本發(fā)明涉及一種油乳劑滅活苗新型佐劑的制備，以及該佐劑在油乳劑滅活苗中的應(yīng)用方法，該發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)滅活苗免疫效果的技術(shù)要求。

背景技術(shù)：

我國養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，動物疫病和農(nóng)藥、獸藥藥殘對肉食品出口照成嚴(yán)重?fù)p失。減少動物疾病，避免長期應(yīng)用抗生素，發(fā)展優(yōu)質(zhì)、無公害肉食品，才能保證我國養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

目前，預(yù)防和控制動物傳染病除安全措施外，主要依靠疫苗免疫，特別是通過油乳劑疫苗的免疫預(yù)防。對于油乳劑滅活苗，通常情況在免疫14天后能夠產(chǎn)生抗體，如何能夠在更短的時間激起免疫，提高免疫效果，需要添加佐劑以增強(qiáng)它們誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。

在滅活苗中，佐劑與抗原同時應(yīng)用，能夠增強(qiáng)集體針對抗原的免疫應(yīng)答能力，或改變免疫反應(yīng)類型。其功能主要有：使用部位招攬免疫細(xì)胞和免疫分子，增強(qiáng)免疫應(yīng)答；增強(qiáng)疫苗抗原傳遞；增進(jìn)免疫接觸，增強(qiáng)弱抗原的免疫原性和免疫記憶，改變抗原的構(gòu)型；改變體液抗體的種類、IgG亞型和抗體的親和性，以及細(xì)胞免疫和黏膜免疫效應(yīng)。理想的佐劑不僅沒有免疫原性并能增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，能夠使機(jī)體獲得最佳的保護(hù)性免疫和免疫記憶。有關(guān)免疫增強(qiáng)劑方面的研究，目前還是比較多的，主要集中在中藥多糖、細(xì)胞因子、干擾素、聚肌胞等，另外還有一種被普遍認(rèn)可免疫增強(qiáng)劑---轉(zhuǎn)移因子，目前獸藥行業(yè)已經(jīng)有多家在批量生產(chǎn)。轉(zhuǎn)移因子(Thansfer Factor，簡稱TF)是人或動物致敏白細(xì) 胞釋放的多種因子中的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的低分子物質(zhì)。自從1995年Lawrence發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor)以來。人們對轉(zhuǎn)移因子的研究越來越多。由于其分子量小、無毒、無抗原性、不引起過敏反應(yīng)、不產(chǎn)生中和抗體且可超越種系界限應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，并且在治療免疫缺陷、惡性腫瘤、各種感染性疾病等方面的試驗上均取得一定的療效，因此轉(zhuǎn)移因子在臨床應(yīng)用上具有廣闊的前景。

轉(zhuǎn)移因子具有可透析性，能與抗原結(jié)合而本身卻無抗原性。轉(zhuǎn)移因子帶有致敏淋巴細(xì)胞的特異性免疫信息，能夠特異的將供者所具有的抗原性及其敏銳的特異性轉(zhuǎn)移給一個免疫反應(yīng)陰性的受者，同時受者產(chǎn)生一遲發(fā)型超敏反應(yīng)能力。轉(zhuǎn)移因子具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能等作用，被譽(yù)為T細(xì)胞活性的觸發(fā)劑，細(xì)胞免疫的增強(qiáng)劑、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑及干擾素產(chǎn)生啟動劑。

轉(zhuǎn)移因子溶液配合弱毒疫苗使用，已經(jīng)被證實(shí)可提高疫苗的免疫效果，但尚未有報道將轉(zhuǎn)移因子作為油乳劑滅活苗佐劑的研究報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為滅活疫苗提供了一種新的免疫佐劑-轉(zhuǎn)移因子，以及利用該佐劑制備滅活疫苗的新方法。該疫苗不但能夠縮短油乳劑滅活苗的空白期，也能提高滅活苗的抗體滴度，對提高疫苗保護(hù)力具有明顯效果。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明佐劑的原料組成為：

水相：

轉(zhuǎn)移因子 94％～96％

吐溫-80 4％～6％

油相：

司本-80 5％～6％

注射用白油 95％～94％

硬脂酸鋁 0.5％～2％

其中所述的原料百分比為體積比；

其中轉(zhuǎn)移因子的多肽含量為2.5～5.5mg/ml，核糖含量為50～100ug/ml，轉(zhuǎn)移因子來源為肉雞脾、蛋雞脾、或者豬脾。

其中水相與油相的比例為1∶2～1∶3。

制備完成的佐劑與常規(guī)疫苗按照1∶3～1∶4比例混合乳化制備而成。

取上述原料，按照如下工藝制備成疫苗佐劑

本發(fā)明疫苗佐劑的制備方法為：

取轉(zhuǎn)移因子稀釋液經(jīng)過0.22um過濾除菌，按上述比例添加吐溫-80，37℃搖勻，孵育1～2h，制備成水相，油相按照上述比例進(jìn)行熬制，121℃滅菌30分鐘。在15～35℃下進(jìn)行乳化，轉(zhuǎn)速為2500rpm～3500rpm，時間為15～30min。乳化完成后，與常規(guī)疫苗按照1∶3～1∶4的比例混合，繼續(xù)乳化10～15min，乳化轉(zhuǎn)速為2500rpm～3500rpm，待疫苗劑型及穩(wěn)定性達(dá)到要求即可。

本發(fā)明制作的油乳劑疫苗，將轉(zhuǎn)移因子作為免疫增強(qiáng)劑加入到疫苗中，可以有效提高免疫細(xì)胞的應(yīng)答，加快抗原的遞呈，進(jìn)而縮短了抗原的免疫空白期，提高了抗體水平，能夠激活免疫系統(tǒng)，消除免疫抑制。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

1.佐劑制備

1.1.將轉(zhuǎn)移因子稀釋液經(jīng)過0.22um聚醚砜材質(zhì)濾芯過濾，取樣做無菌、多肽含量、核糖含量檢測，無菌檢驗全部陰性，多肽含量為2.8mg/ml，核糖含量為58ug/ml。

1.2.將4份滅菌吐溫-80加入到96份轉(zhuǎn)移因子稀釋液中，混勻，37℃條件下?lián)u勻1h，取出放于室溫。

1.3.將1份硬脂酸鋁加入到94份白油中，加熱待白油透亮后加入司本-806份，121℃滅菌30min。

1.4.將油相與水相按照3∶1比例進(jìn)行乳化，乳化溫度為20℃，乳化轉(zhuǎn)速為3000rpm，乳化20min。

2.常規(guī)疫苗制備

2.1.取HA效價為1∶1024的新城疫以及HA效價為1∶1024的禽流感(H9亞型)病毒液分別加入甲醛溶液進(jìn)行滅活，兩種滅活液分別為48份。

2.2.取4份吐溫-80放于滅菌柜中，121℃滅菌30min后冷卻至室溫，將吐溫-80加到新城疫與禽流感滅活液中，每種加入2份。

2.3將1份硬脂酸鋁加入到94份白油中，加熱待白油透亮后加入司本-806份，121℃滅菌30min。

2.4將油相與水相按照3∶1比例進(jìn)行乳化，乳化溫度為20℃，乳化轉(zhuǎn)速為3000rpm，乳化20min。

3.含佐劑疫苗制備

將佐劑與常規(guī)疫苗按照2∶7比例混合，乳化10min，乳化乳化轉(zhuǎn)速為3000rpm。

對照例1

以常規(guī)疫苗為對照案例，制備工藝同“實(shí)施案例1中‘2.常規(guī)疫苗制備’”。

對照例2

1.空白油乳劑制備

1.2.將4份滅菌吐溫-80加入到96份滅菌生理鹽水中，混勻，37℃條件下?lián)u勻1h，取出放于室溫。

1.3.將1份硬脂酸鋁加入到94份白油中，加熱待白油透亮后加入司本-80 6份，121℃滅菌30min。

1.4.將油相與水相按照3∶1比例進(jìn)行乳化，乳化溫度為20℃，乳化轉(zhuǎn)速為3000rpm，乳化20min。

2.常規(guī)疫苗制備

2.1.取HA效價為1∶1024的新城疫以及HA效價為1∶1024的禽流感(H9亞型)病毒液分別加入甲醛溶液進(jìn)行滅活，兩種滅活液分別為48份。

2.2.取4份吐溫-80放于滅菌柜中，121℃滅菌30min后冷卻至室溫，將吐溫-80加到新城疫與禽流感滅活液中，每種加入2份。

2.3將1份硬脂酸鋁加入到94份白油中，加熱待白油透亮后加入司本-806份，121℃滅菌30min。

2.4將油相與水相按照3∶1比例進(jìn)行乳化，乳化溫度為20℃，乳化轉(zhuǎn)速為3000rpm，乳化20min。

3.空白對照樣疫苗制備

將空白油乳劑與常規(guī)疫苗按照2∶7比例混合，乳化10min，乳化乳化轉(zhuǎn)速為3000rpm。

比較實(shí)施案例1、對照例1、對照例2質(zhì)量效果

1形狀

1.1外觀：三者均為乳白色乳劑。

1.2劑型：三者均呈油包水型。在盛有純化水的平皿中，滴兩滴乳劑，觀察其形態(tài)，是否分散，以及分散開的時間。結(jié)果顯示兩者形態(tài)均為規(guī)則圓形、不擴(kuò)散。

1.3黏度：用數(shù)字粘度計進(jìn)行檢測。結(jié)果可以看出，本發(fā)明與常規(guī)疫苗的黏度無明顯差別。結(jié)果見表1。

1.4穩(wěn)定性：

(1)取10ml疫苗置于離心管中以3000r/min離心15min，管底析出的水相均小于0.5ml。

(2)取疫苗在37℃左右放置21d，結(jié)果顯示不分層，沒有破乳現(xiàn)象。

2無菌檢驗

按《中華人民共和國獸藥典》2010版附錄的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢驗，完全符合，均無細(xì)菌生長。

3安全性檢驗

用21日齡SPF雞，每種疫苗免疫10只，每只肌肉注射疫苗1ml，另設(shè)空白對照5只。每天觀察，接種后14天剖檢，觀察局部及全身反應(yīng)以及觀察局部疫苗吸收情況。結(jié)果表明，本發(fā)明疫苗與常規(guī)疫苗相比，均沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)。結(jié)果見表1

表1三種疫苗物理形狀及安全檢驗對比

4效力檢驗

4.1新城疫部分

血清學(xué)方法：用30-60日齡SPF雞，每種疫苗免疫10只雞，每只皮下或肌肉注射20ul，空白對照5只。接種后7、14、21、28日進(jìn)行采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價測定。結(jié)果顯示本發(fā)明疫苗比常規(guī)疫苗HI抗體要高出1個滴度左右，常規(guī)疫苗在7天很難激起體液免疫，產(chǎn)生免疫保護(hù)，而本發(fā)明在7天有明顯的免疫抗體產(chǎn)生，比對照例高出0.9個滴度，另外抗體離散度也明顯低于對照例，表明本發(fā)明疫苗保護(hù)力明顯優(yōu)于常規(guī)疫苗。結(jié)果見表2。

表2三種疫苗新城疫部分效力檢驗結(jié)果對比

4.2禽流感部分

血清學(xué)方法：用3～4周齡SPF雞，每種疫苗免疫10只雞，每只皮下或肌肉注射0.3ml，空白對照5只。接種后7、14、21、28日進(jìn)行采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價測定。結(jié)果顯示本發(fā)明疫苗比常規(guī)疫苗HI抗體要高出1個滴度左右，而且抗體離散度較低，表明本發(fā)明疫苗保護(hù)力明顯高于常規(guī)疫苗。評價結(jié)果見表3。

表3三種疫苗禽流感部分效力檢驗結(jié)果對比表

上述結(jié)果清楚的表明，本發(fā)明新型佐劑疫苗所顯示的免疫作用與常規(guī)疫苗相比具有三點(diǎn)優(yōu)勢：一是抗體起到快，免疫空白期短；二是抗體滴度高，比常規(guī)疫苗高出1個滴度左右；三是抗體離散度低，抗體水平比較均勻。

綜合評價，本發(fā)明新型佐劑對傳統(tǒng)疫苗的免疫增強(qiáng)作用明顯，對提高疫苗質(zhì)量，對保護(hù)動物健康，對保證我國養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展有重要意義。

上述詳細(xì)說明系針對本發(fā)明之一可行實(shí)施例之具體說明，惟該實(shí)施案例并非以限制本發(fā)明之專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為之等效實(shí)施或變更，均包含于本案例之專利范圍中。