本發(fā)明涉及獸用生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物用于治療豬偽狂犬病的用途。
背景技術(shù)：
：偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科(Herpesviridae)α亞科中的豬皰疹病毒Ⅰ型(Suidherpesvirus1strain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢(除豬外)及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國(guó)廣泛存在，危害嚴(yán)重，是制約規(guī)模化豬場(chǎng)生產(chǎn)的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎和仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹，死亡率高。該病幾乎遍布世界上所有養(yǎng)豬國(guó)家，分布十分廣泛。目前治療該病最常用的是中藥、抗病毒西藥和抗菌藥，中藥由于其組方不合理或只是簡(jiǎn)單的粉碎，粒徑過(guò)大，藥物釋放較慢，導(dǎo)致其生物利用度較低，臨床效果不是很好；抗菌藥由于有藥物殘留和易于產(chǎn)生耐藥性，使用受到嚴(yán)格限制；而各種抗病毒藥如利巴韋林、金剛烷胺等農(nóng)業(yè)部已經(jīng)禁止使用。此外，現(xiàn)有技術(shù)中描述的疫苗僅僅關(guān)注于預(yù)防豬偽狂犬病病毒的感染，而不考慮任何其它醫(yī)學(xué)用途。因此，在本領(lǐng)域中，現(xiàn)有的用于預(yù)防豬偽狂犬病病毒感染的疫苗，未披露它們能用于治療豬偽狂犬病的作用，亦未披露它們?cè)谥委熦i偽狂犬病的臨床效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題且提供了明顯區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)步，本發(fā)明提供了豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物的藥物用途，所述用途為豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物對(duì)偽狂犬病的治療作用。一般而言，現(xiàn)有技術(shù)中，針對(duì)豬偽狂犬病病毒活疫苗，施用于動(dòng)物時(shí)，目的為預(yù)防偽狂犬病病毒感染，即在動(dòng)物感染偽狂犬病病毒前進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)抗體，以抵御病毒的侵襲。本發(fā)明人在一起感染偽狂犬病病毒的豬群中，施用了加大劑量的豬偽狂犬病病毒活疫苗進(jìn)行接種，意外發(fā)現(xiàn)豬偽狂犬病病毒活疫苗具有治療作用，能有效減輕豬的各種臨床癥狀的嚴(yán)重性及降低死亡率。適用于本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物為包含不少于豬偽狂犬病病毒活疫苗豬用預(yù)防免疫標(biāo)準(zhǔn)的1.5倍施用量。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物為包含豬偽狂犬病病毒活疫苗豬用預(yù)防免疫標(biāo)準(zhǔn)的1.5倍～3倍施用量。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物為包含豬偽狂犬病病毒活疫苗豬用預(yù)防免疫標(biāo)準(zhǔn)的2倍施用量。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“疫苗組合物”指含有抗原的藥物組合物，該藥物組合物可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體針對(duì)相應(yīng)病原的免疫反應(yīng)。對(duì)疫苗組合物的“免疫反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)”為宿主對(duì)所施用的疫苗組合物產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)和/或抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。通常，“免疫反應(yīng)”包括(但不限于)一種或多種以下效應(yīng)：產(chǎn)生或活化針對(duì)在感興趣的疫苗組合物中包括的抗原的特異性抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒力T細(xì)胞。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“活疫苗”指以毒力已經(jīng)減弱但仍可在宿主體內(nèi)或細(xì)胞上復(fù)制的病毒制備的疫苗。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“減毒”用于指以使病原喪失致病性、但保持免疫原性的方式對(duì)基因進(jìn)行突變來(lái)人工降低病原體毒性。通常，通過(guò)UV輻射、化學(xué)處理或體外連續(xù)高階繼代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)減毒。人工的基因改變，例如將已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力減弱。根據(jù)本發(fā)明，所述豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物，優(yōu)選豬偽狂犬病病毒自然缺失毒性基因的自然缺失株活疫苗組合物或人工缺失毒性基因的基因變異株活疫苗組合物。優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病病毒包括豬偽狂犬病病毒JS-2012株、豬偽狂犬病病毒HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRVTJ株、豬偽狂犬病病毒變異株P(guān)RV-ZJ01、豬偽狂犬病病毒變 異株HN1201株、豬偽狂犬病病毒變異株HN1202株、豬偽狂犬病病毒Fa株、豬偽狂犬病病毒BarthaK-61株、豬偽狂犬病病毒Bucharest株、豬偽狂犬病病毒HB-98株、豬偽狂犬病病毒SA215株、豬偽狂犬病病毒HN1201-R株。豬偽狂犬病病毒株JS-2012株公開(kāi)于免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定[J].童武，張青占，鄭浩等，中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)2013,21(3):1-7；豬偽狂犬病病毒HeN1株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為CGMCCNO.6656，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公開(kāi)于PathogenicPseudorabiesVirus,XiulingYu,ZhiZhou,DongmeiHu,etal.China,2012EmergingInfectiousDiseases，www.cdc.gov/eidol.20,No.1,January2014；PRVTJstrain(PRVTJ株)，公開(kāi)于Chun-HuaWang,JinYuan,Hua-YangQin，etal，AnovelgE-deletedpseudorabiesvirus(PRV)providesrapidandcompleteprotectionfromlethalchallengewiththePRVvariantemerginginBartha-K61-vaccinatedswinepopulationinChina.Vaccine32(2014):3379–3385中；豬偽狂犬病病毒變異株P(guān)RV-ZJ01，其保藏號(hào)為CGMCCNo.8170，公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)CN103627678A；豬偽狂犬病病毒HN1201株(Pseudorabiesvirus,strainHN1201)保藏號(hào)為CCTCCNO.V201311，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)，保藏日期為2013年5月20日；豬偽狂犬病病毒HN1202株(Pseudorabiesvirus,strainHN1202)保藏號(hào)為CCTCCNO.V201335，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)，保藏日期為2013年8月26日；豬偽狂犬病病毒Fa株公開(kāi)于偽狂犬病毒Fa株gB_gC_gD基因的克隆與序列分析[J].陳振海等，福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2007，22(2)：120-125；豬偽狂犬病病毒BarthaK-61株公開(kāi)于西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)商品化疫苗；豬偽狂犬病病毒Bucharest株公開(kāi)于碩騰公司生產(chǎn)商品化疫苗；豬偽狂犬病病毒HB-98株公開(kāi)于武漢科前生產(chǎn)商品化疫苗；豬偽狂犬病毒SA215株公開(kāi)于新型偽狂犬病病毒基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究(初報(bào))[J].郭萬(wàn)柱等，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2000，18(1)1-3；豬偽狂犬病病毒HN1201-R 株(Pseudorabiesvirus,strainHN1201-R)保藏號(hào)為CCTCCNO.V201516，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)，保藏日期為2015年3月17日。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，在本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物中，所述組合物為豬偽狂犬病病毒HN1201株、HN1201-R株、BarthaK-61株、Bucharest株、HB-98株和SA215株減毒活疫苗組合物。術(shù)語(yǔ)“治療”指通過(guò)施用豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物使豬偽狂犬病毒相關(guān)疾病或豬偽狂犬病病毒感染引起的癥狀減輕或轉(zhuǎn)好的所有行為。本文所用的術(shù)語(yǔ)“豬偽狂犬病病毒相關(guān)疾病”用于指由豬偽狂犬病毒感染引起的疾病。它的例子包括發(fā)病仔豬表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、拉稀、體溫升高，一旦發(fā)病，懷孕母豬可發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒或死胎或繁殖障礙，但不限于此。本文所用的術(shù)語(yǔ)“豬偽狂犬病病毒相關(guān)疾病”可以進(jìn)一步用于指表現(xiàn)為任何年齡的豬都會(huì)感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短(1～2天)，發(fā)病率在10％～100％之間，發(fā)病豬死亡率在10％～100％之間(仔豬死亡率可高達(dá)100％)，感染后可引起豬只高熱(40～42℃，持續(xù)3日以上)，呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側(cè)臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質(zhì)量下降，懷孕母豬流產(chǎn)(高達(dá)35％)，早產(chǎn)，死胎，弱仔(弱仔14日齡前全部死亡)等繁殖障礙癥狀，但不限于此。以及感染后會(huì)造成成年豬(體重在50kg以上豬)高熱(40～42℃，持續(xù)3日以上)，呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側(cè)臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死；新生及4周齡以內(nèi)的仔豬突然發(fā)病，發(fā)生大批死亡，死亡率達(dá)90％以上；發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為體溫上升達(dá)41℃以上，食欲廢絕，伴有明顯的神經(jīng)癥狀和腹瀉；斷奶前后仔豬主要為呼吸系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、流鼻涕等。本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物可包括一種或多種可獸用載劑。本文所用“可獸用載劑”包括任何即全部溶劑、分散介質(zhì)、涂布劑、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物可納 入已知可注射用生理學(xué)上可接受的無(wú)菌溶液。另外，本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物可包括稀釋劑、等滲劑、穩(wěn)定劑或佐劑。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油及諸如此類。等滲劑可尤其包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。穩(wěn)定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的堿金屬鹽。本文所用“佐劑”可包括氫氧化鋁及磷酸鋁；皂苷，例如QuilA、QS-21(CambridgeBiotech公司，CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals公司，Birmingham，AL)；油包水乳液；水包油乳液；水包油包水乳液。該乳液可尤其基于輕質(zhì)液體石蠟油(歐洲藥典類型(EuropeanPharmacopeatype))；類異戊二烯油，例如由烯烴(尤其系異丁烯或癸烯)寡聚產(chǎn)生之角鯊?fù)榛蚪酋徬┯?；含有直鏈烷基之酸或醇之酯，更具體而言為植物性油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，尤其系異硬脂酸酯。油可與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑優(yōu)選系非離子型表面活性劑，具體而言系山梨醇酐、二縮甘露醇(例如無(wú)水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇與油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之視情況經(jīng)乙氧基化之酯，及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，具體而言系普流尼克(Pluronic)產(chǎn)品，尤其系L121。參見(jiàn)Hunter等人，TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Ed.Stewart-Tull，D.E.S.).JohnWileyandSons，NY，第51-94頁(yè)(1995)及Todd等人，Vaccine15：564-570(1997)。其它適宜佐劑尤其包括(但不限于)RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi公司)、嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGA)、SAF-M(Chiron，EmeryvilleCA)、單磷酰脂質(zhì)A、阿夫立定(Avridine)脂質(zhì)-胺佐劑、自大腸桿菌(E.coli)(重組的或其它方式)之不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS1314或胞壁酰二肽。另外，該組合物可包括一或多種可藥用載劑。本文所用“可藥用載劑”包括任何及全部溶劑、分散介質(zhì)、涂布劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。所述組合物可進(jìn)一步包括一種或多種其它免疫調(diào)節(jié)劑，例如白介素、干擾素或其它細(xì)胞因子。所述組合物亦可包括慶大霉素 (Gentamicin)及硫柳汞(Merthiolate)。本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物施用方式包括經(jīng)真皮內(nèi)、經(jīng)氣管內(nèi)或經(jīng)直腸內(nèi)施用。優(yōu)選可經(jīng)肌肉或經(jīng)鼻內(nèi)施用，最優(yōu)選為經(jīng)肌內(nèi)施用。在動(dòng)物體內(nèi)，可證明經(jīng)由靜脈內(nèi)或藉由直接注射至目標(biāo)組織中來(lái)施用所述上述疫苗組合物是有利的。對(duì)于全身施用，靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服是優(yōu)選的。更局部施用可經(jīng)皮下、經(jīng)真皮內(nèi)、經(jīng)皮內(nèi)、經(jīng)心臟內(nèi)、經(jīng)髓內(nèi)、經(jīng)肺內(nèi)或直接在或靠近擬治療的組織(結(jié)蹄組織、神經(jīng)組織、肌肉組織)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)治療所期望的持續(xù)時(shí)間及有效性，本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物施用次數(shù)為一次或數(shù)次，亦可間歇施用，例如以每日計(jì)投與數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月且以不同劑量。本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物還可用于治療動(dòng)物個(gè)體中或動(dòng)物群體的豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。所述“豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染”包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒所引起的相關(guān)癥狀：自由咳嗽及呼吸困難、生長(zhǎng)緩慢、飼料效率降低、昏睡、厭食或在肥育中期至后期死亡率顯著增加。本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種治療豬偽狂犬病的與現(xiàn)有技術(shù)不同的技術(shù)手段，有效減輕豬偽狂犬病毒感染的各種臨床癥狀的嚴(yán)重性及降低死亡率，具有積極的意義；令人意外的是本發(fā)明具有治療作用的疫苗組合物還可用于治療動(dòng)物個(gè)體中或動(dòng)物群體的豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒所引起的相關(guān)癥狀：自由咳嗽及呼吸困難、生長(zhǎng)緩慢、飼料效率降低、昏睡、厭食或在肥育中期至后期死亡率顯著增加等方面有顯著的治療作用，對(duì)于臨床具有積極的指導(dǎo)意義。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這 些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1豬偽狂犬病病毒活疫苗BarthaK-61株治療試驗(yàn)將21日齡PRV抗體陰性仔豬14頭隨機(jī)分成2組，第1組10頭，第2組4頭，將豬偽狂犬病病毒Bartha株病毒液2.8×109.0TCID50劑量稀釋后噴霧感染豬群，第2天出現(xiàn)臨床癥狀，分別采集各豬只鼻拭子，并對(duì)第一組進(jìn)行接種豬偽狂犬病病毒活疫苗BarthaK-61株(西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)，批次77BN)兩頭份，每天固定時(shí)間觀察臨床狀況。結(jié)果顯示，第1組接種組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡1頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第2組在感染后第2天死亡1頭，第3天全部死亡，有明顯的臨床體征。具體結(jié)果見(jiàn)表1。表1豬偽狂犬病病毒活疫苗BarthaK-61株治療試驗(yàn)結(jié)果組別感染方式仔豬數(shù)鼻拭子陽(yáng)性率治療劑量存活數(shù)保護(hù)率(％)1噴霧1010/102頭份7702噴霧44/4—00通過(guò)比較兩組仔豬的最終存活情況，明顯可以看出，豬偽狂犬病病毒活疫苗對(duì)感染豬偽狂犬病毒的豬只有治療作用，可以作為解決感染豬偽狂犬病的一種技術(shù)手段。實(shí)施例2豬偽狂犬病病毒活疫苗Bucharest株治療試驗(yàn)將21日齡PRV抗體陰性仔豬14頭隨機(jī)分成2組，第1組10頭，第2組4頭，將豬偽狂犬病病毒Bartha株病毒液2.8×109.0TCID50劑量稀釋后噴霧感染豬群，第2天出現(xiàn)臨床癥狀，分別采集各豬只鼻拭子，并對(duì)第一組進(jìn)行接種豬偽狂犬病病毒活疫苗Bucharest株(碩騰美國(guó)公司林肯廠生產(chǎn)，批次A407908)兩頭份，每天固定時(shí)間觀察臨床狀況。結(jié)果顯示，第1組接種組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡2頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第2組在感染后第2天死亡1頭，第3天全部死亡，有明顯的臨床體征。具體結(jié)果見(jiàn)表2。表2豬偽狂犬病病毒活疫苗Bucharest株治療試驗(yàn)結(jié)果組別感染方式仔豬數(shù)鼻拭子陽(yáng)性率治療劑量存活數(shù)保護(hù)率(％)1噴霧1010/102頭份6602噴霧44/4—00通過(guò)比較兩組仔豬的最終存活情況，明顯可以看出，豬偽狂犬病病毒活疫苗對(duì)感染豬偽狂犬病病毒的豬只有治療作用。實(shí)施例3豬偽狂犬病病毒活疫苗HB-98株治療試驗(yàn)將21日齡PRV抗體陰性仔豬44頭隨機(jī)分成5組，第1-4組10頭，第5組4頭，將豬偽狂犬病病毒鄂A株病毒液8.8×109.0TCID50劑量稀釋后噴霧感染豬群，第2天出現(xiàn)臨床癥狀，分別采集各豬只鼻拭子，并對(duì)第一組進(jìn)行接種豬偽狂犬病病毒活疫苗HB-98株(武漢科前生產(chǎn)，批次150105)1頭份，第二組接種1.5頭份。第三組接種2頭份，第四組接種3頭份，每天固定時(shí)間觀察臨床狀況。結(jié)果顯示，第1組接種當(dāng)天死亡3頭，第2天死亡5頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第2組接種當(dāng)天死亡3頭，第2天死亡2頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第3組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡2頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第4組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡2頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第5組在感染后第2天死亡1頭，第3天全部死亡，有明顯的臨床體征。具體結(jié)果見(jiàn)表3。表3豬偽狂犬病病毒活疫苗HB-98株治療試驗(yàn)結(jié)果組別感染方式仔豬數(shù)鼻拭子陽(yáng)性率治療劑量存活數(shù)保護(hù)率(％)1噴霧1010/101頭份2202噴霧1010/101.5頭份5503噴霧1010/102頭份6604噴霧1010/103頭份6605噴霧44/4—00通過(guò)比較各組仔豬的最終存活情況，明顯可以看出，豬偽狂犬病病毒活疫苗對(duì)感染豬偽狂犬病病毒的豬只有治療作用，而且發(fā)現(xiàn)，治療劑量對(duì)治療效果有著一定的影響。實(shí)施例4豬偽狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗的制備1.病毒的增殖豬偽狂犬病病毒HN1201-R株為豬偽狂犬病病毒HN1201株通過(guò)自然傳代方式致弱獲得的減毒疫苗株，保藏號(hào)為CCTCCNO.V201516，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)，保藏日期為2015年3月17日。將豬偽狂犬病病毒HN1201-R株病毒接種于已長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞，吸附1h后，加入1000ml含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃溫室中轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為6轉(zhuǎn)/小時(shí)。待80％細(xì)胞病變后，反復(fù)凍融2次，收獲病毒，測(cè)定病毒滴度，置低溫保存。2.穩(wěn)定劑的配制每100ml去離子水中加蔗糖40g，明膠8g，充分融化后，置高壓蒸氣滅菌(121℃30min)。3.疫苗的制備將上述制備并保存的病毒液與穩(wěn)定劑按1:1(體積比)混合，凍干。疫苗含量具體配比見(jiàn)表4。表4豬偽狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗含量配比疫苗1(TCID50)HN1201-R株抗原106.0保護(hù)劑(V/V)50％實(shí)施例5豬偽狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗治療試驗(yàn)將21日齡PRV抗體陰性仔豬14頭隨機(jī)分成2組，第1組每組10頭，第2組4頭，將豬偽狂犬病病毒HN1201株病毒液2.8×109.0TCID50劑量稀釋后噴霧感染豬群，第2天出現(xiàn)臨床癥狀，分別采集各豬只鼻拭子，并對(duì)第1組進(jìn)行接種實(shí)施例4制備的豬偽狂犬病病毒活疫苗HN1201株兩頭份，每天固定時(shí)間觀察臨床狀況。結(jié)果顯示，第1組接種組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡1頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第2組在感染后第2天死亡2頭，第3天全部死亡，有明顯的臨床體征。具體結(jié)果見(jiàn)表5。表5豬偽狂犬病病毒活疫苗HN1201-R株治療試驗(yàn)結(jié)果組別感染方式仔豬數(shù)鼻拭子陽(yáng)性率治療劑量存活數(shù)保護(hù)率(％)1噴霧1010/102頭份7702噴霧44/4—00通過(guò)比較兩組仔豬的最終存活情況，明顯可以看出，豬偽狂犬病病毒活疫苗對(duì)感染豬偽狂犬病病毒的豬只有治療作用。實(shí)施例6豬偽狂犬病病毒弱毒活疫苗治療效果比較試驗(yàn)將21日齡PRV抗體陰性仔豬44頭隨機(jī)分成5組，第1-4組10頭，第5組4頭，將豬偽狂犬病病毒HN1201株病毒液8.8×109.0TCID50劑量稀釋后噴霧感染豬群，第2天出現(xiàn)臨床癥狀，分別采集各豬只鼻拭子，并對(duì)第1組進(jìn)行接種豬偽狂犬病病毒活疫苗BarthaK-61株(西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)，批次77BN)兩頭份，第2組進(jìn)行接種豬偽狂犬病病毒活疫苗Bucharest株(碩騰美國(guó)公司林肯廠生產(chǎn)，批次A407908)兩頭份，第3組進(jìn)行接種豬偽狂犬病病毒活疫苗HB-98株(武漢科前生產(chǎn)，批次150105)2頭份，第4組進(jìn)行接種實(shí)施例4制備的豬偽狂犬病病毒活疫苗HN1201-R株兩頭份，每天固定時(shí)間觀察臨床狀況。結(jié)果顯示，第1組接種組接種當(dāng)天死亡3頭，第2天死亡3頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第2組接種組接種當(dāng)天死亡3頭，第2天死亡3頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第3組接種組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡3頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第4組接種組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡1頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第5組在感染后第2天死亡1頭，第3天全部死亡，有明顯的臨床體征。具體結(jié)果見(jiàn)表6。表6豬偽狂犬病病毒弱毒活疫苗治療效果比較試驗(yàn)結(jié)果組別感染方式仔豬數(shù)鼻拭子陽(yáng)性率治療劑量存活數(shù)保護(hù)率(％)1噴霧1010/102頭份4402噴霧1010/102頭份4403噴霧1010/102頭份5504噴霧1010/102頭份7705噴霧44/4—00通過(guò)比較各組仔豬的最終存活情況，明顯可以看出，不同來(lái)源的豬偽狂犬病病毒活疫苗對(duì)感染豬偽狂犬病毒的豬只具有不同程度的治療作用；尤其是豬偽狂犬病病毒HN1201-R株活疫苗，治療作用最為明顯，療效最佳。實(shí)施例7豬偽狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗治療廣譜性試驗(yàn)將21日齡PRV抗體陰性仔豬42頭隨機(jī)分成6組，第1、3、5組各10頭，第2、4、6組各4頭，將豬偽狂犬病病毒Bartha株病毒液2.8×109.0TCID50劑量稀釋后噴霧感染豬群第1組和第2組，將豬偽狂犬病病毒鄂A株病毒液2.8×109.0TCID50劑量稀釋后噴霧感染豬群第3組和第4組，將豬偽狂犬病病毒HN1201株病毒液2.8×109.0TCID50劑量稀釋后噴霧感染豬群第5組和第6組。觀察各組情況，各組第2天均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，分別采集各豬只鼻拭子，并對(duì)第1組、第3組和第5組進(jìn)行接種實(shí)施例4制備的豬偽狂犬病病毒活疫苗HN1201-R株兩頭份，每天固定時(shí)間觀察臨床狀況。結(jié)果顯示，第1組接種組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡1頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第3組接種組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡1頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第5組接種組接種當(dāng)天死亡2頭，第2天死亡1頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；第2組在感染后第2天死亡1頭，第3天全部死亡，有明顯的臨床體征；第4組在感染后第2天死亡1頭，第3天全部死亡，有明顯的臨床體征；第6組在感染后第2天死亡2頭，第3天全部死亡，有明顯的臨床體征。具體結(jié)果見(jiàn)表7。表7豬偽狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗治療廣譜性試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)比較各組仔豬的最終存活情況，明顯可以看出，豬偽狂犬病病毒活疫苗對(duì)感染豬偽狂犬病毒的豬只有治療作用，而且發(fā)現(xiàn)，豬偽狂犬病病毒HN1201-R株弱毒活疫苗對(duì)不同來(lái)源的豬偽狂犬病病毒感染的豬只均具有良好的治療作用，對(duì)市場(chǎng)的廣泛推廣及應(yīng)用具有積極的意義。實(shí)施例8豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物的應(yīng)用試驗(yàn)此研究包括剛出生的231頭仔豬，將這些仔豬按窩隔離，并分為兩組，即疫苗治療組(180頭)、對(duì)照組(51頭)。A組：在研究當(dāng)天(第0天)，對(duì)1日齡的仔豬進(jìn)行單次接種實(shí)施例4制備的豬偽狂犬病病毒活疫苗HN1201-R株兩頭份。B：對(duì)照組為未經(jīng)治療的仔豬。一周后研究終止。所記錄參數(shù)如下：(1)臨床表現(xiàn)(所有動(dòng)物)(2)死亡率(所有動(dòng)物)(3)尸檢(若可能，每一只死亡或處死動(dòng)物)養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)病情況一日齡部分仔豬開(kāi)始不停拉稀，走路有輕微異樣。根據(jù)母豬飼養(yǎng)及農(nóng)場(chǎng)免疫程序，并通過(guò)對(duì)仔豬排泄物進(jìn)行鑒定，確定為偽狂犬病毒感染。結(jié)果自研究起始至研究結(jié)束，疫苗治療組接種當(dāng)天死亡15頭，第二天死亡6頭，其他豬只出現(xiàn)臨床體征在3天后逐步恢復(fù)正常，最終存活；對(duì)照組在研究當(dāng)天死亡20頭，第二天死亡20頭，有明顯的臨床體征。具體結(jié)果見(jiàn)表8。表8豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物的應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)比較各組仔豬的最終存活情況，以及臨床體征變化，A組治療 組除了有兩窩仔豬A6和A11沒(méi)有感染病毒以及B組對(duì)照組除了B4沒(méi)有感染病毒存活外，其他各窩采集鼻拭子均呈現(xiàn)陽(yáng)性；在臨床表現(xiàn)方面，所有感染豬只，對(duì)照組和治療組有類似的臨床表現(xiàn)，體溫升高、精神沉郁、拉稀、走路異樣，通過(guò)對(duì)死亡豬只進(jìn)行尸檢，死亡豬只均為典型的豬偽狂犬病毒感染，不同的是，對(duì)照組和治療在進(jìn)行治療后，臨床癥狀差異明顯，對(duì)照組臨床癥狀逐漸加重，所有感染豬只均出現(xiàn)死亡情況，而治療組在進(jìn)行治療后2天就逐漸好轉(zhuǎn)，3天大部分感染豬只痊愈；整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組豬只比治療組豬只顯著較高的死亡率，對(duì)照組平均78.43％死亡率(感染豬只全部死亡)，治療組僅僅為11.67％死亡率，下降了85.12％。證明了豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物對(duì)豬偽狂犬病病毒感染具有良好的治療作用，能顯著降低死亡率，提高存活數(shù)，有效減輕豬偽狂犬病毒感染的各種臨床癥狀的嚴(yán)重性，提供了一種治療豬偽狂犬病的技術(shù)手段，具有積極的意義。實(shí)施例9豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物在治療豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染方面的應(yīng)用此試驗(yàn)中包括463頭商品豬，將這些豬按照體重、以及是否一窩所生區(qū)分開(kāi)，隨機(jī)分為2組，即疫苗治療組(236頭豬)A、對(duì)照組(227頭豬)B。A組:在試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天(第0天)，對(duì)約14日齡的豬進(jìn)行單次接種實(shí)施例4制備的豬偽狂犬病病毒活疫苗HN1201-R株兩頭份。B組:對(duì)照組為未經(jīng)治療的豬。在肥育結(jié)束時(shí)(試驗(yàn)第24周)終止試驗(yàn)。所記錄的參數(shù)參數(shù)記錄如下：(1)個(gè)體體重(所有動(dòng)物)(2)僵豬率(所有動(dòng)物)(3)臨床表現(xiàn)(所有動(dòng)物)(4)死亡率(所有動(dòng)物)(5)尸檢(若可能，每一只死亡或處死動(dòng)物)根據(jù)飼養(yǎng)及肥育農(nóng)場(chǎng)的發(fā)病史，動(dòng)物自育肥中期開(kāi)始出現(xiàn)呼吸道癥狀。這些癥狀伴有肥育期間的體重增加程度降低(ADWG700-740g)及死亡率增加(7.4％-8.6％)。此時(shí)被認(rèn)為涉及的病原體為主要為PRRSV。有趣的是，在此試驗(yàn)的結(jié)果表明，PRRSV的感染在呼吸道癥狀出現(xiàn)前約4-6周被檢測(cè)到，可能是豬群中存在早期潛伏感染造成的。結(jié)果體重、體重增加、平均每日體重增加(ADWG)在試驗(yàn)起始時(shí)疫苗治療組和對(duì)照組體重相當(dāng)。在試驗(yàn)至第17周及第24周時(shí)，疫苗治療組的體重顯著高于對(duì)照組的體重(分別為p＝0.0005及p＜0.0001)。自試驗(yàn)起始至第24周，疫苗治療組動(dòng)物比對(duì)照組動(dòng)物多增重4.8kg。此對(duì)應(yīng)于，從試驗(yàn)起始至第17周時(shí)，疫苗治療組動(dòng)物的ADWG較對(duì)照組高16.4g/d，至第24周時(shí)疫苗治療組動(dòng)物的ADWG較對(duì)照組高24.3g/d。對(duì)于整個(gè)肥育期(第10-24周)而言，ADWG可從對(duì)照組動(dòng)物的730.6g/d增加至疫苗治療組動(dòng)物的782.1g/d，具體情況見(jiàn)表9。表9疫苗治療組和對(duì)照組體重增長(zhǎng)情況*表示組間比較t檢驗(yàn)之p值，ns表示差異不顯著，***表示差異顯著，p≤0.001表示差異極顯著。僵豬率在任一稱重時(shí)間點(diǎn)，未在疫苗治療組與對(duì)照組之間觀測(cè)到僵豬率的顯著差異。治療組和對(duì)照組的僵豬率都較低(2.7％-4.4％)。臨床表現(xiàn)對(duì)照組和疫苗治療組有類似的臨床表現(xiàn)，跛行、腹瀉(在4％-6％的動(dòng)物中)。這些表現(xiàn)在對(duì)照組和疫苗治療組中出現(xiàn)頻率相等。對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行尸檢且隨后進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌可能是引起跛行的感染性病原體，溶血性大腸桿菌可能是腹瀉的原因。此外，對(duì)照組在12-24周呼吸道癥狀明顯(在17-22％的動(dòng)物中)，咳嗽、呼吸困難，嚴(yán)重的豬只呈犬坐呼吸。與對(duì)照組相比，疫苗治療組豬只中咳嗽及呼吸困難的頻率分別降低32％及35.3％。表明疫苗治療組對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染具有較好的治療效果。死亡率整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組豬只具有比疫苗治療組豬只顯著較高的死亡率(疫苗治療組動(dòng)物：2.12％)。疫苗接種組豬只的死亡率比對(duì)照組豬只下降58.2％。本實(shí)施例在肥育后期有典型呼吸道癥狀的農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。豬在12-19周齡時(shí)發(fā)展出呼吸道癥狀、死亡率增加、且體重增加幅度減小。通過(guò)血清學(xué)及微生物學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)，豬繁殖與呼吸綜合征參與其中。與對(duì)照組相比，疫苗治療組的以下統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著表現(xiàn)值得注意：-增重?fù)p失減小-死亡率降低-咳嗽及呼吸困難減少如所預(yù)期，僵豬率未觀測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，因?yàn)榻┴i的出現(xiàn)并非豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的典型表現(xiàn)。將這些表現(xiàn)匯總能得出以下結(jié)論：1、本實(shí)驗(yàn)在肥育中受豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的畜群中進(jìn)行，觀測(cè)到呼吸道癥狀、增重?fù)p失及死亡率增加。2、豬偽狂犬病病毒活疫苗組合物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種可降低或甚至防治豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染引起的各種癥狀，能顯著降低死亡率，減小增重?fù)p失，有效減輕咳嗽及呼吸困難癥狀，具有良好的治療作用，對(duì)于臨床具有積極的指導(dǎo)意義。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以優(yōu)選實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3