本發(fā)明屬藥物制藥領(lǐng)域，涉及硫化氫在制藥中的新的藥物用途，尤其涉及硫化氫在制備治療炎癥性貧血藥物中的用途。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了鐵是一切生命體不可缺少的必需微量元素，也是人體中最豐富的過渡金屬元素；研究顯示，鐵穩(wěn)態(tài)必須借助于鐵離子的吸收、攝取、利用、儲存各個環(huán)節(jié)間的協(xié)調(diào)，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都將導致鐵含量的變化；鐵含量過高或者過低都將影響機體的生物學活性；如，鐵缺乏會引發(fā)以貧血為主要臨床癥狀的機體代謝紊亂；缺鐵性貧血是全世界范圍內(nèi)最常見的一種營養(yǎng)素缺乏病，在發(fā)展中國家尤為突出；有統(tǒng)計顯示，在中國缺鐵性貧血的發(fā)病率2002年為15％。

研究報道，硫化氫(hydrogen sulfide，H₂S)是一種重要的氣體小分子，其已成為繼NO和CO之后的第三種生物氣體信號分子(gasotransmitter)；催化H2S生成的酶遍布于機體循環(huán)、呼吸、免疫、神經(jīng)、消化和生殖等各個系統(tǒng)；上述酶包括CBS(cystathionine beta-synthase，胱硫醚β-合酶),CSE(cystathionine gamma-lyase，胱硫醚γ-裂解酶；也名as gamma-cystathionase)和3-MST(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶)；所述CBS和CSE主要存在于細胞漿中，而所述3-MST主要存在于線粒體內(nèi)(Predmore et al.,2012)；硫氫化鈉(Sodium hydrosulfide，NaSH)是一種常用的硫化氫的快速釋放劑，其被廣泛用于硫化氫的研究；與上述其它兩種生物氣體信號分子NO和CO一樣,所述H₂S具有擴張血管的作用以及在炎癥反應(yīng)中有重要的功能(Paul and Snyder,2012)。然而，迄今為止，尚未見有關(guān)硫化氫與鐵代謝是否有關(guān)以及硫化氫對炎癥性貧血的作用的研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供硫化氫在制藥中的新的藥用用途，尤其涉及硫化氫在 制備治療炎癥性貧血藥物中的用途。

本發(fā)明中，進行了硫化氫對正常小鼠以及炎癥性貧血小鼠血清鐵的影響實驗，在細胞和動物水平觀察研究硫化氫是否通過影響鐵代謝蛋白影響血清鐵的機制等；本發(fā)明中，以C57B6為小鼠模型，采用脂多糖和硫氫化鈉進行干預，6和24小時后檢測血清鐵，不飽和鐵結(jié)合能力，總鐵結(jié)合能力和載鐵飽和度，以及利用western blot檢測脾臟樣本攝鐵蛋白TFR以及排鐵蛋白FPN蛋白表達水平；同時利用腹腔誘導的原代巨噬細胞為細胞模型，用脂多糖和硫氫化鈉干預6小時和24小時，western blot檢測攝鐵蛋白TFR以及排鐵蛋白FPN蛋白表達水平；實驗結(jié)果顯示：生理情況下，硫化氫通過增加TFR蛋白表達顯著增加小鼠血清鐵及載鐵飽和度；針對炎癥性貧血小鼠模型，硫化氫通過抑制脂多糖導致的TFR和FPN蛋白下降，顯著抑制脂多糖導致的血清鐵和載鐵飽和度的下降；針對腹腔誘導的原代巨噬細胞，生理情況下，硫化氫顯著的增加TFR蛋白表達，針對脂多糖處理的細胞模型，硫化氫可抑制脂多糖導致的TFR的下降。

本發(fā)明實驗結(jié)果證實，所述的硫化氫可用于制備治療炎癥性貧血的藥物。

本發(fā)明中，提供了有關(guān)縮略詞備注說明如下：

CON(control)對照，

NaSH(Sodium hydrosulfide)硫氫化鈉，

LPS(Lipopolysaccharide)脂多糖，

Body Weight體重，

FPN(Ferroportin)細胞膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白，

TFR(Transferrin Receptor)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，

Serum iron血清鐵，

UIBC(unsaturated iron-binding capacity)不飽和鐵結(jié)合力，

TIBC(total iron-binding capacity)總鐵結(jié)合力，

TF(％)載鐵飽和度，

Western blot蛋白質(zhì)印記法(免疫印跡法)。

附圖說明

圖1顯示了生理情況下腹腔注射硫氫化鈉以后，C57B6小鼠血清鐵增加；炎癥情況下，硫氫化鈉可以抑制脂多糖導致的血清鐵的下降；其中，8周齡C57B6 小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機分為4組，每組5只，CON組一次性腹腔注射PBS；NaSH組一次性腹腔注射硫氫化鈉5mg/kg Body Weight；LPS組一次性腹腔注射脂多糖1mg/kg Body Weight；LPS+NaSH組一次性腹腔注射硫氫化鈉5mg/kg Body Weight和1mg/kg Body Weight，6小時和24小時后摘眼球取血；圖1A,注射6小時后各實驗組血清鐵的含量；圖1B,注射24小時后各實驗組血清鐵的含量；圖1C,注射6小時后各實驗組血清不飽和鐵結(jié)合能力；圖1D,注射24小時后血清不飽和鐵結(jié)合能力。

圖2顯示了生理情況下腹腔注射硫氫化鈉以后，C57B6小鼠血清鐵增加；炎癥情況下，硫氫化鈉可抑制脂多糖導致的血清鐵的下降，其中，8周齡C57B6小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機分為4組，每組5只；CON組一次性腹腔注射PBS；NaSH組一次性腹腔注射硫氫化鈉5mg/kg Body Weight；LPS組一次性腹腔注射脂多糖1mg/kg Body Weight；LPS+NaSH組一次性腹腔注射硫氫化鈉5mg/kg Body Weight和1mg/kg Body Weight，6小時和24小時后摘眼球取血；圖2A,注射6小時后各實驗組血清總鐵結(jié)合能力；圖2B,注射24小時后各實驗組血清總鐵結(jié)合能力；圖2C,注射6小時后各實驗組血清載體飽和度；圖2D,注射24小時后各實驗組血清載體飽和度。

圖3顯示了生理情況下腹腔注射硫氫化鈉以后，TFR蛋白表達量增加；炎癥情況下，硫氫化鈉可以抑制脂多糖導致的TFR的下降，其中，8周齡C57B6小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機分為4組，每組5只；CON組一次性腹腔注射PBS；NaSH組一次性腹腔注射硫氫化鈉5mg/kg Body Weight；LPS組一次性腹腔注射脂多糖1mg/kg Body Weight；LPS+NaSH組一次性腹腔注射硫氫化鈉5mg/kg Body Weight和1mg/kg Body Weight，6小時后摘眼球取血，并取脾臟，Western Blot檢測脾臟內(nèi)TFR的含量，Image J軟件作灰度分析，GraphPad軟件作圖。

圖4顯示了生理情況下腹腔注射硫氫化鈉以后，F(xiàn)PN蛋白表達無顯著變化；炎癥情況下，硫氫化鈉可抑制脂多糖導致的FPN的下降；其中8周齡C57B6小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機分為4組，每組5只；CON組一次性腹腔注射PBS；NaSH組一次性腹腔注射硫氫化鈉5mg/kg Body Weight；LPS組一次性腹腔注射脂多糖1mg/kg Body Weight；LPS+NaSH組一次性腹腔注射硫氫化鈉5mg/kg Body Weight和1mg/kg Body Weight，6小時后摘眼球取血，并取脾臟，Western Blot 檢測脾臟內(nèi)FPN的含量，Image J軟件作灰度分析,GraphPad軟件作圖。

圖5顯示了C57B6小鼠腹腔誘導的原代巨噬細胞，生理情況下，硫氫化鈉增加TFR蛋白的表達；炎癥情況下，硫氫化鈉抑制脂多糖導致的TFR蛋白的下降；其中，8周齡的C57B6小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，每只小鼠腹腔注射1ml的3％的巰基乙酸培養(yǎng)基，三天后收集原代巨噬細胞，按照每孔2×10⁶個細胞接種于6孔板，CON組加PBS,NaSH組給予終濃度200μmol硫氫化鈉，LPS組給予1μg/ml的脂多糖，LPS+NaSH組給予終濃度200μmol硫氫化鈉和1μg/ml的脂多糖，24小時后收集細胞，Western Blot檢測細胞內(nèi)TFR蛋白的表達。

具體實施方式

實施例1

材料和方法：

1.動物C57B6雄性小鼠，8周齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機分為四組，分別為空白對照組(CON)，硫氫化鈉組(NaSH)，脂多糖組(LPS)，脂多糖和硫氫化鈉組(LPS+NaSH)，每組5只。小鼠按照100μl/10g給藥，腹腔注射，空白對照組給予PBS,硫氫化鈉組按照5mg/kg Body Weight硫氫化鈉，脂多糖組按照1mg/kg Body Weight脂多糖，脂多糖和硫氫化鈉組同時給予5mg/kg Body Weight硫氫化鈉和1mg/kg Body Weight脂多糖。給藥6小時和24小時以后，摘眼球取血，常規(guī)解剖取脾臟；

2.制備血清：

摘眼球獲得的血樣室溫放置1小時，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清，再次4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清即為血清；

3.血清鐵及不飽和鐵結(jié)合能力檢測

使用POINTE的Iron/TIBC Reagent Set試劑盒測量血清，檢測鐵的相關(guān)指標用：

A、血清鐵

準備分別標記有blank，standard和sample的96孔板，每孔中加入100μliron buffer，在blank中加入20μl去離子水，在standard中加入20μl的Iron standard(500μg/dl)，在sample中加入樣品20μl，以blank為0，用酶標儀測定560nm每個孔的吸收讀數(shù)(A1)，每個孔中加入2μl的 iron color reagent，混合均勻，37度放置10分鐘，以blank為0，用酶標儀測定560nm每個孔的吸收讀數(shù)(A2)；

血清鐵(μg/dl)＝(A2sample-A1sample)/(A2std-A1std)*concentration of St；

B、血清UIBC

準備分別標記blank，standard和sample的96孔板，每孔中加入80μl的UIBC buffer，在blank中加入40μl的去離子水，在standard中加入20μl去離子水和20μl的。standard，在sample中加入20μl的sample和20μl的standard，以blank為0，用酶標儀測定560nm每個孔的吸收讀數(shù)(A1)，每孔中加入2μl的iron color reagent，混合均勻，37度放置10分鐘，以blank為0，用酶標儀測定560nm每個孔的吸收讀數(shù)(A2)

UIBC(μg/dl)＝Conc of std-(A2sample-A1sample)/(A2std-A1std)*Concentr ation of stdTIBC(μg/dl)＝血清鐵+UIBC TF(％)＝血清鐵/TIBC；

4，制備組織蛋白：

0.01克脾臟組織，加100μlRIPA裂解液,振蕩器震蕩，60赫茲，3分鐘，13200轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清；

5，腹腔誘導的原代巨噬細胞

C57B6雄性小鼠，8周齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，3％巰基乙酸培養(yǎng)基腹腔注射，三天后常規(guī)處理小鼠，75％的乙醇溶液浸泡10秒，常規(guī)處理消毒腹部肌層；用10ml注射器吸10mlPBS注入腹腔，輕柔腹部后，用5ml注射器吸取細胞懸液，300g離心10分鐘，將細胞稀釋到1×10⁶/毫升，接種到6孔板，每孔加2毫升的細胞懸液，5％CO₂溫箱孵育3h后，換液，并用PBS 2次，棄去未粘附細胞，加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基(10％胎牛血清，1％的青霉素和鏈霉素)，24小時后加藥處理細胞，對照組加PBS,硫氫化鈉組加入200μmol終濃度的硫氫化鈉，LPS組加入1μg/ml終濃度的脂多糖，硫氫化鈉加脂多糖組加入200μmol終濃度的硫氫化鈉和1μg/ml終濃度的脂多糖，分別于6小時和24小時后收集細胞；

6，制備細胞蛋白樣品

細胞取出立即放冰上，用PBS洗三遍細胞，每孔加入60μl的加了蛋白酶抑制劑細胞裂解液，刮下細胞，收集到1.5ml的離心管，冰上靜置三十分鐘，超聲 五次，13200轉(zhuǎn)離心15分鐘，吸上清。

實驗結(jié)果顯示：

1.在生理條件下，硫化氫顯著增加血清鐵和載鐵飽和度，在炎癥性貧血情況下，硫化氫可以顯著的抑制血清鐵和載體飽和度的下降；

其中，為了研究硫化氫對血清鐵及對脂多糖誘導的炎癥性貧血的作用，采用SPF級C57B6小鼠，8周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后按照體重隨機分為四組，每組5只，一次性給藥，實驗利用了硫化氫的快速釋放劑硫氫化鈉。分別進行于6小時和24小時摘眼球取血離心收集血清。實驗結(jié)果表明，生理情況下，注射6小時后，硫化氫增加血清鐵，但沒有顯著性差異(圖1A)，而注射24小時以后，可以極顯著的增加血清鐵的含量,P<O.O1(圖1B)；注射6小時后和24小時后，硫化氫對不飽和鐵結(jié)合能力沒有顯著的影響(圖1C，1D)。炎癥情況下，注射6小時后，硫化氫對脂多糖導致的血清鐵的下降有輕微的上調(diào)作用，但沒有顯著性差異(圖1A),而注射24小時后，硫化氫可以抑制脂多糖誘導的血清鐵的下降，有顯著性差異，p<0.05(圖1B)；注射6小時和24小時后，硫化氫對脂多糖誘導的不飽和鐵結(jié)合能力上調(diào)沒有顯著性的影響(圖1C，1D)。綜上可知，動物注射5mg/kg硫氫化鈉可以顯著的增加血清鐵的含量以及改善脂多糖導致的炎癥性貧血。

同時,本發(fā)明檢測了注射6小時和24小時血清總鐵結(jié)合能力，實驗結(jié)果表明硫化氫無論在生理還是炎癥性情況下，對血清總鐵結(jié)合能力沒有顯著影響(圖2A,圖2B)。對于載鐵飽和度，注射6小時在生理和炎癥情況下硫化氫對載鐵飽和度都沒有影響(圖2C)；注射24小時后，生理情況下，硫化氫可以顯著增加載鐵飽和度P<0.05(圖2D),炎癥情況下，硫化氫可以抑制脂多糖導致的載鐵飽和度的下降，具有極顯著差異(P<0.0001)(圖2D)。

2.在生理條件下，硫化氫顯著增加小鼠脾臟TFR表達，在炎癥性貧血情況下，

硫化氫可以顯著的抑制脂多糖誘導的TFR的下降；其中，

硫化氫可以顯著的增加血清鐵及載鐵飽和度，同時還可以改善脂多糖誘導的的炎癥性貧血，進一步實驗檢測了鐵攝取的主要蛋白TFR以及鐵排出的蛋白FPN的蛋白表達情況，結(jié)果顯示，在生理情況下，動物腹腔注射5mg/kg硫氫化鈉6小時后，可以極顯著的增加鐵攝取蛋白TFR的表達(P<0.01)。動物腹腔注射 1mg/kg的脂多糖6小時后，導致TFR蛋白表達下降(P<0.01),而同時注射硫氫化鈉和脂多糖，硫氫化鈉可以逆轉(zhuǎn)TFR的下降，使TFR蛋白的表達上升到正常對照組TFR蛋白表達水平，與正常對照組沒有顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

3.在生理條件下，硫化氫對小鼠脾臟FPN沒影響表達，在炎癥性貧血情況下，硫化氫可以顯著的抑制脂多糖誘導的FPN的下降，其中，

鑒于Ferroportin(FPN)是目前已知的唯一的往細胞外運輸非血紅素鐵的通道蛋白，它主要表達在巨噬細胞、十二指腸上皮細胞及肝臟實質(zhì)細胞，生理條件下，C57B6小鼠腹腔注射5mg/kg的硫氫化鈉對鐵輸出蛋白FPN沒有影響，腹腔注射1mg/kg的脂多糖可以顯著的降低FPN蛋白的表達水平(P<0.0001),同時注射脂多糖和硫氫化鈉可以極顯著的逆轉(zhuǎn)脂多糖導致的FPN的下降(P<0.0001)(圖4)，本實驗結(jié)果表明，硫化氫可以顯著的抑制的脂多糖誘導的FPN蛋白水平的的下降；

本實驗結(jié)果進一步證實，生理條件下硫化氫可以顯著的增加小鼠血清的水平，其是通過增加攝鐵蛋白TFR蛋白表達水平，使進入血清的鐵的顯著增加；炎癥條件下，硫化氫可以改善脂多糖誘導的炎癥性貧血，其是通過抑制脂多糖導致的TFR及FPN蛋白表達水平的下降，從而使進入血清的鐵增加。

4.在生理條件下，硫化氫顯著增加小鼠腹腔誘導的巨噬細胞的TFR的表達，在炎癥性貧血情況下，硫化氫可以顯著的抑制脂多糖誘導的TFR的下降，其中，利用巰基乙酸培養(yǎng)基腹腔誘導的原代巨噬細胞，研究硫化氫單一因素對鐵代謝蛋白的影響，結(jié)果表明，200μmol的硫氫化鈉孵育細胞24小時后可以顯著的增加TFR的表達(P<0.01)，加入1μg/ml的脂多糖可以顯著的使TFR表達的下降(P<0.0001),而同時加入硫氫化鈉和脂多糖，則可以逆轉(zhuǎn)脂多糖導致的TFR蛋白表達水平的下降，使TFR蛋白表達水平與對照組沒有顯著性差異(P>0.05)。