本發(fā)明為一種使用芭樂(lè)多酚及海藻糖作為有效成分，以降低在活體細(xì)胞中的氧化傷害、細(xì)胞雕亡、細(xì)胞自我吞噬和發(fā)炎性細(xì)胞死亡反應(yīng)者，尤指一種改善第二型糖尿病的芭樂(lè)果實(shí)及海藻糖飲食組成物與用途。

背景技術(shù)：

第二型糖尿病(Type 2 diabetes，簡(jiǎn)稱T2DM)是目前廣泛流行的代謝癥候群。研究預(yù)測(cè)第二型糖尿病的人口數(shù)，在西元2030年時(shí)會(huì)攀升至3.66億。根據(jù)中國(guó)臺(tái)灣衛(wèi)生部門統(tǒng)計(jì)，臺(tái)灣地區(qū)近年來(lái)糖尿病已高居國(guó)人十大死因前四名，估計(jì)臺(tái)灣糖尿病患人口已達(dá)百萬(wàn)。其中，九成以上屬于非胰島素依賴型，又稱第二型糖尿病。糖尿病的病癥除了有過(guò)高的血糖濃度及明顯的尿糖外，糖尿病最可怕的是會(huì)引起一些并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜癥、腎癥、神經(jīng)障害、乃至于腦及循環(huán)系統(tǒng)的障害。因此如何控制血糖，以避免并發(fā)癥的發(fā)生則是糖尿病控制的原則之一。糖尿病的治療基本上有三大方法，分別是(1)飲食療法(2)運(yùn)動(dòng)療法(3)藥物療法，其中以飲食療法為最基本，也是最重要的療法。據(jù)估計(jì)，約50％以上的患者可以因良好的飲食療法而改善病情。此外，在進(jìn)行藥物療法時(shí)，如果沒(méi)有適當(dāng)?shù)娘嬍朝煼ㄅ浜希幬镆矊o(wú)法發(fā)揮其功能。因此對(duì)糖尿病患者而言，如何通過(guò)良好的飲食療法使血糖濃度得到良好的控制是最基本也是最重要的課題。

芭樂(lè)(Guava Fruit)(Psidium guava L.)是一種熱帶性水果，也是臺(tái)灣常見(jiàn)的水果之一，其熱量低，每100g僅含37.3kcal，且富含維生素C(vitamin C)及類黃酮(flavonoids)、酚類(phenolics)，因此其抗氧化(antioxidation)、抗發(fā)炎(anti-inflammation)及抗糖尿病(anti-diabetes)(Thomas Eidenberger et al.,2013)的能力備受關(guān)注。芭樂(lè)對(duì)于STZ所誘發(fā)的第一型糖尿病的大鼠中，使胰島β細(xì)胞免于氧化壓力的破壞，而有保護(hù)的功效，進(jìn)而抗高血糖(anti-hyperglycemia)(Huang et al.,2011,Food Chem Toxicol.,49(9):2189-95)。除此之外，芭樂(lè)對(duì)于 腎臟也許有抗氧化、抗發(fā)炎及抗糖基化(anti-glycation)的作用(Lin and Yin,2012,Plant Foods Hum Nutr.,67(3):303-8)。

海藻糖(Trehalose)是存在于自然界的一種雙醣，以α,α-1,1糖苷鍵鍵結(jié)兩葡萄糖所形成的非還原糖。因不產(chǎn)生褐變(Maillard reaction)常用于食品甜味劑。其甜度為蔗糖45％。在消化道中被小腸的海藻糖酶(Trehalase)分解。海藻糖存在于無(wú)脊椎動(dòng)物及酵母、蕈菇類等等。因其具有保護(hù)蛋白質(zhì)降解的功能，而能在自然環(huán)境下抗凍、抗干燥及脫水、抗氧化(Chen,Q.,and Haddad,G.G.,2004,J Exp Biol.207(Pt 18):3125-9)。但對(duì)于其保護(hù)功效的機(jī)制并未清楚。海藻糖已被運(yùn)用在細(xì)胞冷凍保存(cryopreservation of cells)(Ali Eroglu et al.,2000,Nat Biotechnol.,18(2):163-7)。除此之外，海藻糖也被研究出可防止阿茲海默中，β類淀粉蛋白(β-amyloid)的形成(Liu,R et al.,2005,Neurobiol Dis.,20(1):74-81)，以及減少polyglutamine(polyQ)在杭丁頓式舞蹈癥(Huntinton’s Disease)的形成(Sovan Sarkar,et al.,2007,J Biol Chem.,282:5641–5652)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前對(duì)于芭樂(lè)與糖尿病之間的研究雖然已有進(jìn)展，但先前的研究的動(dòng)物模式多為第一型糖尿病。或是使用芭樂(lè)葉而非芭樂(lè)果實(shí)可食部位(Shen et al.,2008,Phytother Res.,22(11):1458-64；Thomas Eidenberger et al.,2013,Fitoterapia.,89:74-9)。為了提高便利性及適口度，本發(fā)明為探討加入海藻糖的芭樂(lè)汁對(duì)于第二型糖尿病的影響及作用機(jī)制。本目標(biāo)為芭樂(lè)汁與海藻糖的特殊組成與其合并效果在糖尿病的血糖調(diào)整與對(duì)腎臟和胰臟的保護(hù)效應(yīng)。同時(shí)也定位出芭樂(lè)有效成份槲皮素與其它活性成份對(duì)于糖尿病的血糖調(diào)整效應(yīng)。

本發(fā)明提供一種改善第二型糖尿病的芭樂(lè)果實(shí)及海藻糖飲食組成物與用途，藉以于口服后降低因第二型糖尿病對(duì)腎臟及胰臟引起的氧化壓力及發(fā)炎反應(yīng)，并提升芭樂(lè)汁的適口性。

本發(fā)明的主要目的在于提供一種改善第二型糖尿病的芭樂(lè)果實(shí)及海藻糖飲食組成物，其中該飲食組成物含有由芭樂(lè)衍生的芭樂(lè)多酚以及由海藻衍生的海藻糖作為有效成分，以降低在活體細(xì)胞中的氧化傷害、細(xì)胞雕亡、細(xì)胞自我吞噬和發(fā)炎性細(xì)胞死亡反應(yīng)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備改善第二型糖尿病的飲食組合物的用途，使用自芭樂(lè)中所衍生的芭樂(lè)多酚及由海藻衍生的海藻糖，其中該飲食組成物含有由芭樂(lè)衍生的芭樂(lè)多酚以及由海藻衍生的海藻糖作為有效成分，以降低活體細(xì)胞中的氧化傷害、細(xì)胞雕亡、細(xì)胞自我吞噬和發(fā)炎性細(xì)胞死亡反應(yīng)。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種降低細(xì)胞氧化傷害用、降低細(xì)胞雕亡用、降低細(xì)胞自我吞噬用或降低發(fā)炎性細(xì)胞死亡用的飲食組合物，其中該飲食組成物含有由芭樂(lè)衍生的芭樂(lè)多酚以及由海藻衍生的海藻糖作為有效成分，且可制成飲料或食品形式。

在本發(fā)明的一實(shí)施例中，該芭樂(lè)多酚系選自由槲皮素、鞣花酸、柚皮素及彼等的混合物所組成的群組。

在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，該飲食組成物為包含大于2μg/mL的槲皮素。

在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，該飲食組成物為包含大于0.2g/kg的海藻糖。

在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，該芭樂(lè)多酚以下列步驟進(jìn)行制備：

在恒溫下研磨芭樂(lè)以形成芭樂(lè)漿液；以及

利用一可使過(guò)濾濾液具有低氧化還原電位的過(guò)濾元件過(guò)濾該芭樂(lè)漿液，以獲得一具有低氧化還原電位且含有芭樂(lè)多酚的芭樂(lè)汁。

在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，該使用自芭樂(lè)中所衍生的芭樂(lè)多酚及由海藻衍生的海藻糖于制備改善第二型糖尿病的飲食組合物的用途用于制造用作降低細(xì)胞雕亡、細(xì)胞自我吞噬、發(fā)炎性細(xì)胞死亡或細(xì)胞氧化傷害的飲食組合物。

為進(jìn)一步了解本發(fā)明，以下舉較佳的實(shí)施例，配合附圖，將本發(fā)明的具體構(gòu)成內(nèi)容及其所達(dá)成的功效詳細(xì)說(shuō)明如下。

附圖說(shuō)明

圖1A和圖1B為本發(fā)明制備的芭樂(lè)汁對(duì)H₂O₂和HOCl的抗氧化力表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖；

圖2A和圖2B為海藻糖對(duì)H₂O₂和HOCl的抗氧化力表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖；

圖3A和圖3B為本發(fā)明制備的芭樂(lè)汁以不同比例分別與蔗糖或海藻糖結(jié)合后的對(duì)H₂O₂和HOCl的抗氧化力表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖；

圖4為實(shí)驗(yàn)大鼠在口服海藻糖水及葡萄糖水后血糖變化圖；

圖5為第二型糖尿病大鼠在喂食芭樂(lè)汁及芭樂(lè)汁加海藻糖的第0、2、4周的空腹血糖值變化圖；

圖6為第二型糖尿病大鼠在喂食芭樂(lè)汁及芭樂(lè)汁加海藻糖的第0、2、4周的空腹胰島素阻抗變化圖；

圖7為芭樂(lè)汁及芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)第二型糖尿病大鼠腎臟作用的自由基表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖；

圖8為芭樂(lè)汁及芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)第二型糖尿病大鼠血清作用的自由基表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖；

圖9A和圖9B為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)腎臟內(nèi)4-HNE氧化壓力作用的免疫切片染色圖及量化長(zhǎng)條圖；

圖10A和圖10B為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)腎臟內(nèi)IL-1β發(fā)炎指標(biāo)作用的免疫切片染色圖及量化長(zhǎng)條圖；

圖11A和圖11B為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)腎臟內(nèi)caspase 3調(diào)控的細(xì)胞雕亡指標(biāo)作用的免疫切片染色圖及量化長(zhǎng)條圖；

圖12A和圖12B為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)胰島內(nèi)細(xì)胞雕亡數(shù)目作用的免疫切片染色圖及量化長(zhǎng)條圖；

圖13為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)胰臟和腎臟內(nèi)的細(xì)胞吞噬和細(xì)胞雕亡表現(xiàn)作用的西方墨點(diǎn)法結(jié)果圖；

圖14為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)腎臟內(nèi)的細(xì)胞吞噬和細(xì)胞雕亡表現(xiàn)作用的雙重螢光染色圖；

圖15為本發(fā)明制備的芭樂(lè)汁所含的芭樂(lè)多酚以高效能液相層析儀(High Performance Liquid Chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC)分析的結(jié)果圖譜。

具體實(shí)施方式

以下，將列舉本發(fā)明若干實(shí)例并配合附圖作更進(jìn)一步說(shuō)明如后。

實(shí)例一：芭樂(lè)果實(shí)及海藻糖飲食組成物的制備與其抗自由基能力

在此實(shí)施例中，先將芭樂(lè)果實(shí)在恒溫下研磨以形成芭樂(lè)漿液，再利用一可使過(guò)濾濾液具有低氧化還原電位的過(guò)濾元件過(guò)濾該芭樂(lè)漿液，以獲得一具有低氧化還原電位且含有芭樂(lè)多酚的芭樂(lè)汁。上述過(guò)濾元件的例子可參中國(guó)臺(tái)灣第I331544號(hào)發(fā)明專利(產(chǎn)生抗氧化與多功能吸附效應(yīng)的濾膜濾芯)與中 國(guó)臺(tái)灣第M374460號(hào)新型專利(抗氧化水生成器)。

經(jīng)過(guò)濾形成的芭樂(lè)汁通過(guò)自由基測(cè)定法，利用化學(xué)冷光(Chemiluminescence,簡(jiǎn)稱CL)加強(qiáng)劑(luminol)，和化學(xué)冷光分析儀(Chemiluminescence analyzing system)，檢測(cè)萃取物中的自由基含量。檢測(cè)的原理是利用待測(cè)物中自由基所帶的電子轉(zhuǎn)給化學(xué)冷光加強(qiáng)劑(luminol)時(shí)，使自由基本身由高能階狀態(tài)轉(zhuǎn)至低能階。由能量的轉(zhuǎn)換使化學(xué)冷光加強(qiáng)劑發(fā)光。所產(chǎn)生的光子通過(guò)儀器的光電倍增管(photomultiple tube，簡(jiǎn)稱PMT)接收，轉(zhuǎn)換成計(jì)數(shù)值(counts)。

在本文中的數(shù)值顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值(Standard Error of Mean，簡(jiǎn)稱SEM)，數(shù)據(jù)進(jìn)行變異分析，控制組和阻塞腎臟組間的所有參數(shù)差異使用Student's paired t-test進(jìn)行比較。各組間的差異使用One-way分析建立。組間使用Duncan's multiple-range測(cè)試進(jìn)行比較。如果差異達(dá)到P<0.05的被視為顯著差異。

圖1A和圖1B為本發(fā)明制備的芭樂(lè)汁對(duì)H₂O₂和HOCl的抗氧化力表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖，如圖1A和圖1B所示，芭樂(lè)汁具有良好的清除H₂O₂和HOCl等漂白劑的抗氧化力，且當(dāng)體積濃度達(dá)5-40％，就具有相當(dāng)明顯的抗氧化力。而且40％的芭樂(lè)汁，也具有最強(qiáng)的抗氧化力。且具*p<0.05的統(tǒng)計(jì)意義。

圖2A和圖2B為海藻糖對(duì)H₂O₂和HOCl的抗氧化力表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖，如圖2A和圖2B所示，為檢測(cè)海藻糖是否也具有抗氧化力，也同時(shí)檢測(cè)了海藻糖水的離體自由基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海藻糖水具有清除H₂O₂且具*p<0.05的統(tǒng)計(jì)意義。但無(wú)法清除HOCl的選擇性抗氧化的能力。

圖3A和圖3B為本發(fā)明制備的芭樂(lè)汁以不同比例分別與蔗糖或海藻糖結(jié)合后的對(duì)H₂O₂和HOCl的抗氧化力表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖，如圖3A和圖3B所示，25S:25％芭樂(lè)汁加8％蔗糖，25T:25％芭樂(lè)汁加12％海藻糖，40T:40％芭樂(lè)汁加12％海藻糖，40B:40％芭樂(lè)汁。圖3A為外加H₂O₂為自由基來(lái)源，圖3B則加入HOCl為自由基來(lái)源，檢測(cè)芭樂(lè)汁的抗自由基能力。結(jié)果顯示加入不同糖類或25％及40％濃度的芭樂(lè)汁，皆有清除自由基的能力，且以40％T最具明顯降低。

因此，本發(fā)明所制備的芭樂(lè)汁因其低氧化還原電位而具有良好的清除H₂O₂和HOCl等漂白劑的抗氧化力，且當(dāng)體積濃度達(dá)5-40％，就具有相當(dāng)明 顯的抗氧化力。而且40％芭樂(lè)汁就已達(dá)到具p<0.05的統(tǒng)計(jì)意義的最強(qiáng)的抗氧化力和60％芭樂(lè)汁相當(dāng)。因此本制程條件具有保持芭樂(lè)汁的抗氧化能力作用。本發(fā)明以芭樂(lè)汁(20-60％)搭配海藻糖(1-12％)與芭樂(lè)汁(40％)。

實(shí)例二：葡萄糖耐性測(cè)定(Glucose tolerance test,簡(jiǎn)稱OGTT)與飲食耐量試驗(yàn)

在此實(shí)例中，使用wistar品系、6至8周齡的雌性大鼠(rat)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其體重皆>200g。每組8只以上，并飼養(yǎng)在恒溫(22±2℃)、亮暗各12小時(shí)的動(dòng)物房。

高果糖誘發(fā)高血糖的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ匠掷m(xù)喂食動(dòng)物含果糖21％(W/V)以上的飲用水(Yadav et al.,2007)至少8周，以及Harlan Taklad商業(yè)配方飼料持續(xù)喂食動(dòng)物4周以上以誘發(fā)胰島素阻抗的產(chǎn)生。搭配腹腔注射Nicotinamide(NA)(230mg/kg)+STZ(65mg/dL)誘發(fā)動(dòng)物高血糖。采血測(cè)量隔夜空腹(17～24小時(shí))血糖值，若達(dá)或超過(guò)13mM(230+10mg％)時(shí)，則視為有第二型糖尿病。

誘發(fā)成功后，分為六組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別為CON,DM,T1,T2,T5和B1。動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)分組系以長(zhǎng)期(28天)每日灌喂方式投予芭樂(lè)汁(40％)以及海藻糖(5％)芭樂(lè)汁(40％)；受試物劑量(g/kg)除對(duì)照組外，還有3個(gè)劑量組，分別相當(dāng)于人體推薦攝取量的1倍、2倍、五倍。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組如表一所示。

表一

空腹血糖值的測(cè)定給予高血糖動(dòng)物受試物，測(cè)定隔夜空腹血糖值。以拜耳血糖機(jī)測(cè)定，采尾靜脈血液測(cè)試。

葡萄糖耐性測(cè)定在隔夜空腹(10-14小時(shí))后，以口服2g/kg、靜脈注射0.5g/kg給予實(shí)驗(yàn)大鼠葡萄糖。口服給予葡萄糖后，在給糖前與給糖后的30、60、90和120分鐘測(cè)量血糖值同時(shí)測(cè)定胰島素濃度。靜脈給予葡萄糖前以及給糖后的1、2、5、10、20、30及50分鐘測(cè)量血糖值同時(shí)測(cè)定胰島素濃度。在飼 養(yǎng)試驗(yàn)的開(kāi)始、中期及后期各進(jìn)行一次。并與對(duì)照組比較，其血糖變化及胰島素變化曲線下面積(AUC和△AUC)。

飲食耐量試驗(yàn)系使用正常以及已誘發(fā)高血糖的動(dòng)物，先給予正常飼料，然后空腹10-14小時(shí)，再以管灌方式給予添加受試樣品的試驗(yàn)飲食。其血糖或胰島素測(cè)定與上述OGTT同。

圖4為實(shí)驗(yàn)大鼠在口服海藻糖水及葡萄糖水后血糖變化圖，如圖4所示，利用口服海藻糖水及葡萄糖水的方式來(lái)觀測(cè)血糖變化。發(fā)現(xiàn)口服后的第1、5、10、20、30及50分鐘時(shí)葡萄糖水的血糖明顯高于海藻糖水，且具*p<0.05的統(tǒng)計(jì)意義。

圖5為第二型糖尿病大鼠在喂食芭樂(lè)汁及芭樂(lè)汁加海藻糖的第0、2、4周的空腹血糖值變化圖，如圖5所示，由投予芭樂(lè)汁、芭樂(lè)汁加海藻糖后的第0、2、4周的空腹血糖值變化圖(glucose＝2g/kg BW)中可觀察到，T1,T2和T5組在第4周時(shí)空腹血糖有明顯下降。*p<0.05vs.week 0。#p<0.05vs.DM4。其中CON為正常組；DM為第二型糖尿病組；B1為飲用芭樂(lè)汁組；T1為飲用一倍芭樂(lè)汁加海藻糖組；T2為飲用二倍芭樂(lè)汁加海藻糖組；T5為飲用五倍芭樂(lè)汁加海藻糖組。

實(shí)例三：胰島素阻抗(Insulin resistance)測(cè)定

高果糖誘發(fā)胰島素阻抗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ较蹬c上述以高果糖誘發(fā)高血糖的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ较嗤?/p>

在試驗(yàn)期間的前、中、后期采集空腹血漿，檢測(cè)胰島素濃度的變化。可以計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估的胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment Insulin Resistance index，簡(jiǎn)稱Homa IR index)來(lái)檢視胰島素阻抗的情形。此測(cè)定值對(duì)于觀察產(chǎn)生第二型糖尿病前已誘發(fā)有胰島素阻抗現(xiàn)象的初期，是一相對(duì)敏感的指標(biāo)。Homa IR index是在1985年由Matthews等(Matthews et al.,1985)所提出的。第二型糖尿病之前，胰島素阻抗現(xiàn)象逐漸發(fā)生，而升高血糖濃度時(shí)，胰臟β細(xì)胞會(huì)代償性地分泌更多胰島素，以維持血糖正常。所以在初期無(wú)法由單單測(cè)量空腹血糖值來(lái)觀察逐漸誘發(fā)的第二型糖尿病。但通過(guò)Homa IR值，可利用空腹血糖與胰島素?cái)?shù)值來(lái)計(jì)算出胰島素抗性，公式為insulin(μU/mL)×glucose(mmol/L)/22.5。

圖6為第二型糖尿病大鼠在喂食芭樂(lè)汁及芭樂(lè)汁加海藻糖的第0、2、4 周的空腹胰島素阻抗變化圖，如圖6所示，由投予芭樂(lè)汁或芭樂(lè)汁加海藻糖的第0、2、4周之空腹胰島素阻抗變化圖中可觀察到，T1,T2和T5組在第4周時(shí)空腹胰島素阻抗有明顯下降。*p<0.05vs.week 0。#p<0.05vs.DM4。

實(shí)例四：芭樂(lè)汁和芭樂(lè)汁加海藻糖在第二型糖尿病大鼠活體腎臟自由基的作用。

腎臟活體自由基的測(cè)定方式系對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠靜脈注射MCLA(2-Methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3,7-dihydroimidazo-[1,2-a]-pyrazin-3-one-hydrochloride)(0.2mg/ml/h,TCI-Ace,Tokyo Kasei Kogyo Co.Ltd.,Tokyo,Japan)，并以化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(CLD-110,Tohoku Electronic In.Co.,Sendai,Japan)檢測(cè)腎臟活體自由基。

圖7為芭樂(lè)汁及芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)第二型糖尿病大鼠腎臟作用的自由基表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖，如圖7所示，可觀察到DM組的腎臟活體自由基明顯高于其他組別，芭樂(lè)汁和芭樂(lè)汁加海藻糖會(huì)降低第二型糖尿病大鼠活體腎臟自由基。*:p<0.05vs.CON，#p<0.05vs.DM。

實(shí)例五：芭樂(lè)汁和芭樂(lè)汁加海藻糖在第二型糖尿病大鼠血清自由基的作用。

離體血清自由基的測(cè)定方式取大鼠血液200μL放于磁石攪拌的不銹鋼反應(yīng)槽(dish)中，放入化學(xué)冷光分析儀中。保持平穩(wěn)100秒后，加入500μL luminol(2mg luminol溶于45.5mL 0.9％生理食鹽水中)，至300秒停止測(cè)定。計(jì)算全部count面積扣除baseline面積而得結(jié)果。

圖8為芭樂(lè)汁及芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)第二型糖尿病大鼠血清作用的自由基表現(xiàn)量化長(zhǎng)條圖，如圖8所示，可觀察到DM組的血清自由基明顯高于其他組別。*:p<0.05vs.CON，#p<0.05vs.DM，^p<0.05vs.B1。

實(shí)例六：切片染色

(1)免疫切片染色：氧化壓力的增加可能引起發(fā)炎、細(xì)胞雕亡、細(xì)胞自噬和pyroptosis的產(chǎn)生。在腎及胰臟組織的石蠟包埋切片中，以3-nitrotyrosine(3-NT)定位評(píng)估氧化壓力化產(chǎn)生的位置，LC3-II染色細(xì)胞自噬，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)評(píng)估細(xì)胞雕亡和IL-1β的染色評(píng)估pyroptosis。部分的腎臟及胰臟以10％的福馬林固定，再以石蠟進(jìn)行包埋。經(jīng)過(guò)脫蠟及覆水。以1:50的比例稀釋多株抗體3-NT(Alpha Diagnostic International；San Antonio,TX,USA)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

(2)Masson’s染色：腎臟及胰臟組織切片進(jìn)行脫臘程序之后，在室溫下浸泡Bouin’s溶液中40分鐘，以自來(lái)水已流水方式?jīng)_洗10分鐘，接著浸泡入Hematoxylin溶液5分鐘，取出后在流動(dòng)自來(lái)水下沖洗10分鐘；接著以0.75％Orange G染色1分鐘，取出后用1％醋酸浸洗5分鐘，再以Masson B染1分鐘后以1％醋酸浸洗5分鐘。于2.5％phosphtungstic作用15分鐘后，再以1％醋酸浸洗5分鐘，最后用Anilin blue進(jìn)行染色5分鐘；之后再浸泡于1％冰醋酸定色5分鐘，脫水后封片保存。

(3)螢光染色：組織先用福馬林固定，接著包埋于石臘當(dāng)中，用石蠟切片機(jī)切片，在60℃烤片臺(tái)上烤片，脫蠟(丙酮中作用5分鐘三次)，復(fù)水(于99.9％乙醇5分鐘，再換至95％乙醇5分鐘，再換至75％乙醇5分鐘)。接著是抗原回復(fù)(Ag retrieval):將玻片浸泡在檸檬酸鈉修復(fù)液中加熱煮沸10分鐘，冷卻20分鐘后浸泡于PBS 10分鐘。接著以5％BSA孵育一小時(shí)以阻斷非專一性鍵結(jié)。以一級(jí)螢光抗體于4℃孵育18小時(shí)，之后用PBS洗5分鐘三次，再以PBS將heochst稀釋1000倍，在室溫中孵育一小時(shí)，接著以PBS洗5分鐘三次，最后用包埋膠(mounting gel)封片。

圖9A和圖9B為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)腎臟內(nèi)4-HNE氧化壓力作用的免疫切片染色圖及量化長(zhǎng)條圖，如圖9A和圖9B所示，可觀察到于海藻糖及芭樂(lè)汁兩者合并攝取時(shí)，可降低腎臟氧化壓力及發(fā)炎反應(yīng)。因此，海藻糖加入芭樂(lè)汁可以降低腎臟內(nèi)4-HNE氧化壓力而提升芭樂(lè)汁在第二型糖尿病中的保護(hù)功效。*:p<0.05vs.CON，#p<0.05vs.B1。

圖10A和圖10B為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)腎臟內(nèi)IL-1β發(fā)炎指標(biāo)作用的免疫切片染色圖及量化長(zhǎng)條圖，如圖10A和圖10B所示，可觀察到于海藻糖及芭樂(lè)汁兩者合并攝取時(shí)，可降低腎臟發(fā)炎反應(yīng)。因此，海藻糖加入芭樂(lè)汁可降低腎臟內(nèi)IL-1β發(fā)炎指標(biāo)而提升芭樂(lè)汁對(duì)第二型糖尿病的保護(hù)功效。*:p<0.05vs.CON，#p<0.05vs.DM。

圖11A和圖11B為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)腎臟內(nèi)caspase 3調(diào)控的細(xì)胞雕亡指標(biāo)作用的免疫切片染色圖及量化長(zhǎng)條圖，如圖11A和圖11B所示，可觀察到于海藻糖及芭樂(lè)汁兩者合并攝取時(shí)，可降低腎臟受傷作用。因此，海藻糖加入芭樂(lè)汁可以降低腎臟內(nèi)caspase 3調(diào)控的細(xì)胞雕亡指標(biāo)而提升芭樂(lè)汁在第二 型糖尿病中對(duì)腎臟腎小球和腎小管的保護(hù)功效。*:p<0.05vs.CON，#p<0.05vs.DM。

圖12A和圖12B為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)胰島內(nèi)細(xì)胞雕亡數(shù)目作用的免疫切片染色圖及量化長(zhǎng)條圖，如圖12A和圖12B所示，可觀察到于海藻糖及芭樂(lè)汁兩者合并攝取時(shí)，可降低胰臟在第二型糖尿病造成的受傷程度。因此，海藻糖加入芭樂(lè)汁可以降低胰島內(nèi)細(xì)胞雕亡數(shù)目而提升芭樂(lè)汁海藻糖在第二型糖尿病中對(duì)胰臟的保護(hù)功效。*:p<0.05vs.CON，#p<0.05vs.DM。

圖13為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)胰臟和腎臟內(nèi)的細(xì)胞吞噬和細(xì)胞雕亡表現(xiàn)作用的西方墨點(diǎn)法結(jié)果圖，如圖13所示，可觀察到海藻糖加入芭樂(lè)汁可以降低腎臟內(nèi)細(xì)胞雕亡與細(xì)胞自我吞噬數(shù)目而提升芭樂(lè)汁海藻糖在第二型糖尿病中對(duì)腎臟的保護(hù)功效。將兩者合并攝取，還可降低腎臟在第二型糖尿病造成的受傷程度。

圖14為芭樂(lè)汁加海藻糖對(duì)腎臟內(nèi)的細(xì)胞吞噬和細(xì)胞雕亡表現(xiàn)作用的雙重螢光染色圖，如圖14所示，可觀察到海藻糖加入芭樂(lè)汁可以降低腎臟內(nèi)細(xì)胞雕亡與細(xì)胞自我吞噬數(shù)目而提升芭樂(lè)汁海藻糖在第二型糖尿病中對(duì)腎臟的保護(hù)功效。將兩者合并攝取，更可降低腎臟在第二型糖尿病造成的受傷程度。

實(shí)例七：測(cè)定芭樂(lè)汁內(nèi)芭樂(lè)多酚有效成份的HPLC條件

HPLC測(cè)定流程

圖15為本發(fā)明制備的芭樂(lè)汁所含的芭樂(lè)多酚以HPLC分析的結(jié)果圖譜，如圖15所示，由HPLC之的分析可偵測(cè)檢測(cè)到「“芭樂(lè)多酚」”的成分主要為槲皮素(quercetin)，其它成份如韖花酸(ellagic acid)與柚皮素(naringenin)含量較低，而rosmarinic acid與ferulic acid皆無(wú)法測(cè)得。

由上述該等實(shí)例可明顯觀察到，在飲食耐量試驗(yàn)中，芭樂(lè)汁及海藻糖的劑量增加對(duì)血糖變化并無(wú)影響，表示灌喂海藻糖芭樂(lè)汁后，血糖應(yīng)反應(yīng)平穩(wěn)。在連續(xù)灌喂海藻糖芭樂(lè)汁四周后，對(duì)于第二型糖尿病的血糖控制并無(wú)明顯功效，這可能是因?yàn)楣辔购Ｔ逄前艠?lè)汁的周期過(guò)短。而糖尿病后期，胰島細(xì)胞被破壞，胰島素將無(wú)法正常分泌。但可在圖5中觀察到在T5組的胰島素分泌量較DM組高，海藻糖芭樂(lè)汁的攝取似乎能保護(hù)胰島細(xì)胞，而使胰島素能分泌。但此胰島素的分泌并未對(duì)血糖有明顯影響。離體自由基中發(fā)現(xiàn)芭樂(lè)汁有顯著的抗氧化功效，與先前的研究相符。在攝取芭樂(lè)汁四周后，血清中的自由基也有顯著的降低。證明攝取芭樂(lè)汁中的抗氧化物質(zhì)可清除血液中的自由基。并且，雖然海藻糖水抗氧化能力并不如芭樂(lè)汁，并且也不與濃度呈正相關(guān)，但攝取海藻糖芭樂(lè)汁之后的血清自由基卻較單單攝取芭樂(lè)汁組別低。推測(cè)海藻糖經(jīng)過(guò)大鼠吸收后，對(duì)血液自由基的清除也有一定的幫助。而本發(fā)明上述實(shí)例中的免疫切片及螢光染色結(jié)果皆一致導(dǎo)向海藻糖芭樂(lè)汁具有抗氧化、抗發(fā)炎、抗pyroptosis、抗autophagy及抗apoptosis的功效，且與海藻糖芭樂(lè)汁劑量成正相關(guān)。

此外，由上述該等實(shí)例可觀察到20-60％芭樂(lè)汁與1-12％海藻糖的飲食組成物可以調(diào)解血糖，其主要作用在于：(1)降低空腹血糖；(2)降低胰島素阻抗；(3)有助于保護(hù)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞免于高血糖和活性氧的傷害而上調(diào)胰島素的產(chǎn)生。而添加海藻糖成份的芭樂(lè)汁確實(shí)在清除H₂O₂與HOCl的抗氧化能力比單獨(dú)芭樂(lè)汁成份的效果越好。而且對(duì)于(1)降低空腹血糖、(2)降低胰島素阻抗、以及(3)有助于保護(hù)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞免于高血糖和活性氧的傷害而上調(diào)胰島素的產(chǎn)生的作用，也是添加海藻糖成份的芭樂(lè)汁較單獨(dú)芭樂(lè)汁為佳。加海藻糖成份的芭樂(lè)汁較單獨(dú)芭樂(lè)汁其保護(hù)效果更佳的理由為此飲食組成物可以明顯降低在活體腎臟和胰臟細(xì)胞的氧化傷害、細(xì)胞雕亡、細(xì)胞自我吞噬和發(fā)炎性細(xì)胞死亡。而通過(guò)HPLC分析可觀察到本發(fā)明所制備的芭樂(lè)汁中的“芭樂(lè)多酚”主要活性成分為槲皮素，且其和“海藻糖”共同作用下，可以提升 芭樂(lè)汁在第二型糖尿病中的保護(hù)功效。因此將本發(fā)明所制備的芭樂(lè)汁與海藻糖兩者合并攝取后，可降低腎臟及胰臟的氧化壓力及發(fā)炎反應(yīng)。

再者，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)最適當(dāng)量是以每公斤體重為4mL(4mL/kg body weight)，換算成50kg體重約為每日200mL；而兩倍劑量(即每日400mL/50kg body weight)也達(dá)相當(dāng)效果。飲用五倍劑量至1000mL/50kg body weight也未見(jiàn)毒性作用。故本發(fā)明的海藻糖芭樂(lè)汁飲食組成物服用至高劑量并無(wú)毒性且不會(huì)產(chǎn)生傷害。

表二為芭樂(lè)汁內(nèi)芭樂(lè)多酚有效成份濃度的HPLC結(jié)果、海藻糖含量與胰島素濃度關(guān)系。芭樂(lè)汁內(nèi)芭樂(lè)多酚有效成份濃度的HPLC結(jié)果、海藻糖含量與胰島素濃度關(guān)系，經(jīng)下列表二的換算，對(duì)于第二型糖尿病患飲用芭樂(lè)汁，經(jīng)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，濃度越高的芭樂(lè)汁含有更多的“芭樂(lè)多酚”其是因內(nèi)含物主要有含量最多的槲皮素為有效物質(zhì)。經(jīng)HPLC量化的結(jié)果為每毫升為2.53±0.31μg/mL(每日500μg/200mL的T1組)、5.05±0.80μg/mL(每日1000μg/400mL的T2組)、12.63±1.68μg/mL(每日2500μg/1000mL的T5組)。而這些含“芭樂(lè)多酚”槲皮素之的芭樂(lè)汁內(nèi)各含有海藻糖0.2g/kg體重(每日10g/200mL之的T1組)、0.4g/kg體重(每日20g/400mL之的T2組)和1g/kg體重(每日50g/1000mL之的T5組)。此海藻糖芭樂(lè)汁飲食組成物可以改善胰島素分泌，如表二所述。

表二

本項(xiàng)發(fā)明也可將海藻糖芭樂(lè)汁液態(tài)的狀態(tài)作至保健食品應(yīng)用至固態(tài)的粉狀或錠狀的任何型式；也即，本發(fā)明所揭的芭樂(lè)果實(shí)及海藻糖飲食組成物摻 合一食品組成份或藥學(xué)上可接受的液狀或固體狀載劑(例如溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、粘合劑、崩散劑、潤(rùn)滑劑等)制造而成者，得為任何型態(tài)，如錠劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等的固形劑、通常液劑、懸浮劑、乳劑等的液劑等，其皆可達(dá)成本發(fā)明的功效。

所有本說(shuō)明書中所引用的參考文獻(xiàn)、包括但不限于所有論文、刊物、專利、專利申請(qǐng)、發(fā)表、文字、報(bào)導(dǎo)、文稿、小冊(cè)、書籍、網(wǎng)路文章、期刊文章、定期性刊物等等，在此以引用方式將它們?nèi)坎⑷氡菊f(shuō)明書。本文中的參考資料的討論僅欲用于總結(jié)其作者的主張，并不作為承認(rèn)任何參考資料構(gòu)成先前技術(shù)。

雖然已使用特定術(shù)語(yǔ)、裝置及方法說(shuō)明本發(fā)明揭露的實(shí)施態(tài)樣，但此說(shuō)明僅為描述目的。所使用文字為說(shuō)明文字而非限制性文字。應(yīng)了解，本技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未悖離于下列申請(qǐng)專利范圍所主張的本揭露的精神及范疇下，可進(jìn)行更改及變動(dòng)。此外，應(yīng)了解，各種實(shí)施態(tài)樣可全部或部分相互取代。舉例而言，雖然已例示用于制造依據(jù)該等實(shí)例所制成的液態(tài)保健食品或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物的方法，但其他使用方式也被涵蓋于本發(fā)明之中。因此，后附申請(qǐng)專利范圍的精神及范疇不應(yīng)受限于本說(shuō)明中所含的態(tài)樣。

綜上所述，依上文所揭示的內(nèi)容，本發(fā)明確可達(dá)到發(fā)明的預(yù)期目的，提供一種能降低因第二型糖尿病對(duì)腎臟及胰臟引起的氧化壓力及發(fā)炎反應(yīng)，且可提升芭樂(lè)汁的適口性，極具產(chǎn)業(yè)上利用的價(jià)值，爰依法提出發(fā)明專利申請(qǐng)。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。