本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及銅離子源和白皮杉醇的藥物組合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤(tumour)是指機(jī)體在各種致瘤因子作用下，局部組織細(xì)胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因?yàn)檫@種新生物多呈占位性塊狀突起，也稱贅生物(neoplasm)。

白藜蘆醇化學(xué)名稱為(E)-3,5,4-三羥基二苯乙烯，是非黃酮類的多酚化合物，在1939年首次發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇，20世紀(jì)70年代首次發(fā)現(xiàn)葡萄中含有這種物質(zhì)，后來人們發(fā)現(xiàn)虎杖、花生、桑椹等植物中也含有這種成分。天然白藜蘆醇是一種天然活性成分，它能以游離態(tài)(順式、反式)和糖苷結(jié)合態(tài)(順式、反式)2種形式在植物(如中藥材虎杖)中分布及生物合成，且均具有抗氧化效能，其中反式異構(gòu)體的生物活性強(qiáng)于順式，是葡萄中的一種重要的植物抗毒素。人們對(duì)其自然資源進(jìn)行了廣泛的研究，至少在21個(gè)科、31個(gè)屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇，如：葡萄科的葡萄屬、蛇葡萄屬，豆科的落花生屬、決明屬、槐屬，百合科的藜蘆屬，桃金娘科的桉屬，蓼科的蓼屬等。含白藜蘆醇的許多植物是常見的藥用植物，如決明、藜蘆、虎杖等，有的就是食物，如：葡萄、葡萄皮中白藜蘆醇的含量最高，可達(dá)50-100mg/kg。

白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結(jié)和血管舒張，保持血液暢通，可預(yù)防癌癥的發(fā)生及發(fā)展，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病，缺血性心臟病，高血脂的防治作用，抑制腫瘤的作用，還具有雌激素樣作用，可用于治療乳腺癌等疾病。在白藜蘆醇多種藥理活性中，最令人矚目 和最有發(fā)展前景的是其抗腫瘤作用。1993年，Jayafilake等研究表明反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇都具有抗癌活性，其原因是它們可以抑制蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶的活性。有研究表明，白藜蘆醇在癌癥發(fā)生的3個(gè)階段即起始、增進(jìn)和發(fā)展過程中，都有較大的防癌活性，且對(duì)癌癥發(fā)生3個(gè)階段都有抑制乃至逆轉(zhuǎn)作用：(1)抑制起始作用：減少自由基形成，誘導(dǎo)Ⅱ期藥代酶增多，拮抗二惡英作用；(2)抑制增進(jìn)作用：抑制環(huán)氧合酶(COX)，抑制過氧化氫酶；(3)抑制發(fā)展作用：抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。白藜蘆醇可望作為酪氨酸蛋白激酶PTK的抑制劑，諸多醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、白血病、卵巢癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞均有明顯的抑制作用。

1997年1月，美國芝加哥伊利諾斯大學(xué)藥學(xué)院的John Pezzuto教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組在著名的美國《科學(xué)》雜志上，發(fā)表了題為《葡萄的天然產(chǎn)物白藜蘆醇的抗癌活性》的論文，引起醫(yī)學(xué)科學(xué)界的轟動(dòng)。論文證明白藜蘆醇能有效抑制與癌癥各過程相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)。作為抗氧化劑、抗突變劑和抗炎劑，白藜蘆醇顯示出對(duì)癌癥的化學(xué)預(yù)防能力，能夠防止細(xì)胞癌病變并阻止惡性腫瘤擴(kuò)散，還能抑制蛋白鉻氨酸激酶，通過阻止激酶功能而起抗突變作用，還可抑制細(xì)胞炎。

但相關(guān)研究證實(shí)，白藜蘆醇的生物利用度低，進(jìn)入人體后很快被轉(zhuǎn)化或代謝。白皮杉醇(Pice)是白藜蘆醇在人體腫瘤細(xì)胞中伴隨芳基烴羥化酶CYP1B1的過表達(dá)產(chǎn)物(如式Ⅰ所示)，從這個(gè)意義上說，白藜蘆醇是作為前提藥物，而實(shí)際發(fā)揮生物活性作用于腫瘤細(xì)胞的藥物應(yīng)是白藜蘆醇羥基化的產(chǎn)物Pice，且Pice的抗腫瘤效果已被越來越多的研究證實(shí)。

根據(jù)白藜蘆醇及其類似物的構(gòu)效關(guān)系，Pice在結(jié)構(gòu)上具有比白藜蘆醇更高的藥理活性，且已得到學(xué)者的證實(shí)。因此，研究Pice比研究白藜蘆醇更有意義，以期待研發(fā)出更有效的抗腫瘤藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本申請(qǐng)的發(fā)明人對(duì)白皮杉醇(Pice)的抗腫瘤活性進(jìn)行了深入的研究，意料不到的發(fā)現(xiàn)，白皮杉醇與銅離子共同存在時(shí)，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力均比單獨(dú)使用白皮杉醇的強(qiáng)，表現(xiàn)為銅離子Cu(II)與Pice之間的協(xié)同效應(yīng)。

本發(fā)明正是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的。

因此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種抗腫瘤的組合物，該組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力強(qiáng)，其含有的兩種組分對(duì)腫瘤的治療具有協(xié)同作用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:

抗腫瘤的組合物，其包括有效量的銅離子源和白皮杉醇；所述銅離子源為產(chǎn)生銅離子的化合物或體系。例如，銅離子源包括，但不限于水溶性鹵化物(halide)、硝酸鹽、醋酸鹽、硫酸鹽和其它有機(jī)和無機(jī)銅鹽?？墒褂靡环N或多種這樣的鹽的混合物提供銅離子。例子是諸如硫酸銅、五水合物的硫酸銅、氯化銅、硝酸銅、氫氧化銅和氨基磺酸銅等。

進(jìn)一步，所述的抗腫瘤的組合物，所述銅離子源優(yōu)選為銅化合物。

進(jìn)一步，所述銅化合物優(yōu)選為硫酸銅、氯化銅、硝酸銅、醋酸銅和水楊酸 銅中的一種或多種。

更優(yōu)選的，所述銅化合物為硫酸銅，更優(yōu)選為無水五水合硫酸銅。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種抗腫瘤的體系。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:

一種抗腫瘤的體系，所述體系中包括有效量的銅離子源和白皮杉醇。

進(jìn)一步，所述的體系，所述銅離子源提供3-200μmol/L濃度的銅離子。優(yōu)選為銅離子的濃度25-100μmol/L。

進(jìn)一步，所述的體系，所述白皮杉醇的濃度為3-200μmol/L。優(yōu)選為白皮杉醇的濃度25-100μmol/L。

本發(fā)明的目的之三在于提供了本發(fā)明所述的組合物的一種應(yīng)用，該應(yīng)用為腫瘤的治療提供了新的思路。

所述抗腫瘤的組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述抗腫瘤的組合物包括有效量的銅離子源和白皮杉醇。在本發(fā)明中，白皮杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用；但白皮杉醇與銅離子Cu(II)同時(shí)存在時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為Cu(II)與Pice之間的協(xié)同效應(yīng)。因此，銅離子源和白皮杉醇的組合物可用于抗腫瘤的藥物的研究。

進(jìn)一步，所述的應(yīng)用，銅離子源和白皮杉醇在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述的應(yīng)用，銅離子源和白皮杉醇在制備誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的還在于提供一種上述組合物制備的制劑，劑型可以有多種，片劑或膠囊劑或顆粒劑或注射制劑，其使用方便，吸收效率高。

基于包括有效量的銅離子源和白皮杉醇的抗腫瘤的組合物所制備的制劑。

本發(fā)明中，術(shù)語“治療”按照其常規(guī)意義使用，例如出于抗擊、減輕、降低、解除、改善疾病或功能紊亂的癥狀等等目的對(duì)患者進(jìn)行處理或照顧。

本發(fā)明中，所述的腫瘤可以用本發(fā)明所述的組合物進(jìn)行治療而不考慮其所對(duì)應(yīng)的機(jī)制?？梢詫?duì)任何器官的腫瘤進(jìn)行治療，這包括但不限于例如結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肝癌、腎癌、肺癌、睪丸癌、皮膚癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、黑素瘤等等。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述的銅離子源和白皮杉醇的抗腫瘤的組合物并不為先前技術(shù)所知，兩種組分在有效量下的組合在抑制腫瘤細(xì)胞生長及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用，其在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用安全，有效，無副作用，為腫瘤的治療提供了一種新的思路。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

圖1為不同處理、不同處理時(shí)間下Pice、Pice-Cu(II)對(duì)Hela細(xì)胞的生長抑制作用圖。

圖2為Pice、Pice-Cu(II)混合體系處理Hela細(xì)胞48h后的形態(tài)圖。

圖3為不同處理?xiàng)l件下腫瘤細(xì)胞Hela生長曲線圖。

圖4為實(shí)施例4中不同處理的Hela細(xì)胞的熒光Hoechst33342/PI雙染分析結(jié)果圖。

圖5為單獨(dú)銅離子Cu(II)處理后Hela細(xì)胞的Hoechst33342/PI雙染分析結(jié)果圖。

以上圖2-4中，P-Cu即為Pice-Cu(II)處理組，P即為Pice處理組，25P-Cu即表示25μmol/L的Pice-Cu(II)處理組，25P即表示25μmol/L的Pice處理組，以此類推，下同。

以上圖5中，Cu即表示單獨(dú)銅離子處理組，25Cu即表示25μmol/L的單獨(dú)銅離子處理組，50Cu即表示50μmol/L的單獨(dú)銅離子處理組，以此類推。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

如上文所述，本發(fā)明涉及的銅離子源和白皮杉醇的藥物組合，其中白皮杉醇中文別名為3'-羥基白藜蘆醇、比杉特醇、4-[2-(3,5-二羥基苯基)乙烯基]-1,2-苯二酚、(E)-3,3',4,5'-四羥基二苯乙烯、(E)4-[2-(3,5-二羥基苯基)乙烯基]-1,2-苯二酚和(E)-3,3',4,5'-二苯乙烯四醇，研究證實(shí)其具有抗氧化劑、抗炎、抗血栓、防癌、抗癌、抗高血脂癥、抗菌等多方面的活性。

以下實(shí)施例中所采用的試劑及儀器有：Pice(98％，HPLC)購自杭州廣林生物醫(yī)藥有限公司(批號(hào)：091216)，五水硫酸銅購自成都市科龍化工試劑廠，RPMI1640、胎牛血清購于美國Gibco公司。偏振光顯微鏡(Nikon，E100)，酶標(biāo)儀(美國Bio Rad公司)，熒光倒置顯微鏡(Nikon，Ti-U)。

在本發(fā)明實(shí)施例中，以人體宮頸癌細(xì)胞株Hela為例進(jìn)行說明，人體宮頸癌細(xì)胞株Hela培養(yǎng)在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

若無特殊說明，所用實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法；所使用的試劑和材料均可通過商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1 Hela細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)

MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法。

實(shí)驗(yàn)分為3組：(1)對(duì)照組：不加藥；(2)Pice組：加入不同劑量的Pice單藥處理；(3)Pice-Cu(II)組：加入不同劑量的Pice和Cu處理。

在96孔板上按3.4×10³個(gè)/孔接種Hela細(xì)胞，培養(yǎng)36h后加藥，按分組給予相關(guān)處理，Pice組加入Pice的濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L，Pice-Cu(II)組控制Pice與Cu(II)的終濃度均為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)12h、24h、48h、72h，培養(yǎng)終止前4h每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)，37℃繼續(xù)孵育，棄上清 每孔加入150μL二甲基亞砜，震蕩10min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處的OD值，并計(jì)算抑制率和IC₅₀值，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，結(jié)果如圖1和表1所示。

圖1是Pice、Pice-Cu(II)對(duì)Hela細(xì)胞的生長抑制作用曲線圖。圖1結(jié)果表明，Pice與Pice-Cu(II)混合體系對(duì)Hela細(xì)胞的生長均有明顯的抑制作用，且抑制作用隨藥物作用時(shí)間的延長和藥物作用濃度的升高而增強(qiáng)，存在時(shí)間依賴性和濃度依賴性(P＜0.05)。Pice與Pice-Cu(II)混合體對(duì)Hela細(xì)胞的12h、24h、48h、72h半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)如表1所示。由表1可以看出，Pice-Cu(II)混合體對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)明顯低于Pice(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Cu(II)與Pice結(jié)合用于抗腫瘤時(shí)具有協(xié)同效應(yīng)。

表1.Pice、Pice-Cu(II)混合體系對(duì)Hela細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)

實(shí)施例2 不同處理對(duì)腫瘤細(xì)胞生長抑制的光鏡形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)分為3組：(1)對(duì)照組：不加藥；(2)Pice組：加入不同劑量的Pice單藥處理；(3)Pice-Cu(II)組：加入不同劑量的Pice和Cu處理。

在24孔板上按5.0×10⁴個(gè)/孔接種Hela細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，按上述分組：對(duì)照組加入不含藥的培養(yǎng)基；Pice組加入含Pice的培養(yǎng)基，藥物濃度分別為：25、50、100μmol/L；Pice-Cu(II)組加入含藥Pice-Cu(II)的培養(yǎng)基，Pice與Cu(II)的藥物濃度均為：25、50、100μmol/L。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。共同培養(yǎng)48h后，在倒置顯微鏡下觀察Hela的形態(tài)并拍照，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，對(duì)照組Hela細(xì)胞生長良好，基本都貼壁，細(xì)胞飽滿，邊緣清晰，并可融合形成集落。經(jīng)Pice、Pice-Cu(II)處理后，發(fā)現(xiàn)25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L三種濃度下均出現(xiàn)細(xì)胞變圓，體積變小，折光性減弱， 細(xì)胞邊緣變粗糙，貼壁細(xì)胞減少等現(xiàn)象，這些均是細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。藥物濃度越高，作用時(shí)間越長，凋亡現(xiàn)象越明顯。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pice-Cu(II)混合體系各組均表現(xiàn)出比Pice組更強(qiáng)的抗腫瘤效果，100μmol/LPice-Cu(II)混合體系作用兩天后，細(xì)胞多數(shù)脫落，懸浮于培養(yǎng)液中，有少數(shù)細(xì)胞體積變大，細(xì)胞破裂，呈細(xì)胞壞死狀。

實(shí)施例3 不同處理?xiàng)l件下腫瘤細(xì)胞生長曲線的繪制

實(shí)驗(yàn)分為3組：(1)對(duì)照組：不加藥；(2)Pice組：加入不同劑量的Pice單藥處理；(3)Pice-Cu(II)組：加入不同劑量的Pice和Cu處理。

在24孔板上按8.0×10³個(gè)/孔接種Hela細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，按上述分組：對(duì)照組加入不含藥的培養(yǎng)基；Pice組加入含Pice的培養(yǎng)基，藥物濃度分別為：25、50、100μmol/L；Pice-Cu(II)組加入含藥Pice-Cu(II)的培養(yǎng)基，Pice與Cu(II)的藥物濃度均為：25、50、100μmol/L。每組每天設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每次計(jì)數(shù)每組取3孔，每孔計(jì)數(shù)4次，取平均值。加藥后第二天起連續(xù)7天同一時(shí)間計(jì)數(shù)，繪制Hela細(xì)胞的生長曲線。

隨著作用時(shí)間的延長，不同濃度Pice、Pice-Cu(II)混合體系對(duì)腫瘤細(xì)胞Hela生長的影響表現(xiàn)出如圖3所示的趨勢(shì)。從圖中可以看出，與對(duì)照組相比，Pice組與Pice-Cu(II)組的腫瘤細(xì)胞的增值明顯減緩，且濃度越大，細(xì)胞增值減緩越顯著。Pice組中25μmol/L和50μmol/L劑量組從第四天開始，細(xì)胞又有明顯的增值現(xiàn)象，而Pice-Cu(II)混合體系各劑量組在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間內(nèi)沒有出現(xiàn)明顯的增值。這些現(xiàn)象表明Pice與Cu(II)結(jié)合能增強(qiáng)Pice對(duì)腫瘤細(xì)胞Hela生長的抑制作用，也證實(shí)了Pice與Cu(II)結(jié)合的抗腫瘤的可靠性較好。

實(shí)施例4 不同處理Hela細(xì)胞的熒光Hoechst33342/PI雙染分析

實(shí)驗(yàn)分為3組：(1)對(duì)照組：不加藥；(2)Pice組：加入不同劑量的Pice單藥處理；(3)Pice-Cu(II)組：加入不同劑量的Pice和Cu處理。

在24孔板上按5.0×104個(gè)/孔接種Hela細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，按上述分組：對(duì)照組加入不含藥的培養(yǎng)基；Pice組加入含Pice的培養(yǎng)基，藥物濃度分別為：25、50、100μmol/L；Pice-Cu(II)組加入含藥Pice-Cu(II)的培養(yǎng)基，Pice 與Cu(II)的藥物濃度均為：25、50、100μmol/L。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。再共同培養(yǎng)48h后，消化制備單細(xì)胞懸液，進(jìn)行Hoechst33342/PI雙染后于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。Pice、Pice-Cu(II)對(duì)Hela細(xì)胞處理過后的Hoechst33342/PI雙染圖片如圖4所示。

Hoechst33342/PI雙染分析可將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來。從圖4中可以看出，經(jīng)Pice、Pice-Cu(II)處理過的Hela細(xì)胞均表現(xiàn)為明顯的凋亡現(xiàn)象，在Pice-Cu(II)組，當(dāng)加藥濃度為100μmol/L時(shí)，Hela細(xì)胞部分有壞死的情況，而Pice組則沒有死亡的情況，這說明此時(shí)藥物濃度過高導(dǎo)致了Hela細(xì)胞的壞死。

對(duì)比實(shí)施例 單獨(dú)Cu(II)處理Hela細(xì)胞Hoechst33342/PI雙染分析

為了驗(yàn)證是Pice-Cu(II)混合體系而不是Cu(II)的毒性引起的細(xì)胞凋亡，設(shè)置該對(duì)比實(shí)施例進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)Hela細(xì)胞單獨(dú)用Cu(II)進(jìn)行處理，培養(yǎng)基中Cu(II)的濃度仍設(shè)為25、50、100μmol/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在培養(yǎng)基中Cu(II)的濃度為25μmol/L的情況下，體系中的Hela細(xì)胞是以活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞共存的，而在培養(yǎng)基中Cu(II)的濃度為50μmol/L的情況下，細(xì)胞已壞死。這一結(jié)果證實(shí)了是Cu(II)的存在增強(qiáng)了Pice的腫瘤效果，而不是Cu(II)本身引起的細(xì)胞凋亡。

綜合上述MTT實(shí)驗(yàn)、形態(tài)學(xué)檢測(cè)、熒光雙染等手段研究的Cu(II)對(duì)Pice抗腫瘤的增強(qiáng)情況，結(jié)果表明：Pice-Cu(II)對(duì)Hela細(xì)胞的生長抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力均比Pice大，表現(xiàn)為Cu(II)與Pice之間的協(xié)同效應(yīng)，說明Cu(II)的存在確能增強(qiáng)Pice的抗腫瘤效果。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。