本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體來說，涉及一種白蛋白與蒽環(huán)霉素類抗癌藥的分子復(fù)合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：蒽環(huán)霉素類抗癌藥，例如阿霉素(doxorubicin，DOX)，廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于治療白血病、淋巴瘤、軟組織腫瘤和固體腫瘤，特別對乳腺癌和肺癌具有顯著療效。普遍認(rèn)為，蒽環(huán)霉素類抗癌藥通過與DNA的相互作用，或者對拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制作用，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而起到殺傷細(xì)胞的作用。但是蒽環(huán)霉素類抗癌藥對肝、腎和心臟等正常組織的副作用嚴(yán)重危害患者的健康，特別是其心臟毒性，可以造成患者心肌衰竭，甚至導(dǎo)致患者的死亡。因此，減少蒽環(huán)霉素類抗癌藥的副作用、增加其腫瘤靶向性，對于改善蒽環(huán)霉素類抗癌藥的治療效果顯得尤為重要?，F(xiàn)有技術(shù)已知用白蛋白納米粒包裹阿霉素，即，使白蛋白變性發(fā)生分子之間共價交聯(lián)團(tuán)聚成直徑大約為200nm的顆粒，從而將阿霉素固定在納米粒的內(nèi)部。由于白蛋白分子之間發(fā)生了相互共價連接團(tuán)聚成納米顆粒，導(dǎo)致白蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而增加了人體發(fā)生免疫反應(yīng)的可能性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明將蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽分子用白蛋白分子或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子非共價地包裹形成分子復(fù)合物，在分子復(fù)合物中，無論是蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽分子還是白蛋白分子或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子，均保持了原有的分子結(jié)構(gòu)，一方面不會改變蒽環(huán)霉素類抗癌藥 或其可藥用鹽在人體內(nèi)的代謝，另一方面也不會因白蛋白分子或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導(dǎo)致其免疫原性增加。更重要的是，本發(fā)明的分子復(fù)合物不僅降低了蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽的毒性，特別是心臟毒性，而且還顯著提高了蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽的抗癌效果。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及一種分子復(fù)合物，其中所述分子復(fù)合物由白蛋白或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白與蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽形成，在該分子復(fù)合物中，至少1個蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽分子被非共價地包裹在1個白蛋白分子或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子中。本發(fā)明的腫瘤靶向基團(tuán)選自由尿激酶受體抑制劑、RGD肽及其衍生物和轉(zhuǎn)鐵蛋白所組成的組，優(yōu)選尿激酶受體抑制劑，包括但不限于有機小分子抑制劑、多肽或蛋白抑制劑，例如尿激酶受體的抗體抑制劑、尿激酶受體的天然配體的氨基末端，更優(yōu)選由尿激酶受體的天然配體的氨基末端143個氨基酸所組成的多肽。靶向基團(tuán)可以通過共價或非共價方式連接到白蛋白上。修飾有尿激酶受體抑制劑的白蛋白統(tǒng)稱為尿激酶受體靶向白蛋白(uPARtargetingalbumin，UTA)。本發(fā)明所使用的修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白可以通過市售得到或者利用本領(lǐng)域已知的方法制備得到。本發(fā)明中所使用的白蛋白可以為人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin，HSA)、牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)或其他動物的血清白蛋白，優(yōu)選人血清白蛋白。本發(fā)明中的蒽環(huán)霉素類抗癌藥選自阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表阿霉素和阿克拉霉素，優(yōu)選阿霉素。蒽環(huán)霉素類抗癌藥的可藥用鹽包括從有機酸或無機酸生成的鹽，例如(但不限于)鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、甲磺酸鹽、草酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、山梨酸鹽和水楊酸鹽組成的組，優(yōu)選鹽酸鹽。在本發(fā)明中，所述白蛋白分子或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子中至少包裹1個，優(yōu)選包裹2個，或者3個蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽分子，最優(yōu)選包裹1個蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽分子。該包裹利用的是被包裹的蒽環(huán)霉素類抗癌藥物或其可藥用鹽分子的空間結(jié)構(gòu)的尺寸大小和自身疏水性與白蛋白的口袋結(jié)構(gòu)的匹配性。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及一種制備白蛋白或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白與蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽形成的分子復(fù)合物的方法，包括如下步驟：(1)將含有蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽的溶液加入到含有鹽和白蛋白或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白的緩沖溶液中，避光反應(yīng)2-24小時，優(yōu)選8-16小時，更優(yōu)選10-14小時，最優(yōu)選約12小時，其中：蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽的濃度優(yōu)選不超過20μM，更優(yōu)選5-15μM，最優(yōu)選約10μM；蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽與白蛋白或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白的摩爾比優(yōu)選至少為2:1，更優(yōu)選3-8:1，最優(yōu)選約5:1；緩沖溶液中鹽的濃度優(yōu)選為20-100mM，更優(yōu)選40-60mM，最優(yōu)選約50mM，緩沖溶液的pH值優(yōu)選為7.5-8.5，更優(yōu)選7.8-8.2，最優(yōu)選約8.0；(2)用預(yù)處理的陰離子交換柱進(jìn)行純化，用含鹽的緩沖溶液洗脫，其中：緩沖溶液中鹽的濃度優(yōu)選為100-500mM，更優(yōu)選200-400mM，最優(yōu)選約300mM，緩沖溶液的pH值優(yōu)選為7.5-8.5，更優(yōu)選7.8-8.2，最優(yōu)選約8.0；(3)透析并濃縮后得到所述分子復(fù)合物，其中，至少1個(優(yōu)選2個或3個，最優(yōu)選1個)蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽分子被非共價地包裹在1個白蛋白分子或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子中。在上述制備方法中，含有蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽的溶液為DMSO溶液、水溶液或DMF溶液，優(yōu)選DMSO溶液；含有鹽和白蛋白或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白的緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，優(yōu)選Tris-HCl緩沖溶液，鹽為NaCl或KCl，優(yōu)選NaCl；陰離子交換柱為DEAE柱或 Qsepharose柱，優(yōu)選DEAE柱；洗脫用的緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，優(yōu)選Tris-HCl緩沖液，其中含有的鹽為NaCl或KCl，優(yōu)選NaCl；透析用PBS緩沖溶液；濃縮用超濾管。其中，陰離子交換柱在使用前按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理，例如，先用水將陰離子交換柱沖洗干凈，再用含有10-150mM，更優(yōu)選20-100mM，最優(yōu)選約50mM的鹽(NaCl或KCl)的Tris-HCl緩沖溶液(pH8)對陰離子交換柱進(jìn)行平衡。本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的分子復(fù)合物的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以是經(jīng)口藥物組合物或者注射用藥物組合物，優(yōu)選注射用藥物組合物。本發(fā)明的注射用藥物組合物可以為液體注射藥物組合物或凍干粉針劑。本發(fā)明的藥物組合物中優(yōu)選進(jìn)一步含有本領(lǐng)域常用的可藥用輔料，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠根據(jù)實際需要選擇合適的可藥用輔料。在本發(fā)明的藥物組合物中所含有的分子復(fù)合物的量是治療有效量的(例如，0.125-0.25μM/kg)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過本領(lǐng)域的常規(guī)實驗確定藥物組合物中分子復(fù)合物的合適含量。本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的分子復(fù)合物在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。本發(fā)明的分子復(fù)合物可治療的腫瘤包括但不限于霍奇金病、淋巴肉瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤)、未分化小細(xì)胞性和非小細(xì)胞性肺癌、乳腺癌、急性淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞白血病、骨肉瘤、軟組織肉瘤、卵巢癌、睪丸腫瘤、膀胱癌、腎母細(xì)胞癌、前列腺癌、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞癌、食管癌、胃癌、原發(fā)性肝癌、宮頸癌及頭頸癌、多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌及腦瘤等等。在本發(fā)明的分子復(fù)合物中，蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽分子被非共價地包裹在白蛋白或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子的內(nèi)部，具體來說結(jié)合在靠近白蛋白分子W214色氨酸的位點(藥物結(jié)合位點I，位于白蛋白的IIA結(jié)構(gòu)域)，這種包裹并不適用于所有的藥物分子，對于阿霉素等蒽環(huán)霉素類抗癌藥 物來說，其空間結(jié)構(gòu)的尺寸大小和自身疏水性與白蛋白的“口袋”是相匹配的。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：(1)蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽分子與白蛋白或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子以非共價的方式形成分子復(fù)合物，從而在分子復(fù)合物中均保持了各自原有的分子結(jié)構(gòu)。包裹了蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽分子的白蛋白或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子彼此不發(fā)生團(tuán)聚。一方面不會改變蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽在人體內(nèi)的代謝，另一方面也不會因白蛋白分子或修飾有腫瘤靶向基團(tuán)的白蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導(dǎo)致其免疫原性增加；(2)本發(fā)明的制備工藝操作簡單，易于大量生產(chǎn)；(3)本發(fā)明的分子復(fù)合物具有很好的穩(wěn)定性，易儲存；(4)本發(fā)明的分子復(fù)合物進(jìn)一步提高了蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽對腫瘤的靶向性，降低了細(xì)胞特別是非腫瘤細(xì)胞的攝取量，降低了蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽的毒性，特別是心臟毒性，而且還顯著提高了蒽環(huán)霉素類抗癌藥或其可藥用鹽的抗癌效果。附圖說明：圖1為分子復(fù)合物的表征。圖2為UTA:DOX分子復(fù)合物與負(fù)載DOX的白蛋白納米顆粒(Nab:DOX)的結(jié)構(gòu)對比圖。圖3為H1299和HELF兩種細(xì)胞對UTA:DOX和DOX的攝取。圖4為H1299和HELF兩種細(xì)胞對UTA:DOX和HSA:DOX的攝取。圖5為UTA:DOX、HSA:DOX和DOX對H1299細(xì)胞的毒性。圖6為UTA:DOX對腫瘤的靶向能力。圖7為UTA:DOX的抗腫瘤效果及心臟毒性分析。具體實施方式本發(fā)明通過如下實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，以下實施例不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，任何在本發(fā)明基礎(chǔ)上做出的改進(jìn)和變化都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實施例1、阿霉素與白蛋白分子復(fù)合物(HSA:DOX)或阿霉素與尿激酶受體靶向白蛋白分子(UTA:DOX)復(fù)合物(UTA:DOX)的制備(1)UTA的表達(dá)、純化與表征：將載有表達(dá)有尿激酶受體的天然配體的氨基末端143個氨基酸所組成的多肽修飾的人血清白蛋白(UTA)(其中尿激酶受體的天然配體氨基末端的第143位氨基酸與人血清白蛋白第1位氨基酸相連)基因的畢赤酵母在真核表達(dá)體系中表達(dá)，每隔24h，補加甲醇至終濃度為1％。誘導(dǎo)表達(dá)4d后，4℃，7000rpm，10min離心去除菌體，調(diào)節(jié)上清液pH為7.4，用0.22μm濾膜過濾，然后將鎳填料用水沖洗干凈，將0.2M的硫酸鎳溶液流過鎳填料，使填料與硫酸鎳充分相互作用，隨后用20mMTris-HCl緩沖溶液(pH7.4)沖洗鎳柱，將硫酸鎳溶液沖洗干凈，同時達(dá)到平衡鎳柱的目的，將上述除去菌體的濾液用預(yù)處理的鎳柱純化，用含有500mM咪唑的Tris-HCl緩沖溶液洗脫，然后透析除去咪唑，得到目的蛋白UTA，用12％的SDS-PAGE檢測目的蛋白的情況，結(jié)果如圖1a所示。(2)UTA:DOX的制備與純化：將20mM的阿霉素DMSO溶液滴加到含有UTA的緩沖溶液(20mMTris-HCl，50mMNaCl，pH8.0)中，阿霉素的濃度為10μM，并且阿霉素與UTA的摩爾比為5:1，避光反應(yīng)12小時后，隨后，對DEAE柱進(jìn)行預(yù)處理，先用水將DEAE柱沖洗干凈，再用含有50mMNaCl的20mMTris-HCl緩沖溶液(pH8)對DEAE柱進(jìn)行平衡，反應(yīng)溶液用經(jīng)過預(yù)處理的DEAE柱純化，用含有300mMNaCl的Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0)洗脫，除去沒有被UTA包裹的DOX，用PBS透析，除去NaCl，通過超濾管濃縮，得到UTA:DOX，于4℃避光保存。(3)HSA:DOX的制備與純化：將20mM的阿霉素DMSO溶液滴加到含有HSA的緩沖溶液(20mMTris-HCl，50mMNaCl，pH8.0)中，阿霉素的濃度為10μM，并且阿霉素與HSA的摩爾比為5:1，避光反應(yīng)12小時后，隨后，對DEAE柱進(jìn)行預(yù)處理，先用水將DEAE柱沖洗干凈，再用含有50mMNaCl的20mMTris-HCl緩沖溶液(pH8)對DEAE柱進(jìn)行平衡，反應(yīng)溶液用經(jīng)過預(yù)處理的DEAE柱純化，用含有300mMNaCl的Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0)洗脫，除去沒有被HSA包裹的DOX，用PBS透析，除去NaCl，通過超濾管濃縮，得到HSA:DOX，于4℃避光保存。(4)HSA:DOX和UTA:DOX的表征用12％的SDS-PAGE檢測UTA:DOX和HSA:DOX，結(jié)果如圖1a所示，將UTA:DOX與UTA進(jìn)行比較，將HSA:DOX與HSA進(jìn)行比較，UTA:DOX和HSA:DOX的分子量均與其目的分子量一致，分別為84kD和66kD。檢測UTA、DOX和UTA:DOX的紫外可見光譜，結(jié)果如圖1b所示，UTA:DOX與UTA不同，具有DOX的特征吸收峰，這表明DOX確實存在于UTA:DOX中。進(jìn)一步檢測UTA:DOX與UTA在280nm激發(fā)下的熒光光譜，以及UTA:DOX與DOX在490nm激發(fā)下的熒光光譜，結(jié)果分別如圖1c和圖1d所示，UTA:DOX的熒光與相同濃度的UTA相比有少許淬滅，UTA:DOX的熒光與相同濃度的DOX相比有明顯的淬滅。UTA與DOX之間存在相互淬滅現(xiàn)象，證明其存在相互作用。由于在HSA中只有W214位的色氨酸是熒光基團(tuán)，因此，DOX結(jié)合在靠近W214色氨酸的位點(藥物結(jié)合位點I，位于白蛋白的IIA結(jié)構(gòu)域)，由此判斷，在UTA:DOX中，DOX是被包裹在UTA的口袋中。分別對UTA:DOX和HSA:DOX中的白蛋白和DOX分別進(jìn)行定量，其中，采用DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線法對DOX進(jìn)行定量，采用BCA試劑盒對白蛋白進(jìn)行定量。結(jié)果表明，在UTA:DOX和HSA:DOX中，UTA/HSA和DOX的比例都是1:1。本發(fā)明的分子復(fù)合物，由于制備條件溫和，保持了HSA的天然空間結(jié)構(gòu)，與現(xiàn)有技術(shù)中用白蛋白納米粒包裹阿霉素明顯不同的是，本發(fā)明的分子復(fù)合物不存在白蛋白的團(tuán)聚現(xiàn)象(～200nm)。本發(fā)明分子復(fù)合物和現(xiàn)有技術(shù)中包裹阿霉素的白蛋白納米粒在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別參見圖2。實施例2、UTA:DOX和HSA:DOX的體外毒性試驗(1)H1299細(xì)胞和HELF細(xì)胞對UTA:DOX和HSA:DOX的體外攝取H1299(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，使用購自美國Gibco公司的1640培養(yǎng)基培養(yǎng))是尿激酶受體(uPAR)高表達(dá)的細(xì)胞，而HELF(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，使用購自美國Gibco公司的1640培養(yǎng)基培養(yǎng))是uPAR低表達(dá)的細(xì)胞。將H1299的細(xì)胞懸液(2×105個細(xì)胞/ml)200μl加入到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別加入DOX和UTA:DOX，使其終濃度均為5μM，分別于孵育0h、4h、8h、16h、24h后，用2％SDS和1％NaOH溶液裂解細(xì)胞，分別采用DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線法和BCA試劑盒檢測裂解液中的DOX和白蛋白的含量。按照前述相同的方法進(jìn)行HELF細(xì)胞對DOX和UTA:DOX的攝取實驗，結(jié)果如圖3所示，無論是uPAR高表達(dá)的H1299細(xì)胞，還是uPAR低表達(dá)的HELF細(xì)胞，攝取DOX的量均明顯高于其攝取UTA:DOX的量，8h后這種差別達(dá)到了10倍以上。這種細(xì)胞攝取量的減少，特別是uPAR低表達(dá)的細(xì)胞攝取量的減少，對于降低阿霉素的副作用是有利的。另外，按照前述相同的方法進(jìn)行H1299細(xì)胞和HELF細(xì)胞對UTA:DOX和HSA:DOX的攝取實驗，結(jié)果如圖4所示，uPAR高表達(dá)的H1299細(xì)胞攝取UTA:DOX的量高于其攝取HSA:DOX的量，24h時前者是后者的大約2倍，而uPAR低表達(dá)的HELF細(xì)胞攝取UTA:DOX的量和HSA:DOX的量基本一致。UTA:DOX在uPAR高表達(dá)細(xì)胞中相對較高的攝取量表明UTA:DOX具有靶向性。(2)UTA:DOX和HSA:DOX對uPAR高表達(dá)的H1299細(xì)胞的毒性使用ECIS技術(shù)評價UTA:DOX的細(xì)胞毒性，由于死細(xì)胞不會貼壁從而不會像活的貼壁細(xì)胞一樣對電阻有貢獻(xiàn)，因此ECIS技術(shù)通過測量貼壁細(xì)胞的電阻值，來反映細(xì)胞的存活狀態(tài)。選取能夠貼壁的腫瘤細(xì)胞H1299作為實驗細(xì)胞，在5％CO2,37℃培養(yǎng)箱中按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)、傳代，直至細(xì)胞生長旺盛。將2×105個細(xì)胞置于ECIS檢測板(8W10E)中，儀器參數(shù)為16000Hz，數(shù)據(jù)采集間隔為60s，待細(xì)胞貼壁、電阻值穩(wěn)定后，分別加入DOX、HSA:DOX和UTA:DOX，使其終濃度均為50μM，以PBS緩沖液為陰性對照組，數(shù)據(jù)記錄12h后，對細(xì)胞進(jìn)行拍照，記錄細(xì)胞密度和形態(tài)，結(jié)果如圖5所示：圖5a顯示，對照組細(xì)胞的電阻曲線持續(xù)增長，表明細(xì)胞存活良好，HSA:DOX組的電阻曲線增長較對照組慢，UTA:DOX組的電阻曲線增長較HSA:DOX組慢，明UTA:DOX和HSA:DOX具有一定的細(xì)胞毒性，UTA:DOX的細(xì)胞毒性比HSA:DOX大可能是由于細(xì)胞對UTA:DOX的攝取量比HSA:DOX大。DOX組的電阻曲線基本上未增長，并自5h后電阻曲線逐漸下降，即細(xì)胞開始逐漸死亡，表明DOX具有比UTA:DOX和HSA:DOX更強的細(xì)胞毒性。圖5b顯示，與對照組和UTA:DOX組細(xì)胞相比，DOX組細(xì)胞大部分變成了細(xì)胞碎片。實施例3、UTA:DOX對的荷瘤小鼠腫瘤的靶向能力、抗腫瘤效果以及心臟毒性(1)UTA:DOX對的荷瘤小鼠腫瘤的靶向能力按標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟建立雄性昆明種小鼠H22肝癌模型：將uPAR高表達(dá)的H22肝癌細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)接種在雄性昆明種小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)腹腔內(nèi)，5-7天后取其腹水瘤液，用無菌生理鹽水將腹水瘤液中的H22肝癌細(xì)胞稀釋為濃度為1.0×107個細(xì)胞/ml，在無菌條件下，接種于各受試鼠背部皮下，0.2ml/只。將建模成功的10只小鼠隨機分為2組，每組5只，分別為：UTA:DOX實驗組(UTA:DOX的劑量為5μM/kg小鼠體重)和DOX對照組(DOX的劑量為5μM/kg小鼠體重)。待小鼠背部腫瘤長至約75mm3，按上述劑量于尾靜脈注射給藥，分別于注射后3h、6h、12h、24h和48h用IVISLuminaII小動物成像系統(tǒng)(CaliperLifeSciences,Inc.Hopkinton,MA,USA)進(jìn)行腫瘤靶向性的分析，圖6a顯示成像結(jié)果，圖6b顯示成像結(jié)果經(jīng)過IVIS圖像處理軟件處理后的定量結(jié)果。結(jié)果表明，在實驗中每一時間點，小鼠腫瘤部位UTA:DOX的量比DOX的量都要多，特別是在開始的6h內(nèi)，UTA:DOX能快速地富集到腫瘤部位，比DOX的量高出大約4倍。(2)UTA:DOX對的荷瘤小鼠的抗腫瘤效果及心臟毒性將按照前述方法建模成功的24只小鼠隨機分為3組，每組8只，分別為：UTA:DOX實驗組(UTA:DOX劑量為5μM/kg小鼠體重)、DOX對照組(DOX劑量為5μM/kg小鼠體重)和生理鹽水陰性對照組(劑量為0.1ml/10g小鼠體重)。待小鼠背部腫瘤長至約75mm3，按上述劑量于尾靜脈注射給藥，分別于注射后，每天使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長、寬，按1/2×(長×寬2)公式計算并記錄腫瘤體積，在第7天將小鼠處死，摘除心臟，用石蠟包埋，切片后對心臟進(jìn)行組織病理學(xué)分析。結(jié)果如圖7所示：圖7a為腫瘤生長曲線，DOX初期對腫瘤顯示出抑制作用，但4天之后這種作用逐漸變?nèi)?，失去對腫瘤生長的抑制作用，UTA:DOX顯示出比DOX明顯更好的抑瘤效果，6天后，UTA:DOX實驗組的小鼠腫瘤體積僅是DOX對照組的大約60％。圖7b、7c和7d分別為生理鹽水陰性對照組、UTA:DOX實驗組、DOX對照組小鼠的心臟切片，與生理鹽水陰性對照組小鼠的心臟組織切片相比，經(jīng)過DOX對照組小鼠的心臟組織切片顯示其心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間的連接出現(xiàn)裂縫，并且肌原纖維明顯減少，表明DOX對小鼠心臟造成嚴(yán)重的損傷，而UTA:DOX實驗組的心臟組織切片與生理鹽水陰性對照組小鼠相比沒有明顯變化，這表明UTA:DOX的心臟毒性比DOX明顯要低。實施例4、UTA:DOX注射用水針劑取1.5gUTA:DOX溶解于30ml注射用水中，經(jīng)0.22μm過濾膜過濾后，分裝于5ml安剖瓶中，每瓶5ml，得注射用水針劑。實施例5、HSA:DOX注射用粉針劑取1.2gHSA:DOX溶解于30ml注射用水中，經(jīng)0.22μm過濾膜過濾后，分裝于5ml安剖瓶中，每瓶5ml，冷凍干燥得注射用粉針劑。實施例6、穩(wěn)定性實驗將實施例4制備得到的注射用水針劑于4℃避光保存，分別于保存1m、3m、6m后，分別經(jīng)實施例1中的DEAE柱純化，去除可能存在的未被包裹的DOX，利用實施例1中的方法檢測并計算UTA和DOX的偶合比，結(jié)果見下表：1m3m6mDOX與UTA偶合比0.98:11.05:11.07:1上述結(jié)果表明UTA:DOX分子復(fù)合物具有較高的穩(wěn)定性。參考文獻(xiàn)[1]S.Bae,K.Ma,T.H.Kim,E.S.Lee,K.T.Oh,E.-S.Park,K.C.Lee,Y.S.Youn,Doxorubicin-loadedhumanserumalbuminnanoparticlessurface-modifiedwithTNF-relatedapoptosis-inducingligandandtransferrinfortargetingmultipletumortypes,Biomaterials,33(2012)1536-1546.[2]Y.Barenholz,Doxil(R)--thefirstFDA-approvednano-drug:lessonslearned,JControlRelease,160(2012)117-134.[3]A.O.Elzoghby,W.M.Samy,N.A.Elgindy,Albumin-basednanoparticlesaspotentialcontrolledreleasedrugdeliverysystems,JControlRelease,157(2012)168-182.[4]J.A.Ho,N.C.Fan,A.F.Jou,L.C.Wu,T.P.Sun,MonitoringthesubcellularlocalizationofdoxorubicininCHO-K1usingMEKC-LIF:liposomalcarrierforenhanceddrugdelivery,Talanta,99(2012)683-688.[5]Y.Kalender,M.Yel,S.Kalender,Doxorubicinhepatotoxicityandhepaticfreeradicalmetabolisminrats.TheeffectsofvitaminEandcatechin,Toxicology,209 (2005)39-45.[6]F.Kratz,DOXO-EMCH(INNO-206):thefirstalbumin-bindingprodrugofdoxorubicintoenterclinicaltrials,ExpertOpiniononInvestigationalDrugs,16(2006)855-866.[7]Y.Octavia,C.G.Tocchetti,K.L.Gabrielson,S.Janssens,H.J.Crijns,A.L.Moens,Doxorubicin-inducedcardiomyopathy:frommolecularmechanismstotherapeuticstrategies,JMolCellCardiol,52(2012)1213-1225.[8]F.Perche,N.R.Patel,V.P.Torchilin,Accumulationandtoxicityofantibody-targeteddoxorubicin-loadedPEG-PEmicellesinovariancancercellspheroidmodel,JControlRelease,164(2012)95-102.[9]Blasi,F.；Carmeliet,P.uPAR:aversatilesignallingorchestrator.Naturereviews.Molecularcellbiology2002,3,(12),932-943.[10]Smith,H.W.；Marshall,C.J.RegulationofcellsignallingbyuPAR.Naturereviews.Molecularcellbiology2010,11,(1),23-36.這些文獻(xiàn)全文引入本文作為參考。當(dāng)前第1頁1 2 3