本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種載蛋白抗原、多肽抗原、滅活病毒抗原等活性藥物的聚合物納米粒子及其制備方法和作為抗原遞送與佐劑系統(tǒng)的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，基于納米技術(shù)的藥物輸送方法引起了科學(xué)界和企業(yè)界的極大關(guān)注和興趣，納米粒子已成為一種新型的具有巨大應(yīng)用前景的藥物或基因遞送載體，有眾多證據(jù)表明，納米粒子可把藥物定向地輸送到器官、組織或細(xì)胞，這將為惡性腫瘤、心腦血管疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的解決方案。某些納米粒子可通過毛細(xì)管滲透穿越生理屏障，使藥物在體內(nèi)特定部位累積，改變藥物在體內(nèi)的分布，降低藥物的毒副作用，同時(shí)提高藥物的治療效率。另外，在免疫研究中發(fā)現(xiàn)，納米粒子可作為抗原遞送與佐劑系統(tǒng)，顯著增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答水平，并能夠改變抗原的提呈途徑，大大增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。

目前國(guó)內(nèi)外已開發(fā)了多種基于合成聚合物和天然組分材料的微粒緩控釋系統(tǒng)，包括：水包油型乳劑、脂質(zhì)體、微球和納米粒等，尤其在免疫學(xué)方面的研究，將微粒緩控釋系統(tǒng)用于免疫佐劑的研究中仍然面臨的挑戰(zhàn)。

納米粒子的制備方法有很多，通常采用自乳化溶劑揮發(fā)法制備，自乳化溶劑揮發(fā)法以丙酮或甲醇為“水相”，以水不溶性低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑如二氯甲烷或氯仿為“油相”，在乳化劑存在條件下，由于大量“水相”的迅速擴(kuò)散，將“油相”分散成微細(xì)液滴，待蒸發(fā)溶劑后形成固體納米粒。該方法不需乳勻或超聲，是一種自發(fā)過程。

通過對(duì)自乳化溶劑揮發(fā)法進(jìn)行改良，即先對(duì)油相和水相的改良，在本發(fā)明中采用毒性較低的乙醇和丙酮的混合液為油相，水相為去離子水，將高分子聚合物材料溶于油相中，并在油相中加入適當(dāng)比例的陽離子脂質(zhì)材料，然后將油相緩慢加入到水相中，勻速攪拌下將油相蒸發(fā)，制備得到納米粒子。采用這種方法制備得到的納米粒子粒徑均一，且分散性良好，表面荷正電，將其與蛋白質(zhì)、多肽、滅活病毒抗原等生物活性物質(zhì)混合，可通過靜電相互作用將活性物質(zhì)攜載到納米粒子上。采用這種攜載方式，條件溫和、過程簡(jiǎn)單，活性物質(zhì)活性能夠得到較好保持，攜載率也較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種尺寸均一、高吸附性、高活性的載活性抗原的納米遞送與佐劑系統(tǒng)，并將其用作新型疫苗制劑。

一方面，本發(fā)明提供一種載活性抗原物質(zhì)的聚合物納米粒子，所述聚合物納米粒子是由高分子聚合物聚合形成的內(nèi)核，陽離子脂質(zhì)穿插在內(nèi)核中，陽離子脂質(zhì)頭部暴露于納米粒子表面，使其荷正電；所述聚合物納米粒子表面可通過靜電作用吸附攜載蛋白、多肽、病毒抗原的活性物質(zhì)；所述聚合物納米粒子的平均粒徑在90-200nm之間，多分散指數(shù)(PDI)小于0.2，Zeta電位平均值為大于20mV。

本發(fā)明提供的載活性藥物的聚合物納米粒子，其表面帶有正電荷，其他納米粒子相比，可以吸附表面帶負(fù)電的蛋白質(zhì)、多肽及疫苗。

本發(fā)明提供的載活性藥物的聚合物納米粒子，其平均粒徑在90-300nm之間，在免疫途徑中當(dāng)載藥微球的粒徑處于納米級(jí)，可以增加抗原提呈細(xì)胞APCs的攝取量，使抗原更好的被加工提呈。

本發(fā)明提供的載活性藥物的聚合物脂質(zhì)球，其尺寸均一、可控，是可載蛋 白質(zhì)、多肽或疫苗等多種生物活性藥物的可降解的聚合物納米粒子，該納米粒子具有較小的粒徑，且其表面帶有正電荷，其粒度分散系數(shù)(PDI)小于0.2。

上述PDI的定義為：多分散系數(shù)，代表粒子均勻分散的程度，即粒度分布系數(shù)。該數(shù)值越小，溶液中的粒子分布越均勻。相反地，該數(shù)值越大，溶液中的粒子分布越寬泛。一般認(rèn)為PDI小于0.2的乳液具有單分散性。

本發(fā)明中，所述聚合物脂質(zhì)球的平均粒徑在90-300nm之間，例如列舉粒徑優(yōu)選90-200nm。

本發(fā)明中，所述聚合物納米粒子中可吸附不同濃度的蛋白質(zhì)、多肽或滅活病毒抗原等活性物質(zhì)，也可吸附不同種類的蛋白質(zhì)、多肽或滅活病毒抗原等活性物質(zhì)。也就是說，所述活性物質(zhì)只要表面帶有負(fù)電即可被聚合物納米粒子吸附攜載。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述聚合物納米粒子在制備過程中采用可降解聚合物材料和陽離子脂質(zhì)。其中，陽離子脂質(zhì)鑲嵌在納米粒子表面，具有改變納米粒子表面電荷的功能，同時(shí)也具有穩(wěn)定納米粒子體系的功能。所述可降解聚合物，選自聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乳酸-b-聚乙二醇共聚物、聚乙醇酸、聚內(nèi)酯、聚酸酐、聚三亞甲基碳酸酯、聚對(duì)二氧環(huán)己酮或它們的共聚物。

本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下特點(diǎn)：

(1)本發(fā)明提供的載蛋白質(zhì)、多肽、滅活病毒抗原等活性物質(zhì)的可降解聚合物納米粒子，平均粒徑在90-300nm之間，納米粒子攜載抗原后，可以增加抗原提呈細(xì)胞(APCs)對(duì)抗原的攝取量，提升抗原提呈細(xì)胞活化水平，并提高T細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平。

(2)本發(fā)明提供的載蛋白質(zhì)、多肽、滅活病毒等活性物質(zhì)可降解的聚合物納米粒子，其尺寸均一，分散系數(shù)(PDI)小于0.2，實(shí)驗(yàn)批次間可重復(fù)性好， 確保了納米粒子抗原遞送與佐劑系統(tǒng)體內(nèi)外免疫學(xué)效應(yīng)的可重復(fù)性提供保障。

(3)本發(fā)明提供的納米粒子表面荷正電，可以通過吸附攜載帶負(fù)電的蛋白、多肽或滅活病毒抗原，能夠有效保持抗原活性，同時(shí)還可以攜載分子佐劑如CpG等，可以得到仿病原體顆粒，提供高效免疫應(yīng)答，并且安全性良好。

(4)本發(fā)明提供的改良的快速制備尺寸均一的可降解的聚合物納米粒子的方法，可通過控制制備過程中的油相組成比例和陽離子脂質(zhì)用量等來控制納米粒子的粒徑大小和均一性。

(5)本發(fā)明不需要在水中額外添加穩(wěn)定劑和乳化劑，即可制備得到穩(wěn)定的聚合物納米粒子懸濁液，洗滌程序更容易，且免去了后期測(cè)定殘留等復(fù)雜過程，在提高安全性的同時(shí)有利于降低成本。

(6)本發(fā)明的方法制備條件耗能低、溫和；制備參數(shù)可控性強(qiáng)、重現(xiàn)性好；制備出的納米粒子粒徑均一、可控，利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

總之，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：作為蛋白質(zhì)、多肽、滅活病毒抗原等活性物質(zhì)，該載體可以作為抗原遞送與佐劑系統(tǒng)，通過吸附將抗原等活性物質(zhì)通過吸附攜載在納米粒子表面，增加抗原提呈細(xì)胞(APCs)對(duì)抗原的攝取，提升抗原提呈細(xì)胞活化水平，并提高T細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子的分泌水平。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。

圖1是改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備表面帶有正電的可降解的聚合物納米粒子的流程示意圖；

圖2是改良自乳化溶劑揮發(fā)所制備的納米粒子示意圖，該納米粒子為實(shí)心球體， 且表面荷有正電；

圖3是實(shí)施例1中制備得到的納米粒子的掃描電鏡圖；

圖4是比較例1中制備得到的微球的掃描電鏡照片；

圖5是實(shí)施例2中制備得到的納米粒子的掃描電鏡圖；

圖6是實(shí)施例3中制備得到的納米粒子的掃描電鏡圖；

圖7是實(shí)施例4中制備得到的納米粒子的掃描電鏡圖；

圖8是實(shí)施例5中制備得到的納米粒子的掃描電鏡圖；

圖9是實(shí)施例6中制備得到的納米粒子的掃描電鏡圖；

圖10是實(shí)施例7中制備得到的納米粒子的掃描電鏡圖；

圖11是實(shí)施例18中小鼠血清中IgG水平結(jié)果；

具體實(shí)施方案

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購(gòu)買得到的。

實(shí)施例1

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子(制備流程示意圖如圖1所示，所制備的納米粒子示意圖如圖2所示)，將100mgPLA和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌， 攪拌12小時(shí)，最后離心、洗滌、冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為117nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.138，表面Zeta電位為30.1mV。掃描電鏡照片如圖3所示，結(jié)果表明所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

比較例1

采用膜乳化技術(shù)結(jié)合溶劑揮發(fā)法制備粒徑為1.0μm的DDAB/PLA微球。配制1％的水相PVA溶液作為水相(W)。稱取一定量的PLA和雙十二烷基二甲基溴化銨，溶解于二氯甲烷中作為油相(O)，聚乳酸和雙十二烷基二甲基溴化銨的質(zhì)量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的濃度為5％，室溫充分溶解10-20min。將10mL溶有聚乳酸和雙十二烷基二甲基溴化銨的油相倒入60mL PVA水相中，攪拌制備預(yù)乳液(O/W)，將預(yù)乳液轉(zhuǎn)至快速膜乳化器的儲(chǔ)料罐中，選用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮?dú)鈮毫ο逻^膜3次，制備均一O/W型乳液，隨后將乳液置于通風(fēng)櫥中攪拌過夜，固化微球。固化的微球采用超純水離心洗滌3-5次，即制得粒徑在1μm左右的均一陽離子DDAB/PLA微球。所制備的納微球的掃描電鏡照片如圖4所示，所制備的納微球呈圓整球形，且分散性良好，粒徑均一。

實(shí)施例2

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mgPLA和20mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為10mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心，洗滌，冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其 平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為134.4nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.189，表面Zeta電位為35.7mV。掃描電鏡照片如圖5所示，結(jié)果表明所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

實(shí)施例3

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mgPLA和50mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心，洗滌，冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為177.7nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.209，表面Zeta電位為35.5mV。掃描電鏡照片如圖6所示，結(jié)果表明所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

實(shí)施例4

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mgPLA和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為2∶3；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心，洗滌，冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為139.7nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.139，表面Zeta電位為32.9mV。掃描電鏡照片如圖7所示，結(jié)果表明所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

實(shí)施例5

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mgPLA和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為3∶2；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心，洗滌，冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為121.4nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.139，表面Zeta電位為34.9mV。掃描電鏡照片如圖8所示，結(jié)果表明所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

實(shí)施例6

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mgPLA和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為5mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心，洗滌，冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為145.9nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.158，表面Zeta電位為35.5mV。掃描電鏡照片如圖9所示，結(jié)果表明所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

實(shí)施例7

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mgPLA和30mg雙十二 烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為20mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心，洗滌，冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為225.9nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.156，表面Zeta電位為29.8mV。掃描電鏡照片如圖10所示，結(jié)果表明所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

實(shí)施例8

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mgPLA和30mg[1-(2，3-二油?；?]-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸鹽(DOTAP)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心，洗滌，冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為159.7nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.199，表面Zeta電位為27.9mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

實(shí)施例9

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mgPLA和30mg DC-膽固醇(DC-Chol)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌 12小時(shí)，最后離心，洗滌，冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為185.6nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.179，表面Zeta電位為28.9mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

比較例2

采用膜乳化技術(shù)結(jié)合溶劑揮發(fā)法制備粒徑為1.0μm的DC-Chol/PLA微球。配制1％的水相PVA溶液作為水相(W)。稱取一定量的聚乳酸(PLA)和DC-膽固醇(DC-Chol)，溶解于二氯甲烷中作為油相(O)，PLA和DC-Chol的質(zhì)量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的濃度為5％，室溫充分溶解10-20min。將10mL溶有PLA和DC-Chol的油相倒入60mLPVA水相中，攪拌制備預(yù)乳液(O/W)，將預(yù)乳液轉(zhuǎn)至快速膜乳化器的儲(chǔ)料罐中，選用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮?dú)鈮毫ο逻^膜3次，制備均一O/W型乳液，隨后將乳液置于通風(fēng)櫥中攪拌過夜，固化微球。固化的微球采用超純水離心洗滌3-5次，即制得粒徑在1μm左右的均一陽離子DC-Chol/PLA微球。所制備的納微球呈圓整球形，且分散性良好，粒徑均一。

實(shí)施例10

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mg PLGA和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心、洗滌、冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。 其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為178.6nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.138，表面Zeta電位為26.1mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

實(shí)施例11

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mg PLGA和30mg[1-(2，3-二油?；?]-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸鹽(DOTAP)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心、洗滌、冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為297nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.128，表面Zeta電位為29.1mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

比較例3

采用膜乳化技術(shù)結(jié)合溶劑揮發(fā)法制備粒徑為1.0μm的DOTAP/PLGA微球。配制1％的水相PVA溶液作為水相(W)。稱取一定量的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和[1-(2，3-二油?；?]-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸鹽(DOTAP)，溶解于二氯甲烷中作為油相(O)，PLGA和DOTAP的質(zhì)量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的濃度為5％，室溫充分溶解10-20min。將10mL溶有PLGA和DOTAP的油相倒入60mLPVA水相中，攪拌制備預(yù)乳液(O/W)，將預(yù)乳液轉(zhuǎn)至快速膜乳化器的儲(chǔ)料罐中，選用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮?dú)鈮毫ο逻^膜3次，制備均一O/W型乳液，隨后將乳液置于通風(fēng)櫥中攪拌過夜，固化微球。固化的微球 采用超純水離心洗滌3-5次，即制得粒徑在1μm左右的均一陽離子DOTAP/PLGA微球。所制備的納微球呈圓整球形，且分散性良好，粒徑均一。

實(shí)施例12

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mg PLGA和30mg DC-膽固醇(DC-Chol)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心、洗滌、冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為237nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.145，表面Zeta電位為26.1mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

實(shí)施例13

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mg PELA和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心、洗滌、冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為181.9nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.178，表面Zeta電位為29.4mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

比較例4

采用膜乳化技術(shù)結(jié)合溶劑揮發(fā)法制備粒徑為1.0μm的DDAB/PELA微球。配制1％的水相PVA溶液作為水相(W)。稱取一定量的乳酸-乙二醇共聚物(PELA)和雙十八烷基溴化銨(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作為油相(O)，PELA和DDAB的質(zhì)量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的濃度為5％，室溫充分溶解10-20min。將10mL溶有PELA和DDAB的油相倒入60mL PVA水相中，攪拌制備預(yù)乳液(O/W)，將預(yù)乳液轉(zhuǎn)至快速膜乳化器的儲(chǔ)料罐中，選用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮?dú)鈮毫ο逻^膜3次，制備均一O/W型乳液，隨后將乳液置于通風(fēng)櫥中攪拌過夜，固化微球。固化的微球采用超純水離心洗滌3-5次，即制得粒徑在1μm左右的均一陽離子DDAB/PELA微球。所制備的納微球呈圓整球形，且分散性良好，粒徑均一。

實(shí)施例14

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mg聚乙醇酸(PGA)和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心、洗滌、冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為199.2nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.198，表面Zeta電位為27.1mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

比較例5

采用膜乳化技術(shù)結(jié)合溶劑揮發(fā)法制備粒徑為1.0μm的DDAB/PGA微球。配制1％的水相PVA溶液作為水相(W)。稱取一定量的聚乙醇酸(PGA)和雙十八烷基溴化銨(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作為油相(O)，PGA和DDAB的質(zhì)量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的濃度為5％，室溫充分溶解10-20min。將10mL溶有PGA和DDAB的油相倒入60mLPVA水相中，攪拌制備預(yù)乳液(O/W)，將預(yù)乳液轉(zhuǎn)至快速膜乳化器的儲(chǔ)料罐中，選用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮?dú)鈮毫ο逻^膜3次，制備均一O/W型乳液，隨后將乳液置于通風(fēng)櫥中攪拌過夜，固化微球。固化的微球采用超純水離心洗滌3-5次，即制得粒徑在1μm左右的均一陽離子DDAB/PGA微球。所制備的納微球呈圓整球形，且分散性良好，粒徑均一。

實(shí)施例15

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mg聚內(nèi)酯和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心、洗滌、冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為199.8nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.134，表面Zeta電位為34.1mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

比較例6

采用膜乳化技術(shù)結(jié)合溶劑揮發(fā)法制備粒徑為1.0μm的DDAB/PCL微球。配 制1％的水相PVA溶液作為水相(W)。稱取一定量的聚己內(nèi)酯(PCL)和雙十八烷基溴化銨(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作為油相(O)，PCL和DDAB的質(zhì)量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的濃度為5％，室溫充分溶解10-20min。將10mL溶有PCL和DDAB的油相倒入60mLPVA水相中，攪拌制備預(yù)乳液(O/W)，將預(yù)乳液轉(zhuǎn)至快速膜乳化器的儲(chǔ)料罐中，選用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮?dú)鈮毫ο逻^膜3次，制備均一O/W型乳液，隨后將乳液置于通風(fēng)櫥中攪拌過夜，固化微球。固化的微球采用超純水離心洗滌3-5次，即制得粒徑在1μm左右的均一陽離子DDAB/PCL微球。所制備的納微球呈圓整球形，且分散性良好，粒徑均一。

實(shí)施例16

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mg聚酸酐(PAA)和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心、洗滌、冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為231.7nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.188，表面Zeta電位為35.1mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

比較例7

采用膜乳化技術(shù)結(jié)合溶劑揮發(fā)法制備粒徑為1.0μm的DDAB/PAA微球。配制1％的水相PVA溶液作為水相(W)。稱取一定量的聚酸酐(PAA)和雙十八 烷基溴化銨(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作為油相(O)，PAA和DDAB的質(zhì)量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的濃度為5％，室溫充分溶解10-20min。將10mL溶有PAA和DDAB的油相倒入60mL PVA水相中，攪拌制備預(yù)乳液(O/W)，將預(yù)乳液轉(zhuǎn)至快速膜乳化器的儲(chǔ)料罐中，選用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮?dú)鈮毫ο逻^膜3次，制備均一O/W型乳液，隨后將乳液置于通風(fēng)櫥中攪拌過夜，固化微球。固化的微球采用超純水離心洗滌3-5次，即制得粒徑在1μm左右的均一陽離子DDAB/PAA微球。所制備的納微球呈圓整球形，且分散性良好，粒徑均一。

實(shí)施例17

采用改良自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，將100mg聚三亞甲基碳酸酯(PCS)和30mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相當(dāng)中，油相的體積為15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮為1∶1；然后將去離子水作為水相，水相的體積為90mL；之后將混合均勻的油相緩慢加入到水相當(dāng)中，以400rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，攪拌12小時(shí)，最后離心、洗滌、冷凍干燥，得到的聚合物納米粒子。其平均粒徑和粒徑分布采用英國(guó)馬爾文納米粒度儀(ZetasizerNano ZS90)測(cè)量，在水中的平均粒徑為197.8nm，粒徑分布系數(shù)PDI為0.144，表面Zeta電位為31.1mV，所制備的聚合物納米粒子的粒徑均一。

比較例8

采用膜乳化技術(shù)結(jié)合溶劑揮發(fā)法制備粒徑為1.0μm的DDAB/PCS微球。配制1％的水相PVA溶液作為水相(W)。稱取一定量的聚三亞甲基碳酸酯(PCS)和雙十八烷基溴化銨(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作為油相(O)，PCS和DDAB 的質(zhì)量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的濃度為5％，室溫充分溶解10-20min。將10mL溶有PCS和DDAB的油相倒入60mL PVA水相中，攪拌制備預(yù)乳液(O/W)，將預(yù)乳液轉(zhuǎn)至快速膜乳化器的儲(chǔ)料罐中，選用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮?dú)鈮毫ο逻^膜3次，制備均一O/W型乳液，隨后將乳液置于通風(fēng)櫥中攪拌過夜，固化微球。固化的微球采用超純水離心洗滌3-5次，即制得粒徑在1μm左右的均一陽離子DDAB/PCS微球。所制備的納微球呈圓整球形，且分散性良好，粒徑均一。

實(shí)施例18

采用實(shí)施例1的DDAB/PLA納米球和比較例1的DDAB/PLA微球?qū)ωi圓環(huán)滅活病毒PCV2進(jìn)行吸附攜載，抗原吸附采用BCA法進(jìn)行檢測(cè)，抗原吸附率達(dá)80％以上；隨后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，對(duì)其進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為7組，每組6只，分別DDAB/PLA納米粒子佐劑組、1μm微球佐劑組、純抗原組、不免疫組、商用206油佐劑對(duì)照組和商用15A佐劑對(duì)照組，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，免疫劑量為200μL/只，其中豬圓環(huán)滅活病毒含量10μL(10^6.5TCID₅₀/mL)，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射100μL。分三次免疫，分別于第0天、14天、28天免疫。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)即一免后14天、28天、35天，進(jìn)行靜脈取血，測(cè)定血清中特異性抗體IgG的含量，抗體結(jié)果如圖11所示，結(jié)果表明，納米粒子的免疫效果顯著優(yōu)于1μm微球佐劑組和商品化206油佐劑組，與商用佐劑15抗體水平相近，表明DDAB/PLA納米佐劑具有良好的佐劑效果。

實(shí)施例19

采用實(shí)施例9的DC-Chol/PLA納米球和比較例2的DC-Chol/PLA微球?qū)δ?式抗原OVA進(jìn)行吸附攜載，抗原吸附采用BCA法進(jìn)行檢測(cè)，抗原吸附率達(dá)80％以上；隨后采用C57小鼠(雌性，4-6周)，對(duì)其進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為五組，每組6只，分別為不免疫組、純抗原組、DC-Chol/PLA納米粒子佐劑組、1μm的DC-Chol/PLA微球佐劑組和鋁鹽佐劑對(duì)照組，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，免疫劑量為100μL/只，其中OVA含量為25mg，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射50μL。分三次免疫，分別于第0天、14天、28天進(jìn)行免疫。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間第14天、28天、38天，進(jìn)行靜脈取血，測(cè)定血清中特異性抗體IgG含量，結(jié)果表明100nm納米球佐劑組抗體水平顯著高于鋁鹽佐劑組和1μm佐劑組，其中納米佐劑組抗體水平是1μm佐劑組的5～6倍。

實(shí)施例20

采用實(shí)施例11的DOTAP/PLGA納米球和比較例3的DOTAP/PLGA微球?qū)α鞲辛呀庖呙鏗1N1進(jìn)行吸附攜載，抗原吸附采用BCA法進(jìn)行檢測(cè)，抗原吸附率達(dá)80％以上；隨后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，對(duì)其進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為五組，每組6只，分別為不免疫組、純抗原組、DOTAP/PLGA納米球組、1μm DOTAP/PLGA組和鋁鹽佐劑對(duì)照組，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，免疫劑量為100μL/只，其中流感疫苗HA含量為3μg，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射50μL。分兩次免疫，分別于第0天、14天進(jìn)行免疫。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間14天、28天，進(jìn)行靜脈取血，測(cè)定血清中特異性抗體IgG和血凝抑制抗體HI的檢測(cè)，結(jié)果表明，納米球佐劑組優(yōu)于鋁鹽佐劑組和微米球佐劑組，顯示了優(yōu)良的佐劑性能。

實(shí)施例21

采用實(shí)施例13的DDAB/PELA納米球和比較例4的DDAB/PELA微球?qū)Χ嚯囊呙鏗PV進(jìn)行吸附攜載，抗原吸附采用BCA法進(jìn)行檢測(cè)，抗原吸附率達(dá)80％以上；隨后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，對(duì)其進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為五組，每組6只，分別為不免疫組、純抗原組、DDAB/PELA納米粒子佐劑組、1μm的DDAB/PELA微球佐劑組和鋁鹽佐劑對(duì)照組，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，免疫劑量為100μL/只，其中多肽疫苗10μg，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射50μL。分兩次免疫，分別于第0天、28天免疫。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間第14天、28天、38天，進(jìn)行靜脈取血，測(cè)定血清中特異性抗體IgG含量，結(jié)果表明納米粒子的免疫效果顯著優(yōu)于其他組別。

實(shí)施例22

采用實(shí)施例14的DDAB/PGA納米球和比較例5的DDAB/PGA微球?qū)α鞲蠨NA疫苗進(jìn)行吸附攜載，DNA吸附采用BCA法進(jìn)行檢測(cè)，抗原吸附率達(dá)80％以上；隨后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，對(duì)其進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為五組，每組6只，分別為不免疫組、純抗原組、DDAB/PGA納米粒子佐劑組、1μm的DDAB/PGA微球佐劑組和鋁鹽佐劑對(duì)照組，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，免疫劑量為100μL/只，其中流感疫苗DNA含量為10μg，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射50μL。分三次免疫，分別于第0天、14天、28天進(jìn)行免疫。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間第14天、28天、38天，進(jìn)行靜脈取血，測(cè)定血清中特異性抗體IgG含量，檢測(cè)結(jié)果表明，納米粒子的免疫效果顯著優(yōu)于1μm微球佐劑組和鋁鹽佐劑組。

實(shí)施例23

采用實(shí)施例15的DDAB/PCL納米球和比較例6的DDAB/PCL微球?qū)μ烤乙呙鐁PA進(jìn)行吸附攜載，抗原吸附量采用BCA法進(jìn)行檢測(cè)，抗原吸附率達(dá)80％以上；隨后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，對(duì)其進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為五組，每組6只，分別為不免疫組、純抗原組、DDAB/PCL納米粒子佐劑組、1μm的DDAB/PCL微球佐劑組和鋁鹽佐劑對(duì)照組，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，采用背部皮下免疫方式，免疫劑量為100μL/只，其中rPA含量5μg。分三次免疫，分別于第0天、14天、28天進(jìn)行免疫。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間第14天、28天、38天，進(jìn)行靜脈取血，測(cè)定血清中特異性抗體IgG含量，檢測(cè)結(jié)果表明納米粒子佐劑組的免疫效果顯著優(yōu)于1μm的微球佐劑組和鋁鹽佐劑組。

實(shí)施例24

采用實(shí)施例16的DDAB/PAA納米球和比較例7的DDAB/PAA微球?qū)μ烤乙呙鐁PA進(jìn)行吸附攜載，抗原吸附量采用BCA法進(jìn)行檢測(cè)，抗原吸附率達(dá)80％以上；隨后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，對(duì)其進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為五組，每組6只，分別為不免疫組、純抗原組、DDAB/PAA納米粒子佐劑組、1μm的DDAB/PAA微球佐劑組和鋁鹽佐劑對(duì)照組，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，采用背部皮下免疫方式，免疫劑量為100μL/只，其中rPA含量5μg。分三次免疫，分別于第0天、14天、28天進(jìn)行免疫。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間第14天、28天、38天，進(jìn)行靜脈取血，測(cè)定血清中特異性抗體IgG含量，檢測(cè)結(jié)果表明納米粒子佐劑組的免疫效果顯著優(yōu)于1μm的微球佐劑組和鋁鹽佐劑組。

實(shí)施例25

采用實(shí)施例17的DDAB/PCS納米球和比較例8的DDAB/PCS微球?qū)μ烤?疫苗rPA進(jìn)行吸附攜載，抗原吸附量采用BCA法進(jìn)行檢測(cè)，抗原吸附率達(dá)80％以上；隨后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，對(duì)其進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為五組，每組6只，分別為不免疫組、純抗原組、DDAB/PCS納米粒子佐劑組、1μm的DDAB/PCS微球佐劑組和鋁鹽佐劑對(duì)照組，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，采用背部皮下免疫方式，免疫劑量為100μL/只，其中rPA含量5μg。分三次免疫，分別于第0天、14天、28天進(jìn)行免疫。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間第14天、28天、38天，進(jìn)行靜脈取血，測(cè)定血清中特異性抗體IgG含量，檢測(cè)結(jié)果表明納米粒子佐劑組的免疫效果顯著優(yōu)于1μm的微球佐劑組和鋁鹽佐劑組。