍所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，從而得到冷凍的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；以及

(d)干燥所述冷凍的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，從而得到冰膠三維結(jié)構(gòu)體。

前述方法包括以下步驟：

(a1)將第一冰膠原料與交聯(lián)溶液混合得到第一冰膠前體溶液；

(a2)將第二冰膠原料或第二冰膠原料與交聯(lián)溶液混合配制成第二冰膠前體溶液；

(a3)將第三冰膠原料或第三冰膠原料與交聯(lián)溶液混合配制成第三冰膠前體溶液；

(b)將所述第一冰膠前體溶液、第二冰膠前體溶液和第三冰膠 前體溶液分別通過(guò)第一噴頭、第二噴頭和第三噴頭三維打印成預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；

(c)冷凍所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，從而得到冷凍的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；以及

(d)干燥所述冷凍的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，從而得到冰膠三維結(jié)構(gòu)體。

前述的方法，步驟(c)中以梯度方式冷凍所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，優(yōu)選地在4℃下孵育0.5-4h，然后在-20℃下孵育3-24h，更優(yōu)選地，在4℃下孵育1至3h，然后在-20℃下孵育4-12h。

前述的方法，步驟(d)中以真空冷凍干燥的方式干燥所述冷凍的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，優(yōu)選地在-20℃～-40℃、10-50Pa的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥，更優(yōu)選地，在-25℃～-35℃、20-40Pa的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥。

前述的方法，所述冰膠原料、第一冰膠原料以及第二冰膠原料為冰膠原料水溶液，濃度為0.5％-20％，優(yōu)選1％-10％，更優(yōu)選2％-5％。

前述的方法，所述交聯(lián)溶液的濃度為10-1000mmol^-1，優(yōu)選50-300mmol^-1，更優(yōu)選80-150mmol^-1。

前述的方法，所述冰膠原料與交聯(lián)溶液按100:1-1:100的體積比混合。

前述的方法，步驟(b)中所述三維打印是指通過(guò)自動(dòng)的或半自動(dòng)的、計(jì)算機(jī)輔助的三維成型裝置進(jìn)行三維精確沉積。

前述方法還包括步驟(e)：將細(xì)胞或細(xì)胞與生物材料混合物添加到步驟(d)得到的所述冰膠三維結(jié)構(gòu)體中，從而得到負(fù)載有細(xì)胞的冰膠三維結(jié)構(gòu)體；所述細(xì)胞選自以下一種或多種細(xì)胞：內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管細(xì)胞、全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、專能干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨來(lái)源細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、肝來(lái)源的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、星 狀細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和其他各種組織和器官來(lái)源細(xì)胞等；所述生物材料選自以下一種或多種材料：明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖、層連接蛋白、纖連接蛋白和纖維蛋白等。

本發(fā)明還提供根據(jù)前述方法制得的冰膠三維結(jié)構(gòu)體，所述冰膠三維結(jié)構(gòu)體為塊狀、片狀、囊狀或管狀，其孔隙率為10％-90％，平均孔徑為1-300μm，且具有0.1-10kPa的楊氏模量。

所述冰膠三維結(jié)構(gòu)體是器官或微器官，優(yōu)選肝、腎、胰、脾、肺、心肌、胃、輸尿管、泌尿?qū)Ч?、肝門十二指腸腸導(dǎo)管、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、尿道、腸、食道、膀胱、膽囊或其一部分。

本發(fā)明還提供借助芯片或不借助芯片、借助生物反應(yīng)器或不借助生物反應(yīng)器的活的三維組織結(jié)構(gòu)體的陣列，其包含多個(gè)所述冰膠三維結(jié)構(gòu)體。

本發(fā)明還提供所述冰膠三維結(jié)構(gòu)體或陣列在制備用于治療疾病或病癥、組織修復(fù)或再生以及矯形或整形的植入物中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述冰膠三維結(jié)構(gòu)體或陣列在體外研究中的應(yīng)用，其中所述體外研究包括但不限于細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞生物學(xué)研究、藥物開發(fā)、藥物篩選、藥物檢測(cè)、藥物測(cè)試、構(gòu)建藥理模型、病理模型、組織/器官模型和腫瘤模型。

本發(fā)明創(chuàng)造性地將冰膠技術(shù)與三維打印技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)三維打印技術(shù)來(lái)構(gòu)建冰膠三維結(jié)構(gòu)體(例如冰膠支架)，使得在保留冰膠優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)顯著地改善了其缺點(diǎn)。

本發(fā)明提供的冰膠三維結(jié)構(gòu)體及其制備方法，可形成預(yù)先設(shè)計(jì)復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的冰膠組織工程支架，用于三維細(xì)胞培養(yǎng)、體外類組織構(gòu)建、組織工程與再生醫(yī)學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)研究和藥物檢測(cè)等領(lǐng)域。所述三維打印冰膠支架具有個(gè)性化、可定制、細(xì)胞負(fù)載高、孔隙率和通透率高、孔徑大小可調(diào)節(jié)、彈性模量高以及可注射移植的特點(diǎn)。

相比于常規(guī)的凝膠結(jié)構(gòu)體，本發(fā)明的冰膠三維結(jié)構(gòu)體具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)多孔性，其孔隙率為10％-90％，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或其任意區(qū)間，平均孔徑為1-300μm；

(二)生物相容性，本發(fā)明的冰膠三維結(jié)構(gòu)具有非常好的生物相容性，能夠適合于體內(nèi)植入；

(三)負(fù)載率高，本發(fā)明的冰膠三維結(jié)構(gòu)體和生物相容性植入物能夠負(fù)載藥物和/或細(xì)胞以用作藥物載體和/或治療性植入物(例如支架)；

(四)能夠?qū)崿F(xiàn)所負(fù)載物質(zhì)的受控釋放；

(五)彈性好，本發(fā)明的冰膠三維結(jié)構(gòu)體具有0.1-10kPa的楊氏模量，例如0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或其任意區(qū)間，在壓縮時(shí)，本發(fā)明的冰膠三維結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或更高的壓縮應(yīng)變而不發(fā)生永久形變或機(jī)械破壞，在外力撤除時(shí)仍能恢復(fù)原有的形狀；

(六)機(jī)械性能好，本發(fā)明的冰膠三維結(jié)構(gòu)體相比于常規(guī)凝膠表述出更高的機(jī)械穩(wěn)定性；

(七)內(nèi)部結(jié)構(gòu)可控，通過(guò)三維打印實(shí)現(xiàn)了對(duì)本發(fā)明的冰膠三維結(jié)構(gòu)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的精確控制和對(duì)多種材料所沉積的空間位置的精確控制；以及可以構(gòu)建大尺寸的三維結(jié)構(gòu)體；

(八)在負(fù)載細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，顯著地改善了細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，例如顯著增加了細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度以及顯著增加了細(xì)胞培養(yǎng)物的生物學(xué)活性。

附圖說(shuō)明

圖1為冰膠形成過(guò)程的示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中使用的單噴頭三維打印設(shè)備示意圖；其中，21表示噴頭，22表示打印形成的三維結(jié)構(gòu)體，23表示可三維運(yùn)動(dòng) 的成形平臺(tái)。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中使用的雙噴頭三維打印設(shè)備示意圖；其中，31表示第一噴頭，32表示第二噴頭，33表示可三維運(yùn)動(dòng)的輔助成形微流控芯片。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中制備的三維打印冰膠支架的照片及其性能；其中，A圖為三維打印形成的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；B圖為三維打印技術(shù)制備的冰膠支架；C圖為掃描電鏡觀察的三維打印冰膠支架微觀形貌；D圖為肝臟祖細(xì)胞在三維打印冰膠支架中培養(yǎng)5天后的形貌；E圖為肝臟祖細(xì)胞在三維打印冰膠支架中增殖情況，與常規(guī)二維培養(yǎng)相比，各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)都有顯著性差異。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“％”，若未特別說(shuō)明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指100mL溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)。

除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的相同含義。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“冰膠”是指在低于溶劑正常冰點(diǎn)的溫度下所形成的由聚合物、蛋白質(zhì)、或凝膠等構(gòu)成的結(jié)構(gòu)體，即通過(guò)冰凍濃縮(cryoconcentration)過(guò)程所形成的具有多孔結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)體。具體地，由于在冷凍過(guò)程中，所產(chǎn)生的冰晶純度要遠(yuǎn)高于初始的溶液，那么就相當(dāng)于溶液中所含的溶質(zhì)被濃縮在剩余未結(jié)冰的溶液中，而溶質(zhì)的濃縮又導(dǎo)致了剩余溶液冰點(diǎn)的下降，這一過(guò)程也被稱為冰凍濃縮(cryoconcentration)。冰凍濃縮導(dǎo)致溶液的冷凍過(guò)程不是均一的，因而在最后形成的固體中溶質(zhì)的分布也不是均一的。利用這一性質(zhì)， 先將聚合物、蛋白質(zhì)、凝膠等的水溶液冷凍成固體，在冰點(diǎn)下保存，然后解凍，從而形成具有多孔結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)體(即冰膠)。本發(fā)明的冰膠可以由任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可用的材料制成，包括但不限于：水凝膠、海藻酸鹽、明膠、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide,PLGA)、膠原蛋白、Matrigel^TM、和透明質(zhì)酸。冰膠形成過(guò)程的示意圖見圖1。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“陣列”是指一種科學(xué)工具，其包含多個(gè)空間排列的元件的集合體，以允許對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行多個(gè)測(cè)定、對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)測(cè)定。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“交聯(lián)溶液”是指在冰膠形成過(guò)程中起到交聯(lián)作用的溶液，其可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知可用于使得冰膠原料發(fā)生交聯(lián)從而形成冰膠的材料，例如氯化鈣溶液，優(yōu)選10-1000mmol^-1，更優(yōu)選50-300mmol^-1，最優(yōu)選80-150mmol^-1，例如100mmol^-1濃度的氯化鈣溶液。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“三維打印”是指：經(jīng)由與自動(dòng)的或半自動(dòng)的、計(jì)算機(jī)輔助的三維成型裝置(例如三維打印機(jī))相匹配的方法，利用三維打印相容的原料進(jìn)行的三維精確沉積。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的三維結(jié)構(gòu)體是工程化的。術(shù)語(yǔ)“工程化的”是指：根據(jù)計(jì)算機(jī)腳本，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的裝置(例如三維打印機(jī))，將原料(例如冰膠原料和/或冰膠前體溶液)和它們的層放置以形成三維結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)腳本,例如是一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)程序、計(jì)算機(jī)應(yīng)用或計(jì)算機(jī)模塊。

在一些實(shí)施方案中，三維打印方法是連續(xù)的和/或基本連續(xù)的。連續(xù)三維打印方法的非限制性實(shí)例是：經(jīng)由連接到打印墨水儲(chǔ)存器的分配末端(例如，注射器、毛細(xì)管等)從三維打印機(jī)分配打印墨水(例如冰膠原料和/或冰膠前體溶液)。在進(jìn)一步的非限制性實(shí)施方案中，連續(xù)三維打印方法是按功能單元的重復(fù)圖案(pattern)分配打印墨水。 在各個(gè)實(shí)施方案中，重復(fù)功能單元具有任何適宜的幾何形狀，包括例如：圓形、正方形、矩形、三角形、多邊形和不規(guī)則的幾何形狀，從而產(chǎn)生具有通過(guò)獨(dú)特打印墨水和/或間隙空間的空間圖案化而獲得的平面幾何形狀的一個(gè)或多個(gè)組織層。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，三維打印的功能單元的一個(gè)重復(fù)圖案包括一個(gè)層，相鄰地三維打印(例如堆疊)多個(gè)層以形成具有層狀幾何形狀的工程化結(jié)構(gòu)體。在各個(gè)實(shí)施方案，相鄰地三維打印(例如堆疊)了2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個(gè)或更多個(gè)層，以形成工程化結(jié)構(gòu)體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，具有層狀幾何形狀的組織的一個(gè)或多個(gè)層也具有平面幾何形狀。

在一些實(shí)施方案中，連續(xù)三維打印的方法包括：獨(dú)立地或相對(duì)于彼此優(yōu)化和/或平衡諸如打印高度、泵速、機(jī)撲速度或其組合的參數(shù)。在一個(gè)實(shí)例中，用于沉積的三維打印機(jī)頭速度為3mm/s，第一層的分配高度為0.5mm，而后面每個(gè)層的分配高度增加0.4mm。在一些實(shí)施方案中，該分配高度與三維打印機(jī)分配末端的直徑基本相等。不受限制地，適宜的和/或最佳的分配距離不會(huì)導(dǎo)致材料變平或附著到分配針上。在各個(gè)實(shí)施方案中，三維打印機(jī)分配末端具有約20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μm或更大的內(nèi)徑，包括其中任意范圍。在各個(gè)實(shí)施方案中，三維打印機(jī)的打印墨水儲(chǔ)存器具有約0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100cm³或更大的容積，包括其中任意范圍。在一些情況下，當(dāng)系統(tǒng)中的殘余壓力積累較低時(shí)，該泵速是適宜的或最佳的。在一些情況下，有利的泵速取決于儲(chǔ)存器的橫截面積與分配針之間的比例，該比例越大，則需要越低的泵速。在一些實(shí)施方案中，適宜的和/或最佳的打印速度使得能夠沉積均勻的線，而不影響材料的機(jī)械完整性。

本文中公開的發(fā)明包括商業(yè)方法。在一些實(shí)施方案中，本文中公開的技術(shù)和方法的速度和可放大性用來(lái)設(shè)計(jì)、構(gòu)建和操作用于生產(chǎn)供植入使用的三維結(jié)構(gòu)體或用于生成基于細(xì)胞的工具(用于研究和開發(fā)，例如體外分析)的工業(yè)和/或商業(yè)設(shè)施。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，三維結(jié)構(gòu)體及其陣列被生產(chǎn)、儲(chǔ)存、分發(fā)、上市、宣傳并銷售，例如作為用于生物分析和高通量藥物篩選的細(xì)胞陣列(例如微陣列或芯片)、組織陣列(例如微陣列或芯片)以及試劑盒。在其它實(shí)施方案中，冰膠三維結(jié)構(gòu)體及其陣列被制造并用來(lái)進(jìn)行作為服務(wù)的生物分析和/或藥物篩選。

實(shí)施例1 通過(guò)單噴頭三維打印制備冰膠三維結(jié)構(gòu)體

1.將海藻酸鈉粉末(Sigma-Aldrich)溶于去離子水中制成3％均質(zhì)溶液，經(jīng)過(guò)45μm濾紙過(guò)濾滅菌。

2.將2mL如上所述制備的海藻酸鈉溶液與0.2mL氯化鈣溶液(100mmol^-1)均勻混合，形成具有一定粘度的前體溶液并裝載到1mL一次性無(wú)菌注射器中。

3.將無(wú)菌注射器裝載到生物三維打印設(shè)備中(可參見Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue Engineered Adipose Tissue,Journal of Bioactive and Compatible Polymer,2009；24：5)，在常溫下，在計(jì)算機(jī)軟件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步進(jìn)電機(jī)速度2mm/s，掃描速度10mm/s的參數(shù)條件下，在無(wú)菌的平面平臺(tái)上三維打印，形成體積為1cm/1cm/0.5cm的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體。單噴頭3D打印機(jī)的示意圖如圖2所示。

4.梯度冷卻預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，4℃保存2h，-20℃保存過(guò)夜。

5.在-30℃，30Pa的低溫、高真空度條件下干燥三維結(jié)構(gòu)體24h，形成三維細(xì)胞支架，紫外照射滅菌45min后無(wú)菌條件下保存。

6.將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(購(gòu)自Invitrogen)以10⁶/mL的密度均勻分散在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(含有20％FBS的DMEM)中，將 1mL含有細(xì)胞的培養(yǎng)基滴加在如上所述制備的三維細(xì)胞支架中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4h。

7.加入足量?jī)?nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，常規(guī)條件下(37℃，5％CO₂孵箱)培養(yǎng)細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體。

實(shí)施例2 通過(guò)雙噴頭三維打印制備冰膠三維結(jié)構(gòu)體

1.將海藻酸鈉粉末(Sigma-Aldrich)溶于去離子水中制成3％均質(zhì)溶液，經(jīng)過(guò)45μm濾紙過(guò)濾滅菌。

2.將明膠粉末溶于去離子水中制成10％均質(zhì)溶液，經(jīng)過(guò)反復(fù)高溫滅菌后常溫保存。

3.將2mL如上所述制備的海藻酸鈉溶液與0.2mL氯化鈣溶液(100mmol^-1)均勻混合，形成具有一定粘度的前體溶液并裝載到10mL一次性無(wú)菌注射器中。

4.將2mL如上所述制備的明膠溶液裝載到裝載到10mL一次性無(wú)菌注射器中，在10℃下保存10min，形成具有一定粘度的明膠前體溶液。

5.將裝載海藻酸鈉前體溶液和明膠前體溶液的無(wú)菌注射器分別加載到三維打印機(jī)的兩個(gè)噴頭上，并將兩個(gè)噴頭的溫度分別設(shè)置在25℃和10℃，在計(jì)算機(jī)軟件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步進(jìn)電機(jī)速度2mm/s，掃描速度10mm/s的參數(shù)條件下，在10℃無(wú)菌的平面平臺(tái)完成雙噴頭三維打印，將兩種前體材料分別打印在預(yù)定的位置，形成體積為1cm/1cm/0.5cm的預(yù)凝膠多材料三維結(jié)構(gòu)體(三維打印機(jī)的結(jié)構(gòu)可參見Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue Engineered Adipose Tissue,Journal of Bioactive and Compatible Polymer,2009；24：5)。雙噴頭3D打印機(jī)的結(jié)構(gòu)基本與單噴頭3D打印機(jī)相同，區(qū)別僅在于有兩套噴頭系統(tǒng)(即包括兩個(gè)噴頭以及與各個(gè)噴頭相連的管路)。雙噴頭3D打印機(jī)的示意圖如圖3所示。

6.梯度冷卻預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，4℃保存2h，-20℃保存過(guò)夜。

7.在-30℃，30Pa的低溫、高真空度條件下干燥三維結(jié)構(gòu)體24h，形成三維細(xì)胞支架，紫外照射滅菌45min后無(wú)菌條件下保存。

8.將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(購(gòu)自Invitrogen)和宮頸癌細(xì)胞(來(lái)自ADCC)以10⁶/mL的密度均勻分散在細(xì)胞培養(yǎng)基(內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM：癌細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM+10％胎牛血清＝1:1)中，形成兩種細(xì)胞的混懸液，將1mL細(xì)胞混懸液滴加在三維細(xì)胞支架中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4h。

9.加入足量細(xì)胞培養(yǎng)基(內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基：癌細(xì)胞培養(yǎng)基＝1:1)，常規(guī)條件下(37℃，5％CO₂孵箱)培養(yǎng)細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體。

實(shí)施例3 使用含膠原的細(xì)胞培養(yǎng)液制備負(fù)載細(xì)胞的冰膠三維結(jié)構(gòu)體

1.將海藻酸鈉粉末(Sigma-Aldrich)溶于去離子水中制成3％均質(zhì)溶液，經(jīng)過(guò)45μm濾紙過(guò)濾滅菌。

2.將2mL如上所述制備的海藻酸鈉溶液與0.2mL氯化鈣溶液(100mmol^-1)均勻混合，形成具有一定粘度的前體溶液并裝載到1mL一次性無(wú)菌注射器中。

3.將無(wú)菌注射器裝載到生物三維打印設(shè)備中，在常溫下，在計(jì)算機(jī)軟件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步進(jìn)電機(jī)速度2mm/s，掃描速度10mm/s的參數(shù)條件下，在無(wú)菌的平面平臺(tái)上三維打印，形成體積為1cm/1cm/0.5cm的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體(三維打印機(jī)的結(jié)構(gòu)可參見Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue Engineered Adipose Tissue,Journal of Bioactive and Compatible Polymer,2009；24：5)。

4.梯度冷卻預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，4℃保存2h，-20℃保存過(guò)夜。

5.在-30℃，30Pa的低溫、高真空度條件下干燥三維結(jié)構(gòu)體24h，形成三維細(xì)胞支架，紫外照射滅菌45min后無(wú)菌條件下保存。

6.在冰上，將膠原溶液以1:10的濃度稀釋在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中， 并調(diào)節(jié)PH值為中性。

7.將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(購(gòu)自Invitrogen)以10⁶/mL的密度均勻分散在含有膠原材料的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(含20％FBS的DMEM)中，將1mL細(xì)胞混懸液滴加在三維細(xì)胞支架中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4h。

8.加入足量?jī)?nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，常規(guī)條件下(37℃，5％CO₂孵箱)培養(yǎng)細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體。

實(shí)施例4 冰膠三維結(jié)構(gòu)體的制備及其性能

1.將海藻酸鈉粉末(Sigma-Aldrich)溶于去離子水中制成3％均質(zhì)溶液，經(jīng)過(guò)45μm濾紙過(guò)濾滅菌。

2.將2mL如上所述制備的海藻酸鈉溶液與0.2mL氯化鈣溶液(100mmol^-1)均勻混合，形成具有一定粘度的前體溶液并裝載到1mL一次性無(wú)菌注射器中。

3.將無(wú)菌注射器裝載到生物三維打印設(shè)備中，在常溫下，在計(jì)算機(jī)軟件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，以步進(jìn)電機(jī)速度2mm/s，掃描速度10mm/s的參數(shù)條件下，在無(wú)菌的平面平臺(tái)上三維打印，形成體積為1cm/1cm/0.5cm的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體(三維打印機(jī)的結(jié)構(gòu)可參見Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue Engineered Adipose Tissue,Journal of Bioactive and Compatible Polymer,2009；24：5)。圖4A顯示三維打印形成的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體。

4.梯度冷卻預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，4℃保存2h，-20℃保存過(guò)夜。

5.在-30℃，30Pa的低溫、高真空度條件下干燥三維結(jié)構(gòu)體24h，形成三維細(xì)胞支架，紫外照射滅菌45min后無(wú)菌條件下保存。圖4B顯示了所制備的冰膠支架。圖4C為掃描電鏡觀察的三維打印冰膠支架微觀形貌。

6.在冰上，將膠原溶液以1:10的濃度稀釋在細(xì)胞培養(yǎng)基中，并調(diào)節(jié)PH值為中性。

7.將肝臟祖細(xì)胞(Life Technologies)以10⁶/mL的密度均勻分散在含有膠原材料的細(xì)胞培養(yǎng)基(含20％FBS的DMEM)中，將1mL細(xì)胞混懸液滴加在三維細(xì)胞支架中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4h。

8.加入足量細(xì)胞培養(yǎng)基，常規(guī)條件下(37℃，5％CO₂孵箱)培養(yǎng)細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體。圖4D圖為肝臟祖細(xì)胞在三維打印冰膠支架中培養(yǎng)5天后的形貌。圖4E圖為肝臟祖細(xì)胞在三維打印冰膠支架中增殖情況。與常規(guī)二維培養(yǎng)相比，在初始負(fù)載細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件等完全相同的情況下，通過(guò)常用的細(xì)胞代謝活性檢測(cè)試劑盒鑒定(Cell Viability Assay，Promega)，各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)都顯示出在本發(fā)明所制備的三維打印冰膠支架中培養(yǎng)肝臟祖細(xì)胞相比于二維培養(yǎng)使得所培養(yǎng)細(xì)胞的代謝活性顯著提高。

以上描述地僅是優(yōu)選實(shí)施方案，其只作為示例而不限制實(shí)施本發(fā)明所必需特征的組合。所提供的標(biāo)題并不意指限制本發(fā)明的多種實(shí)施方案。術(shù)語(yǔ)例如“包含”、“含”和“包括”不意在限制。此外，除非另有說(shuō)明，沒有數(shù)詞修飾時(shí)包括復(fù)數(shù)形式，以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的意思與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。