本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗氧化活性的裸花紫珠提取物。
背景技術(shù)：
裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.)為馬鞭草科紫珠屬植物，產(chǎn)自我國(guó)海南、廣西、廣東，印度、越南、馬來(lái)西亞等地也有分布，其根、葉可入藥，具有收斂止血、消炎解毒等功效。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的裸花紫珠的藥理活性部位多為醇提物和水提物，活性主要包括止血、抗炎、增強(qiáng)免疫、細(xì)胞毒活性和抗菌五個(gè)方面。然而裸花紫珠不同部位和不同化學(xué)成分的功效差異明顯，目前裸花紫珠成分抗氧化活性研究還比較少，如《七種紫珠屬植物水提物中總黃酮、總酚酸及其抗氧化活性的測(cè)定》(廣西植物，2012年32(6)：845-848)、《5種紫珠屬藥材中總酚、總黃酮與其抗氧化活性的相關(guān)性研究》(中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013年19(20)：55-60)都公開(kāi)了紫珠屬黃酮類(lèi)和酚酸類(lèi)是抗氧化作用的主要物質(zhì)，《從裸花紫珠中分離得到3種具有抗氧化活性的呋喃木質(zhì)素》(國(guó)際中醫(yī)中藥雜志2015年02期：164-164)公開(kāi)了三種具有抗氧化活性的化合物，但是前兩篇文獻(xiàn)所用樣品是紫珠屬植物的粗提物，后一篇文獻(xiàn)所用樣品分離出來(lái)的單個(gè)化合物，這些現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于裸花紫珠抗氧化作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究來(lái)說(shuō)尚未淺顯，而且獲得較高抗氧化活性的有效部位并開(kāi)發(fā)成終端產(chǎn)品具有非常重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗氧化活性的裸花紫珠提取物。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種具有抗氧化作用的裸花紫珠提取物，由以下步驟制備：
(1)取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入80-95％乙醇加熱回流提取1-3次，得提取液；
(2)提取液過(guò)濾，所得濾液加入石油醚或乙酸乙酯任意一種萃取或者分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
進(jìn)一步的，上述裸花紫珠提取物，由以下步驟制備：
(1)取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加熱回流提取1-3次，得提取液，濾過(guò)，回收乙醇濃縮成浸膏；
(2)步驟(1)所得浸膏均勻分散于水中，加入石油醚、乙酸乙酯任意一種萃取或者分 別用石油醚、乙酸乙酯萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
更進(jìn)一步的，上述裸花紫珠提取物，由以下步驟制備：
(1)取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加熱回流提取3次，得提取液，濾過(guò)，回收乙醇濃縮成浸膏；
(2)步驟(1)所得浸膏均勻分散于水中，加入石油醚或乙酸乙酯萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
在上述方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化的裸花紫珠提取物的制備步驟為：
(1)取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加熱回流提取1-3次，得提取液，濾過(guò)，回收乙醇濃縮成浸膏；
(2)步驟(1)所得浸膏均勻分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，分離后收集水溶性部分，濃縮干燥。
進(jìn)一步的，上述裸花紫珠提取物，由以下步驟制備：
(1)取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加熱回流提取3次，得提取液，濾過(guò)，回收乙醇濃縮成浸膏；
(2)步驟(1)所得浸膏均勻分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，分離后收集水溶性部分，濃縮干燥。
作為方案優(yōu)選方式，本發(fā)明中所述步驟(1)裸花紫珠浸膏的制備方法為：取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加熱回流提取1-3次，提取液濾過(guò)，合并，濾液濃縮至相對(duì)密度1.04－1.06的清膏(60℃)，加入濃縮液總重4％－6％的1％的殼聚糖醋酸溶液，攪勻，冷卻，靜置16－24小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130樹(shù)脂，靜態(tài)吸附20-24h，濾過(guò)，濾液濃縮成浸膏。其中1％殼聚糖醋酸溶液的配制：取1g殼聚糖溶于100ml純化水中，加入冰醋酸配制成含1％醋酸濃度的殼聚糖溶液，靜置，備用。
本發(fā)明中所述浸膏為相對(duì)密度1.25－1.35(60℃)的稠膏。
為了更好的理解本發(fā)明，將通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)效果。
(1)裸花紫珠提取物和裸花紫珠單體化合物的制備
裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，用95％乙醇加熱回流提取3次，提取液過(guò)濾后減壓濃縮成浸膏得裸花紫珠醇提物(2.6kg)，浸膏均勻分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚部位(166g)、乙酸乙酯部位(560g)、正丁醇部位(240g)和剩余的水溶性部位組分(1660g)。
裸花紫珠單體化合物：石油醚部位經(jīng)MCI、反復(fù)硅膠柱層析及重結(jié)晶等方法分離得到化 合物1(5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮，125mg)和化合物2(5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮，360mg)。乙酸乙酯部位經(jīng)MCI、正相硅膠、C18柱層析等方法分離得到化合物3(木犀草素，120mg)。正丁醇部位經(jīng)MCI、正相硅膠、C18柱層析和HPLC制備分離得到化合物4(木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，42mg)、化合物5(木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，10mg)、化合物6(木犀草苷，135mg)、和化合物7(毛蕊花糖苷，240mg)。所有化合物均通過(guò)NMR、MS和文獻(xiàn)對(duì)照等進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
(2)抗氧化能力測(cè)定
DPPH·溶液配制：精密稱(chēng)取DPPH·19.716mg，無(wú)水乙醇溶解并定容至500mL容量瓶中，搖勻即得0.1mmol/L的儲(chǔ)備液。
提取物測(cè)試液配制及加樣：分別精密稱(chēng)取一定量的裸花紫珠醇提物和4個(gè)部位萃取物，無(wú)水乙醇溶解完全并定容至容量瓶中，搖勻即得一定濃度的提取物測(cè)試液。按表1的體系進(jìn)行加樣：以梯度方式吸取的提取物測(cè)試液，加蒸餾水至2mL，每份測(cè)試液做一個(gè)平行，分別加入0.1mmol/L DPPH·溶液2mL，搖勻，37℃避光水浴30min后于517nm處測(cè)定吸光度值。
單體測(cè)試液配制及加樣：分別精密稱(chēng)取一定量的裸花紫珠7個(gè)主要成分，精密移液槍加入無(wú)水乙醇，超聲溶解，配成一定濃度的單體測(cè)試液。按表2的體系進(jìn)行加樣：以梯度方式吸取的單體測(cè)試液，加無(wú)水乙醇至500μL，再分別加入0.1mmol/L DPPH·溶液500μL，搖勻，37℃避光水浴30min后于517nm處測(cè)定吸光度值。
表1裸花紫珠提取物清除DPPH·實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系
表2裸花紫珠單體清除DPPH·實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系
DPPH自由基清除率(％)＝[A0-(As-Ac)]/A0×100％，再以樣品各濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的清除率為縱坐標(biāo)，作回歸曲線，并計(jì)算出半數(shù)清除濃度(IC50值)。
公式中，A0—蒸餾水+DPPH溶液的吸光度值
As—樣品溶液+DPPH溶液的吸光度值
Ac—樣品溶液+無(wú)水乙醇的吸光度值
(3)裸花紫珠提取物的抗氧化活性
以抗壞血酸(Vc)作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)裸花紫珠醇提物及其4個(gè)不同萃取部位進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。醇提物和4個(gè)部位均顯示出不同程度的抗氧化活性，且在所設(shè)濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性(相關(guān)系數(shù)在0.9900以上)。4個(gè)部位的抗氧化能力隨著極性變大逐漸增強(qiáng)：石油醚部位＜乙酸乙酯部位＜正丁醇部位＜水部位，醇提物的抗氧化能力介于石油醚部位和乙酸乙酯部位之間。
表3裸花紫珠提取物抗氧化能力
(4)裸花紫珠單體的抗氧化活性
以抗壞血酸(Vc)作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)裸花紫珠7個(gè)單體進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。7個(gè)單體均顯示出不同程度的抗氧化活性，并且在所設(shè)濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。在7個(gè)單體中，從正丁醇部位分離得到的毛蕊花糖苷(7)、木犀草苷(6)和從乙酸乙酯部位分離得到的木犀草素(3)具有明顯的抗氧化活性，抗氧化能力分別是陽(yáng)性對(duì)照Vc的3倍、2.3倍和1.5倍；從正丁醇部位分離得到的木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)具有一定的抗氧化能力；從石油醚部位分離得到的5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮(1)和5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮(2)抗氧化能力則很弱。
表4裸花紫珠單體抗氧化能力
裸花紫珠的化學(xué)成分有黃酮及苷類(lèi)、三萜及苷類(lèi)、二萜、苯乙醇苷類(lèi)、酚酸類(lèi)、甾體類(lèi)、鞣質(zhì)、揮發(fā)油等，目前已從中分離得到100余個(gè)化合物。裸花紫珠醇提物及其4個(gè)萃取部位均顯示出了不同程度的抗氧化活性，其中水部位活性最強(qiáng)，這與其含有鞣質(zhì)、皂苷等大極性成分有關(guān)，而其它部位的抗氧化活性與各自含有的主要成分的活性相對(duì)應(yīng)，表明裸花紫珠中的抗氧化成分為鞣質(zhì)類(lèi)、酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)等多羥基化合物。通過(guò)對(duì)單體化合物與不同活性部位的比較，表明裸花紫珠的抗氧化作用是多成分協(xié)同作用的結(jié)果。通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比研究，以石油醚和/或乙酸乙酯萃取后，分離獲得的水部位的抗氧化活性較強(qiáng)。在后期進(jìn)一步的研究中，對(duì)通過(guò)特定工藝所獲得的裸花紫珠提取物再進(jìn)行萃取分離后，其抗氧化活性顯著提升，使用殼聚糖醋酸溶液和DM-130樹(shù)脂通過(guò)吸附、聚合、沉淀、分離等方式，將裸花紫珠粗提物中粘液質(zhì)、多糖、色素等非活性成分和可能對(duì)抗氧化作用起拮抗作用的成分除去，進(jìn)一步富集和純化活性成分，提高單位提取物的生物活性，為后續(xù)新產(chǎn)品的研究和開(kāi)發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
本發(fā)明的有益效果：(1)獲得抗氧化活性較強(qiáng)的活性部位；(2)制備方法操作簡(jiǎn)便。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加熱回流提取1次，得提取液，濾過(guò)，回收乙醇縮成浸膏(相對(duì)密度1.30－1.35，60℃)；浸膏均勻分散于水中，加入石油醚萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
實(shí)施例2
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入90％乙醇加熱回流提取2次，合并提取液，過(guò)濾后所得濾液加入石油醚萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
實(shí)施例3
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入80％乙醇加熱回流提取3次，合并提取液，濾過(guò)，所得濾液加入石油醚萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
實(shí)施例4
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入90％乙醇加熱回流提取3次，合并提取液，濾過(guò)，回收乙醇縮成浸膏(相對(duì)密度1.30－1.35，60℃)；浸膏均勻分散于水中，加入乙酸乙酯萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
實(shí)施例5
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加熱回流提取1次，得提取液，過(guò)濾后所得濾液加入乙酸乙酯萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
實(shí)施例6
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入90％乙醇加熱回流提取2次，合并提取液，濾過(guò)，回收乙醇縮成浸膏(相對(duì)密度1.30－1.35，60℃)；浸膏均勻分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，即用石油醚萃取、分離，收集水溶性部分A，再用乙酸乙酯萃取水溶性部分A，分離，收集水溶性部分B，濃縮干燥，即得。
實(shí)施例7
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加熱回流提取1次，得提取液，濾過(guò)，回收乙醇縮成浸膏(相對(duì)密度1.25－1.30，60℃)；浸膏均勻分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，即用石油醚萃取、分離，收集水溶性部分A，再用乙酸乙酯萃取水溶性部分A，分離，收集水溶性部分B，濃縮干燥，即得。
實(shí)施例8
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入90％乙醇加熱回流提取2次，提取液濾過(guò)，合并，濾液濃縮至相對(duì)密度1.04－1.06(60℃)，加入濃縮液總重4％的1％的殼聚糖醋酸溶液，攪勻，冷卻，靜置20小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130樹(shù)脂，靜態(tài)吸附24h，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度1.30－1.35(60℃)的浸膏；
所得浸膏，均勻分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，即用石油醚萃取、分離，收集水溶性部分A，再用乙酸乙酯萃取水溶性部分A，分離，收集水溶性部分B，濃縮干燥，即得。
實(shí)施例9
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加熱回流提取3次，提取液濾過(guò)，合并，濾液濃縮至相對(duì)密度1.04－1.06(60℃)，加入濃縮液總重6％的1％的殼聚糖醋酸溶液，攪勻，冷卻，靜置16小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130樹(shù)脂，靜態(tài)吸附20h，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度1.30－1.35(60℃)的浸膏；所得浸膏均勻分散于水中，加入乙酸乙酯萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
實(shí)施例10
取裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加熱回流提取3次，提取液濾過(guò)，合并，濾液濃縮至相對(duì)密度1.04－1.06(60℃)，加入濃縮液總重6％的1％的殼聚糖醋酸溶液，攪勻，冷卻，靜置16小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130樹(shù)脂，靜態(tài)吸附20h，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度1.30－1.35(60℃)的浸膏；所得浸膏均勻分散于水中，加入石油醚萃取，分離，收集水溶性部分，濃縮干燥，即得。
同上述發(fā)明內(nèi)容中裸花紫珠提取物抗氧化能力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)施例1-10的結(jié)果見(jiàn)下 表