本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗炎活性的裸花紫珠提取物。
背景技術(shù)：
：裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.etArn.)為馬鞭草科紫珠屬植物，產(chǎn)自我國海南、廣西、廣東，印度、越南、馬來西亞等地也有分布，其根、葉可入藥，具有收斂止血、消炎解毒等功效。現(xiàn)有文獻報道的裸花紫珠的藥理活性部位多為醇提物和水提物，活性主要包括止血、抗炎、增強免疫、細(xì)胞毒活性和抗菌五個方面。然而裸花紫珠不同部位和不同化學(xué)成分的功效差異明顯，目前對裸花紫珠成分抗炎活性研究還比較少，如《裸花紫珠抗炎作用及增強免疫功能的實驗研究》(廣東微量元素科學(xué)，2006，13(8)：39-41)、裸花紫珠總黃酮的抗炎、止血作用研究(現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009,18(6):3161-3162)，裸花紫珠5_羥基_3_7_3_4_四甲氧基黃酮抗炎作用研究(海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，20(11):1460-1462)，這類研究或者是以裸花紫珠的粗提物，或者是以裸花紫珠分離出來的單個化合物為研究對象，這些現(xiàn)有技術(shù)對于裸花紫珠抗氧化作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究來說尚未淺顯，而且獲得較高抗炎活性的有效部位并開發(fā)成終端產(chǎn)品具有非常重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗炎活性的裸花紫珠提取物。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種具有抗炎作用的裸花紫珠提取物，其特征在于含有24～36％的黃酮類化合物、0.8％～3％的苯乙醇苷類化合物、15％～27％的二萜類化合物。所述黃酮類化合物含有木犀草苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素、5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮、5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮其中的一種或多種；所述苯乙醇苷類化合物含有毛蕊花糖苷、連翹酯苷中的一種或兩種；所述二萜類化合物含有紫珠酸B(callicarpicacidB)、7α-乙?；竭_海松酸(7α-acetoxysandaracopimaricacid)、山達海松酸(sandaracopimaricacid)中的一種或多種。本發(fā)明所述具有抗炎作用的裸花紫珠提取物，可以由以下步驟制備：(1)取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加熱回流提取1-3次，得提取液，過濾后所得濾液濃縮成浸膏A；(2)步驟(1)所得浸膏A均勻分散于水中，依次加入石油醚、乙酸乙酯萃取，除去溶劑，分別得到石油醚萃取有效部位B、乙酸乙酯萃取部位C；(3)將有效部位B與有效部位C以重量比為1～3:1的比例混合，即得。有效部位B、C均以同等相對密度(1.30－1.35，60℃)的浸膏或者干燥粉末混合。作為上述方案的優(yōu)選之一，所述步驟(1)浸膏A的制備方法為：取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加熱回流提取3次，得提取液，過濾后所得濾液減壓濃縮得浸膏(相對密度1.30－1.35，60℃)。作為上述方案的優(yōu)選之一，所述步驟(1)浸膏A的制備方法為：取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加熱回流提取1-3次，提取液濾過，合并，濾液濃縮至相對密度為1.04－1.06(60℃)的清膏，加入濃縮液總重4％－6％的1％的殼聚糖醋酸溶液，攪勻，冷卻，靜置16－24小時，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130樹脂，靜態(tài)吸附24h，濾過，濾液濃縮至相對密度1.30－1.35(60℃)的浸膏。上述方案中所述步驟(3)中有效部位B與有效部位C以重量比優(yōu)選為為2.5:1。上述1％殼聚糖醋酸溶液的配制方法為：取1g殼聚糖溶于100ml純化水中，加入冰醋酸配制成含1％醋酸濃度的殼聚糖溶液，靜置，備用。本發(fā)明中所述浸膏為相對密度1.30－1.35(60℃)的稠膏。為了更好的理解本發(fā)明，將通過以下實驗說明本發(fā)明的技術(shù)效果。(1)裸花紫珠提取物制備裸花紫珠藥材10kg，粉碎成粗粉，用95％乙醇加熱回流提取，得提取液，過濾后減壓濃縮成浸膏，浸膏均勻分散于水中，依次用適量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液濃縮干燥后，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4個部位的萃取物，真空干燥，備用。對照品毛蕊花糖苷(1)、木犀草苷(2)、木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、木犀草素(5)、5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮(6)、5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮(7)均為從裸花紫珠中分離得到，均通過NMR、MS和文獻對照等進行結(jié)構(gòu)鑒定。(2)一氧化氮(NO)生成抑制活性測定小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中。實驗時將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×104/mL后接種至96孔板，貼壁后，給藥組分別加入裸花紫珠萃取物(25μg/mL)或?qū)φ栈衔?25μM)干預(yù)細(xì)胞2h，再加入誘導(dǎo)劑LPS(終濃度1μg/mL)，陰性對照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，吸取上清液，加入Griess試劑，混勻，避光靜置10min，于550nm處測定吸光度值。NO生成抑制率(％)＝(1-給藥組NO濃度均數(shù)/陰性對照組NO濃度均數(shù))×100％。(3)裸花紫珠提取物和化合物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響如表1所示，裸花紫珠醇提物的石油醚和乙酸乙酯部位在25μg/mL的濃度下顯示出對激活狀態(tài)RAW264.7細(xì)胞NO釋放的抑制活性，兩者的抑制活性均大于醇提物，其中乙酸乙酯部位的抑制作用稍強于石油醚部位，而正丁醇部位和水部位的抑制率低于醇提物，未顯示出明顯的抑制活性。裸花紫珠6個黃酮類主成分在25μM的濃度下顯示出不同程度的抑制作用，其中木犀草苷活性最高，其次是木犀草素和木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮則最弱。表1裸花紫珠提取物和對照化合物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響(4)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定活性部位主要化學(xué)成分對裸花紫珠的石油醚和乙酸乙酯活性部位進行HPLC-DAD-ESI-MS測試，綜合分析其紫外吸收、相對分子質(zhì)量和碎片離子等信息以及對照品質(zhì)譜信息，對主要色譜峰進行鑒定和歸屬，見附圖1。從乙酸乙酯部位鑒定6個黃酮和1個苯乙醇苷類成分，從石油醚部位鑒定了2個黃酮和3個二萜成分，分析結(jié)果見表2。以峰面積歸一法測得乙酸乙酯部位的成分和含量為：木犀草苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素、5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮、5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮為黃酮類成分，含量為43.8％，毛蕊花糖苷為苯乙醇苷類成分，含量為3.5％，乙酸乙酯部位收率為4.2％；石油醚部位的成分和含量為：5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮、5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮為黃酮類成分，含量為20.2％，callicarpicacidB、7α-acetoxysandaracopimaricacid、sandaracopimaricacid.為二萜類成分，含量為31.9％，石油醚部位收率為1.3％。表2裸花紫珠活性部位主要成分的鑒定注：Q為石油醚部位，P為乙酸乙酯部位。另callicarpicacidB在本發(fā)明中中文譯名為紫珠酸B。一氧化氮(NO)是具有生物活性的氣體信號分子，屬于細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子。但NO的過量生成與炎癥密切相關(guān)。致炎物質(zhì)和炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)或增加NO的合成和釋放。當(dāng)采用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞炎癥模型被建立，此過程會生成大量的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducedNOsynthase，iNOS)，iNOS通過催化其底物L(fēng)-精氨酸，生成NO進行免疫應(yīng)答。因此，抑制NO生成是化合物具有抗炎活性的直接指標(biāo)。實驗發(fā)現(xiàn)石油醚和乙酸乙酯部位均能有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO的分泌，以乙酸乙酯部位的抗炎作用最強。裸花紫珠的化學(xué)成分有黃酮及苷類、三萜及苷類、二萜、苯乙醇苷類、酚酸類、甾體類、揮發(fā)油等，目前已從中分離得到100余個化合物。然而現(xiàn)有的對裸花紫珠成分與活性的研究相對薄弱，尤其是其最主要的抗炎活性，現(xiàn)有技術(shù)中裸花紫珠抗炎活性的體現(xiàn)或者是以粗提物(水提物或醇提物)的活性研究，或者是對單個化合物的分離鑒定與活性研究，僅有CN104435386A中公開了一種抗炎組合物，由裸花紫珠總黃酮和總苯丙素組成?？寡姿幬锸侨祟愋枨罅糠浅４蟮囊环N藥物，要開發(fā)出具有道地特色和藥效特色的裸花紫珠組分中藥，一方面提高其組分中藥的活性，另一方面盡可能提高其收率。發(fā)明人在前期研究基礎(chǔ)上，對抗 炎活性成分群做了深入的研究，通過采用溶劑(水、甲醇、乙醇、丙酮等)提取，結(jié)合大孔樹脂或活性碳或陶瓷膜或萃取等等分離方法，聯(lián)合質(zhì)譜、液相等分析技術(shù)，最終得出本發(fā)明的技術(shù)方案。發(fā)明人對活性部位進行HPLC-DAD-ESI-MS檢測發(fā)現(xiàn)，裸花紫珠乙酸乙酯部位的主要成分是黃酮及黃酮苷類成分，同時含有少量的苯乙醇苷類成分，黃酮和二萜成分則是其石油醚部位的主要成分。通過對單體化合物與不同活性部位的比較，表明裸花紫珠的抗炎作用是特定的多成分協(xié)同作用的結(jié)果，且石油醚部位和乙酸乙酯部位以特定的比例所得混合物的抗氧化活性更強，另外在后期進一步的研究中，對通過特定工藝所獲得的裸花紫珠提取物再進行萃取分離后，其抗炎活性顯著提升，這與殼聚糖醋酸溶液和DM-130樹脂通過吸附、聚合、沉淀、分離等方式，將裸花紫珠粗提物中粘液質(zhì)、多糖、色素等非活性成分和可能對抗炎作用起拮抗作用的成分除去，進一步富集和純化活性成分，提高單位提取物的生物活性，為后續(xù)新產(chǎn)品的研究和開發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明的有益效果：(1)獲得抗炎活性較強的活性部位，且明晰其主要化學(xué)成分；(2)制備方法操作簡便。附圖說明圖1：裸花紫珠活性部位(A:石油醚組分；B:乙酸乙酯組分)和對照品(C)的HPLC圖譜，其中1:毛蕊花糖苷；2:木犀草苷；3:木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；4:木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；5:木犀草素；6:5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮；7:5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮；8:callicarpicacidB；9:7α-acetoxysandaracopimaricacid；10:sandaracopimaricacid.具體實施方式以下將進一步通過舉例詳細(xì)說明本發(fā)明，發(fā)明人通過不同制備工藝得到相應(yīng)的實施例和對比例，并測得其成分、含量、收率、抑制率等詳見下表3。發(fā)明人通過如下工藝制得實施例：(1)取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加熱回流提取1-3次，得提取液，過濾后所得濾液濃縮成浸膏A；(2)步驟(1)所得浸膏A均勻分散于水中，依次加入石油醚、乙酸乙酯萃取，除去溶劑，分別得到石油醚萃取有效部位B、乙酸乙酯萃取部位C；(3)將有效部位B與有效部位C以重量比為1～3:1的比例混合，即得。其中步驟(1)浸膏A的制備方法還可以為：取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加熱回流提取1-3次，提取液濾過，合并，濾液濃縮至相對密度為1.04－1.06(60℃)的清膏，加入濃縮液總重4％－6％的1％的殼聚糖醋酸溶液，攪勻，冷卻，靜置16－24小時，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130樹脂，靜態(tài)吸附20-24h，濾過，濾液濃縮成浸膏。同上述
發(fā)明內(nèi)容中HPLC-DAD-ESI-MS分析方法，其中各實施例有效部位成分相對百分含量以峰面積歸一法測得，各實施例和對比例對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響(即抑制率1)同上述
發(fā)明內(nèi)容中裸花紫珠提取物和化合物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響的實驗方法；另外還通過對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(即抑制率2)的實驗方法如下：雄性SD大鼠按體重隨機分為：空白對照組(相應(yīng)體積蒸餾水)；給藥組(各實施例、對比例所得樣品，劑量0.8g/kg)。每組各10只，每組灌胃給藥1次/d，連續(xù)7d，灌胃體積0.2mL/10g體重，末次給藥30min后，將二甲苯涂于右耳兩面，,30μL/只，左耳作對照。30min后處死動物，沿耳廓基線剪下雙耳。分別用直徑8mm打孔器在左右耳相對稱部位取下耳片稱重，以右耳廓重減去左耳廓重的差值為腫脹度，并計算耳腫脹抑制率，腫脹抑制率(％)＝(空白對照組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度)/空白對照組平均耳腫脹度×100％。表3除實驗組劑量不同，方法同上述實施例1-7和對比例1-15的對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響(即抑制率1)、對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(即抑制率2)的實驗方法，對比例16-24的實驗結(jié)果如下表4、表5表4編號制備方法及有效部位B、C的比例劑量抑制率1對比例16同對比例150μg/mL81.1％對比例17同對比例250μg/mL78.6％對比例18同對比例350μg/mL79.3％對比例19同對比例450μg/mL77.8％對比例20同對比例650μg/mL81.9％對比例21同對比例750μg/mL85.1％對比例22同對比例850μg/mL82.7％對比例23同對比例950μg/mL85.6％對比例24同對比例1150μg/mL79.2％表5編號制備方法及有效部位B、C的比例劑量抑制率2對比例16同對比例11.6g/kg71.6％對比例17同對比例21.6g/kg70.3％對比例18同對比例31.6g/kg73.5％對比例19同對比例41.6g/kg67.8％對比例20同對比例61.6g/kg73.6％對比例21同對比例71.6g/kg75.3％對比例22同對比例81.6g/kg74.7％對比例23同對比例91.6g/kg78.8％對比例24同對比例111.6g/kg78.5％當(dāng)前第1頁1 2 3