本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種circRNA-CER基因的抑制劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，并產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象。雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，被Dicer酶(RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)結(jié)合并切割，形成長度約為20-25bp的產(chǎn)物，且在每條鏈的3’末端有2個核苷酸的小干擾RNA分子(small interference RNA，siRNA)。siRNA的一條鏈摻入到RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，與互補(bǔ)RNA的序列配對。RISC首先介導(dǎo)siRNA雙鏈解旋，然后，與RISC耦合的單鏈的siRNA以序列特異的方式與靶mRNA結(jié)合，之后由RISC的催化組分切割靶mRNA。切割的靶mRNA可以抑制其翻譯，并最終抑制該基因的表達(dá)。可見，siRNA能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，而且已證實其在許多疾病中具有重要的調(diào)控作用，是一種理想的治療靶點和干預(yù)手段。

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)軟骨損傷是由外傷或慢性損傷導(dǎo)致的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。在生物力學(xué)作用下，軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶MMP13(matrix metalloproteinase-13)，該酶尤其會造成軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)的II型膠原(Collagen TypeⅡ，COL2)和聚集蛋白聚糖(AGGRECAN)的降解，從而使得軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)的水平下降，進(jìn)一步加大細(xì)胞外基質(zhì)的合成難度，導(dǎo)致惡性循環(huán)，引起軟骨組織破壞并造成軟骨損傷?？梢姡浌羌?xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的降解是軟骨損傷中主要的病理變化。

因此，開發(fā)一種通過抑制軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解，尤其是通過RNA干擾抑制軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解的方法十分必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明實施例所要解決的技術(shù)問題在于，提供了一種circRNA-CER基因的抑制劑及其應(yīng)用。具體技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明實施例提供了一種抑制劑，所述抑制劑抑制circRNA-CER基因的表達(dá)，以降低所述circRNA-CER基因的表達(dá)產(chǎn)物的水平，所述circRNA-CER基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具體地，作為優(yōu)選，所述抑制劑為siRNA分子，所述siRNA分子的正義鏈的序列如SEQ ID NO:2所示，所述siRNA分子的反義鏈的序列如SEQ ID NO:3所示。

進(jìn)一步地，所述siRNA分子為被修飾的siRNA分子，所述被修飾的siRNA分子使所述circRNA-CER基因的表達(dá)沉默。

具體地，所述修飾為核糖修飾、堿基修飾或磷酸骨架修飾。

進(jìn)一步地，所述siRNA分子的核苷酸被部分替換或增減，核苷酸被部分替換或增減后的siRNA分子使所述circRNA-CER基因的表達(dá)沉默。

第二方面，本發(fā)明實施例提供了一種上述的任意一種抑制劑在制備預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。

第二方面，本發(fā)明實施例提供了一種用于預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的所述的抑制劑。

具體地，作為優(yōu)選，所述藥物組合物還包括與所述抑制劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

具體地，所述藥物組合物的劑型選自溶液劑、懸液劑、乳劑、粉劑、控制釋放劑或持續(xù)釋放制劑。

具體地，所述藥物組合物的給藥方式選自注射給藥或灌注給藥。

本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-CER基因是調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞骨架的重要因子，其表達(dá)會誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變，并促進(jìn)MMP13的產(chǎn)生，導(dǎo)致軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)降解，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨組織損傷。本發(fā)明實施例通過提供一種能抑制circRNA-CER基因表達(dá)的抑制劑，其可以特異性靶向作用于環(huán)狀RNA，能夠阻斷由circRNA-CER基因的表達(dá)而造成的軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)的降解，對于預(yù)防并治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷具有重要的意義。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實施例1提供的分別利用IL-1和TNF-α刺激軟骨細(xì)胞不同的時間后，軟骨細(xì)胞中circRNA-CER基因的相對表達(dá)水平示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例1提供的利用IL-1刺激軟骨細(xì)胞不同的時間后，軟骨細(xì)胞中circRNA-CER基因和MMP13的相對表達(dá)水平示意圖；

圖3是本發(fā)明實施例2提供的陰性對照軟骨細(xì)胞和實驗軟骨細(xì)胞中，COL2、MMP13、Aggrecan的mRNA的表達(dá)水平示意圖；

圖4a是本發(fā)明實施例3提供的陰性對照軟骨細(xì)胞和實驗軟骨細(xì)胞中，MMP13的表達(dá)水平示意圖；

圖4b是本發(fā)明實施例3提供的陰性對照軟骨細(xì)胞和實驗軟骨細(xì)胞中，circRNA-CER的表達(dá)水平示意圖；

圖4c是本發(fā)明實施例3提供的陰性對照軟骨細(xì)胞和實驗軟骨細(xì)胞中，MMP13蛋白的相對表達(dá)水平示意圖；

圖4d是本發(fā)明實施例3提供的陰性對照軟骨細(xì)胞和實驗軟骨細(xì)胞中，COL2蛋白的相對表達(dá)水平示意圖。

具體實施方式

除非另有定義，本發(fā)明實施例所用的所有技術(shù)術(shù)語均具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在對本發(fā)明實施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述之前，對理解本發(fā)明實施例一些術(shù)語給出定義。

(1)本發(fā)明實施例中，所述的“治療有效量”指的是能對人或動物體產(chǎn)生期望的治療功能或治療活性，且可從生理上能被人或動物所接受的量。

(2)本發(fā)明實施例中，所述的“藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料”指的是適用于人或動物，且無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，具有合理的效益/風(fēng)險比的載體和/或輔料。

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的發(fā)生和發(fā)展包括幾個重要病理改變：軟骨組織退變、軟骨下骨硬化、滑膜炎癥和骨贅形成。其中，軟骨組織退變是骨關(guān)節(jié)炎中最初產(chǎn)生，目前治療手段無法逆轉(zhuǎn)，也是最重要的病理改變。軟骨組織大部分由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)組成。軟骨細(xì)胞是軟骨組織中唯一的細(xì)胞類型，其能夠合成及分解細(xì)胞外基質(zhì)。軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)主要由II型膠原(Collagen type II，COL2)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)組成。軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)共同維持關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)以及其細(xì)胞外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)發(fā)生OA時，這種穩(wěn)態(tài)被打破，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的降解、軟骨細(xì)胞的退變等。OA過程中，軟骨細(xì)胞的退變及細(xì)胞外基質(zhì)降解主要分兩個階段：生物合成階段和降解階段。在生物合成階段，軟骨細(xì)胞嘗試去修復(fù)損傷的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。但是，由于合成細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)水平很低，不能有效地合成足夠的細(xì)胞外基質(zhì)。在降解階段，在炎性因子的作用下，軟骨細(xì)胞產(chǎn)生使細(xì)胞外基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP13(matrix metalloproteinase-13)，引起細(xì)胞外基質(zhì)降解。同時，炎性因子還可以引起合成細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)進(jìn)一步下降，細(xì)胞外基質(zhì)的合成更加不足，導(dǎo)致惡性循環(huán)，引起軟骨組織的急劇破壞。因此，細(xì)胞外基質(zhì)合成的不足以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解是OA軟骨損傷中主要的病理變化。

根據(jù)對OA病理過程的研究，為了減緩OA的癥狀，并有效地逆轉(zhuǎn)或中止骨關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明進(jìn)一步研究了在OA的病理過程中起重要作用的基因，circRNA-CER基因是一種調(diào)控軟骨細(xì)胞骨架的重要因子，其表達(dá)會誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促使軟骨細(xì)胞產(chǎn)生MMP13，引起細(xì)胞外基質(zhì)降解。因此，通過阻斷或抑制circRNA-CER基因的表達(dá)將阻斷或減少M(fèi)MP13的表達(dá)并減少軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)的降解。

基于上述，第一方面，本發(fā)明實施例提供了一種抑制劑，該抑制劑能夠抑制circRNA-CER基因的表達(dá)，以降低circRNA-CER基因的表達(dá)產(chǎn)物的水平，具體地circRNA-CER基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具體地，該circRNA-CER基因的核苷酸序列如下：

gttgatatgt cagatctctc tccagaagag caatggaggg tcgagcacgc acgcatgcat 60

gccaagcacc gtggccatga agctatgcat gctgaaatgg tcctcatcct catcgcaacc 120

ttggtggtgg cccagctgct cctggtgcag tggaagcaga ggcacccacg ctcctacaat 180

可見，本發(fā)明實施例通過提供一種能抑制circRNA-CER基因表達(dá)的抑制劑，通過抑制circRNA-CER基因的表達(dá)來維持軟骨細(xì)胞的骨架形態(tài)，抑制該骨架重構(gòu)，并抑制MMP13的表達(dá)，從而阻斷軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)的降解，對于預(yù)防并治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷具有重要的意義。

可以理解的是，對于能夠抑制circRNA-CER基因的表達(dá)或者能與circRNA-CER基因的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合的抑制劑種類沒有特別的限制，只要能實現(xiàn)沉默circRNA-CER基因的表達(dá)或者抑制circRNA-CER基因的促進(jìn)脂質(zhì)生成的功能即可。例如，該能抑制circRNA-CER基因表達(dá)的抑制劑可以包括但不限于小干擾核苷酸、反義寡核苷酸、抗體、活性有機(jī)化合物、以及能有抑制circRNA-CER基因表達(dá)或者能夠與circRNA-CER基因的表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合的其他抑制劑種類。

舉例來說，本發(fā)明實施例中抑制circRNA-CER基因表達(dá)的抑制劑可以為一種或多種反義寡核苷酸，反義寡核苷酸與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中相配對的核苷酸序列具有90％以上的同一性。

進(jìn)一步舉例來說，本發(fā)明實施例中抑制circRNA-CER基因表達(dá)的抑制劑可以為一種或多種抗體，該抗體可以為單克隆抗體或者多克隆抗體，既可以為鼠源性抗體也可以為人源化抗體。從結(jié)構(gòu)上來看，既可以是單鏈抗體也可以為其它抗體類似物，例如其可以包括但不限于核酸適配子等。

更進(jìn)一步舉例來說，本發(fā)明實施例中抑制circRNA-CER基因表達(dá)的抑制劑可以為抑制circRNA-CER基因表達(dá)或者能與circRNA-CER基因的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合的一種或多種活性化合物。

作為一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明實施例中抑制circRNA-CER基因表達(dá)的抑制劑為一種siRNA分子，該siRNA分子的正義鏈的序列如SEQ ID NO:2所示，該siRNA分子的反義鏈的序列如SEQ ID NO:3所示。具體如下所示：

正義鏈(5'-3')5‘CCCACGCUCCUACAAUGUU dTdT 3‘

反義鏈(3'-5')3‘dTdT GGGUGCGAGGAUGUUACAA 5‘

其中，A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，dTdT是siRNA分子的末端懸垂，具有增強(qiáng)siRNA分子穩(wěn)定性的作用。

該siRNA分子的反義鏈能夠與circRNA-CER基因的mRNA結(jié)合，降解該 mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，降低軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)的降解，保護(hù)軟骨細(xì)胞骨架，進(jìn)而抑制MMP13的產(chǎn)生，達(dá)到治療軟骨損傷的目的。

進(jìn)一步地，該siRNA分子為被修飾的siRNA分子，該被修飾的siRNA分子使circRNA-CER基因的表達(dá)沉默。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解得是，由于siRNA分子的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)容易被核酸酶降解，不易被組織吸收。所以，本發(fā)明實施例通過對上述siRNA分子進(jìn)行化學(xué)修飾，被修飾后的siRNA分子首先應(yīng)當(dāng)使circRNA-CER基因的表達(dá)沉默，即具有抑制circRNA-CER基因表達(dá)的能力，此外，該被修飾后的siRNA分子具有增加的穩(wěn)定性，更易于體外操作以及體內(nèi)組織吸收。具體地，上述修飾可以為本領(lǐng)域常用的核糖修飾、堿基修飾或磷酸骨架修飾，或者其它方式的修飾。

或者，該siRNA分子的核苷酸被部分替換或增減，核苷酸被部分替換或增減后的siRNA分子使circRNA-CER基因的表達(dá)沉默，即具有抑制circRNA-CER基因表達(dá)的能力。

第二方面，本發(fā)明實施例提供了上述任意一種抑制劑在制備預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。通過將上述任意一種抑制劑用來制備預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎藥物，能有效預(yù)防或改善骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷癥狀。

第三方面，本發(fā)明實施例提供了一種用于預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的上述任意一種抑制劑。

本發(fā)明實施例提供的藥物組合物中含有治療有效量的上述抑制劑，其能夠抑制circRNA-CER基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制MMP13的表達(dá)，從而用來治療骨關(guān)節(jié)炎及相關(guān)疾病。

具體地，作為優(yōu)選，該藥物組合物還包括與上述抑制劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

當(dāng)上述藥物組合物用于預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎時，其可以單獨使用，也可以與其他可配伍的藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料配合使用。其中，所使用的載體或者輔料為本領(lǐng)域常見的現(xiàn)有技術(shù)。舉例來說，該載體可以為納米顆粒、脂質(zhì)體、膽固醇、殼聚糖及病毒等，而輔料可以為保護(hù)劑、賦形劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等。對載體或者輔料的用量沒有特別的限制，只要能夠使藥物組合物能夠維持和/或增強(qiáng)其預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎的效果即可。

進(jìn)一步地，該藥物組合物的劑型可以為本領(lǐng)域常用的各種藥物劑型，只要 適合于相應(yīng)疾病的給藥，并且恰當(dāng)?shù)乇３謈ircRNA-CER基因抑制劑，尤其是上述抑制circRNA-CER基因表達(dá)的siRNA分子的活性即可。舉例來說，藥物組合物的劑型可以為溶液劑、懸液劑、乳劑、粉劑(例如凍干粉)、控制釋放劑或持續(xù)釋放制劑。

相應(yīng)地，藥物組合物的給藥方式也可以為本領(lǐng)域常用的施藥方式，舉例來說，其可以選自注射給藥(例如，靜脈注射、關(guān)節(jié)腔局部注射或肌肉注射等)或灌注給藥，或者也可以經(jīng)口給藥等。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明實施例中所述的骨關(guān)節(jié)炎可以包括原發(fā)性關(guān)節(jié)炎、繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎、組織工程軟骨或者軟骨細(xì)胞移植治療關(guān)節(jié)軟骨缺損遠(yuǎn)期發(fā)生的骨關(guān)節(jié)炎、或者其它與軟骨損傷相關(guān)的疾病，本發(fā)明實施例在此不作具體的限定。

以下將通過具體實施例進(jìn)一步地描述本發(fā)明。

在以下具體實施例中，所涉及的操作未注明條件者，均按照常規(guī)條件或者制造商建議的條件進(jìn)行。所用原料未注明生產(chǎn)廠商及規(guī)格者均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

其中，以下實施例中，Trizol試劑購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；5×M-MLV Buffer購自Promega公司；TaqDNA聚合酶購自Promega公司；RNA酶抑制劑(RNasin)購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司；dNTP購自Promega公司；Realtime PCR Mater Mix購自TOYOBO公司。

實施例1

步驟1、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞

在無菌條件下，用剪刀將軟骨組織剪碎至小于1cm³大小，并利用含雙抗的PBS緩沖液反復(fù)沖洗。然后，利用10倍于軟骨組織質(zhì)量的量的胰酶在37℃下消化半小時，吸棄酶液。然后利用10倍于軟骨組織質(zhì)量的量的濃度為0.2％(g/ml)Ⅱ型膠原酶的PBS緩沖液在37℃下繼續(xù)攪拌消化4小時，篩網(wǎng)過濾去雜質(zhì)后，將處理后的軟骨組織碎片種植于底面面積為10cm²的新培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為低糖DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、含5％體積濃度的CO₂飽和濕度的CO₂恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

步驟2、利用炎性因子刺激軟骨細(xì)胞

在步驟1中得到的軟骨細(xì)胞中分別加入炎性因子：白細(xì)胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)，并分別刺激4、6和12h，得到不同的炎性軟骨細(xì)胞。

步驟3、軟骨細(xì)胞的RNA的提取

實驗中所用離心管及移液器槍頭經(jīng)高壓處理，烤干后使用；所用水經(jīng)去RNase(核糖核酸酶)處理(加入質(zhì)量濃度為0.1％DEPC處理水劇烈振搖使充分混勻，37℃反應(yīng)，次日高壓除去DEPC(diethypyrocarbonate，焦炭酸二乙酯)；質(zhì)量濃度為75％的乙醇用DEPC處理后的水配制。其余參照Trizol試劑盒說明書操作，具體步驟如下：

3.1、裂解軟骨細(xì)胞：分別將培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞置于60mm規(guī)格的培養(yǎng)皿中，并分別向培養(yǎng)皿中加入1ml的Trizol試劑，用移液器槍頭反復(fù)抽吸后，4℃下靜置20分鐘，得到核蛋白解離的軟骨細(xì)胞。

3.2、液相分離：繼續(xù)向培養(yǎng)皿中加入0.2ml氯仿，搖勻，室溫靜置18分鐘后，于4℃下以12000g的相對離心力離心15分鐘。

3.3、沉淀RNA：將3.1.2中得到的上層水相移入新管，并加入0.5ml的異丙醇，靜置15分鐘。然后于4℃下以12000g的相對離心力離心10分鐘。

3.4、棄去3.3中得到的上清液，并向沉淀中加入1ml質(zhì)量濃度為75％的乙醇，搖勻，于4℃下以10000g的相對離心力離心5分鐘。

3.5、經(jīng)3.4得到的產(chǎn)物放入通風(fēng)櫥中干燥10分鐘，加入適量經(jīng)DEPC處理后的水溶解，得到提取的RNA。

3.6、RNA電泳可見5s、18s及28s的3條帶，且28s帶的亮度是18s帶的1倍，說明所提取的RNA純度較高。

3.7、紫外分光光度計定量：從所提取的RNA中吸取1μl，稀釋至100μl后，利用紫外分光光度計分別測定其在260nm的吸光度(OD260)和280nm波長處的吸光度(OD280)，進(jìn)而檢測得到RNA濃度。結(jié)果顯示，OD260/OD280的比值大于1.8，這說明所提取的RNA較純，無蛋白質(zhì)和DNA殘余。將提取的RNA于80℃下保存。

步驟4、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

4.1、RT–PCR(reverse transcription-PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR)反應(yīng)體系1

反應(yīng)體系1，包括2μl的隨機(jī)引物、2μg的步驟3所提取的RNA、經(jīng)DEPC 處理后的水補(bǔ)足至11μl。以上各成分在EP管中混合均勻，然后對EP管進(jìn)行輕度離心，并放入70℃的水浴鍋中10分鐘。其中，隨機(jī)引物購自Promega公司，目錄號為C1181。

4.2、逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系2

將5μl的M-MLV 5×buffer、2μl的dNTP(10Mm)、0.5μl的RNasin(20-40u/ml)以及0.5μl的M-MLV酶混合均勻，以上各成分在EP管中混合均勻，然后對EP管進(jìn)行輕度離心，并放入42℃的水浴鍋中60分鐘，70℃的水浴鍋中10min。于4℃下放置或貯放在-20℃下備用。

步驟5、Real-time PCR(實時PCR)反應(yīng)

5.1、實時PCR反應(yīng)體系

采用TOYOBO公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒在MX3005P型定量PCR儀上進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。

15μL的總反應(yīng)體系，包括1μl的cDNA模板、7.5μl的SYBR Green Real-time PCR Master Mix、引物1μl、余量為滅菌水。

其中，該引物的序列如下：

forward：5'-CTGGTGCAGTGGAAGCAGAG-3'，

reverse：5'-CGACCCTCCATTGCTCTTCT-3'。

5.2、實時PCR反應(yīng)條件

94℃下變性5分鐘，然后進(jìn)行變性、退火、延伸循環(huán)，條件為94℃下3分鐘變性，94℃下45秒，60℃下30秒，72℃下45秒，共40個循環(huán)，72℃下延伸8分鐘。該實時PCR反應(yīng)在實時定量聚合酶鏈反應(yīng)儀中進(jìn)行。

5.3、計算

實時PCR反應(yīng)結(jié)束后讀數(shù)，計算。用2-ΔΔCt方法分析基因表達(dá)差異。具體方法如下：測定各個樣品Ct(Cycle threshold)值，通過計算2-ΔΔCt來比較不同樣品之間特定基因的表達(dá)差異。檢測COL2、MMP13、Aggrecan的表達(dá)，內(nèi)參為GAPDH。為了減少系統(tǒng)誤差和樣品誤差，每個樣品均設(shè)定三個平行復(fù)孔，同時做目的基因和內(nèi)參基因的PCR；此三個復(fù)孔的平均值作為該樣品的Ct值，然后根據(jù)下面的公式計算出2-ΔΔCt。實驗至少重復(fù)三次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式在柱狀圖中表示實驗結(jié)果。

其中，ΔCt實驗組＝Ct實驗組基因－Ct實驗組內(nèi)參照

ΔCt對照組＝Ct對照組基因－Ct對照組內(nèi)參照

ΔΔCt＝ΔCt實驗組－ΔCt對照組

2-ΔΔCt＝2－(ΔCt實驗組－ΔCt對照組)。

實驗結(jié)果分別如圖1和圖2所示，由圖1可知，隨著IL-1和TNF-α對軟骨細(xì)胞刺激時間的延長，軟骨細(xì)胞中circRNA-CER基因的表達(dá)也隨之增長，這表明炎性因子L-1和TNF-α能夠促進(jìn)circRNA-CER基因的表達(dá)。由圖2可知，隨著IL-1對軟骨細(xì)胞刺激時間的延長，軟骨細(xì)胞中軟骨細(xì)胞中circRNA-CER基因的表達(dá)也隨之增長，而且MMP13的表達(dá)也隨之增長，且兩者增長的趨勢保持一致，這表明了circRNA-CER基因的表達(dá)能夠促進(jìn)MMP13的表達(dá)。綜上所述，本實例驗證了circRNA-CER基因能使軟骨細(xì)胞炎性癥狀加重，進(jìn)而誘發(fā)并加重骨關(guān)節(jié)炎?？梢姡景l(fā)明實施例提供的能夠抑制circRNA-CER基因表達(dá)的抑制劑對于預(yù)防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎具有重要的意義。

實施例2

步驟1、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞：本實施例中軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)過程與實施例1中步驟1的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)過程相同。

步驟2、siRNA分子的體外轉(zhuǎn)染

陰性對照siRNA：所選用的陰性對照siRNA為廣州市銳博生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品號的siN05815122147-1-5的siRNA分子。

實驗siRNA：采用siCatch^TM siRNA design智能設(shè)計靶向circRNA-CER基因的siRNA序列，即能抑制circRNA-CER基因表達(dá)的siRNA序列，其序列如下：

正義鏈(5'-3')5‘CCCACGCUCCUACAAUGUU dTdT 3‘

反義鏈(3'-5')3‘dTdT GGGUGCGAGGAUGUUACAA 5‘

2.1、轉(zhuǎn)染前一天，接種2×10⁵個步驟1中培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度能夠達(dá)到80％的融合度。

2.2、對于每個轉(zhuǎn)染樣品，按如下步驟準(zhǔn)備質(zhì)粒-lipo2000混合液：

2.2.1、稀釋實驗siRNA和陰性對照siRNA：利用250μl不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋的上述各siRNA，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘，得到質(zhì)粒稀釋液。其中，每250μl Opti-MEM培養(yǎng)基所稀釋的siRNA的量是100pmol。

2.2.2、稀釋lipo2000：利用250μl不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋10μl的lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5分鐘，得到lipo2000稀釋液。

2.2.3、將2.2.1得到的質(zhì)粒稀釋液和2.2.2得到的lipo2000稀釋液輕輕混勻，得到混合液并室溫孵育20分鐘(溶液可能會有渾濁，但不會影響轉(zhuǎn)染)。

2.2.4、將2.2.3得到的混合液加入含有步驟1中培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞以及培養(yǎng)液的培養(yǎng)板各孔中，輕輕混勻。

2.2.5、將2.2.4得到的培養(yǎng)板置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24小時(培養(yǎng)4-6小時后，將孔里的培養(yǎng)基移去，更換完全培養(yǎng)基)，得到轉(zhuǎn)染后的實驗軟骨細(xì)胞(轉(zhuǎn)染有實驗siRNA)和陰性對照軟骨細(xì)胞(轉(zhuǎn)染有陰性對照siRNA)。

步驟3、利用與實施例1中相同的方法，對步驟2體外轉(zhuǎn)染后的軟骨細(xì)胞依次進(jìn)行總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、實時PCR反應(yīng)。

實驗結(jié)果如圖3所示，本實施例提供的實驗軟骨細(xì)胞中，由于其轉(zhuǎn)染了本發(fā)明期望的沉默表達(dá)circRNA-CER基因的siRNA分子，有效抑制了circRNA-CER基因的表達(dá)，從而也抑制了MMP13的表達(dá)，使其含量降低，并相應(yīng)地促進(jìn)了COL2和Aggrecan的表達(dá)，使其含量升高，這更利于軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)的合成并抑制該細(xì)胞外基質(zhì)的降解?？梢?，本發(fā)明實施例提供的具有上述序列的siRNA分子能夠用來預(yù)防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷等疾病。

實施例3

本實施例利用Western Blot(蛋白質(zhì)印跡法)檢測實驗軟骨細(xì)胞和陰性對照軟骨細(xì)胞中各個蛋白的表達(dá)水平，具體步驟如下：

步驟1、制備實驗軟骨細(xì)胞和陰性對照軟骨細(xì)胞，其中該實驗軟骨細(xì)胞和陰性對照軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染均與實施例2相同。

步驟2、細(xì)胞總蛋白濃度測定及Western Blot實驗。其中，將從培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中提取的蛋白作為蛋白樣品。通過采用PBS緩沖液沖洗軟骨細(xì)胞中的培養(yǎng)基2次，然后在六孔板中每孔加入200ul質(zhì)量濃度為2％的SDS的蛋白裂解液，即得到蛋白樣品。

2.1、細(xì)胞總蛋白濃度測定

牛血清白蛋白BSA標(biāo)準(zhǔn)品制備及蛋白樣品濃度測定參照Pierce試劑盒(BCA Protein Assay Reagent Kit)說明書，具體步驟如下：

2.1.1、取BSA標(biāo)準(zhǔn)品20ul和蛋白樣品溶液20ul(18ul PBS緩沖液+2ul蛋白樣品)加入96孔板，每個BSA標(biāo)準(zhǔn)品及蛋白樣品溶液均平行重復(fù)3孔。

2.1.2、將試劑盒中A試劑與B試劑按50:1混合，得到混合液。

2.1.3、將2.1.2中的混合液分別加入各BSA標(biāo)準(zhǔn)品及蛋白樣品溶液中，每孔200μl，混勻。

2.1.4、37℃下孵育30分鐘。

2.1.5、以酶標(biāo)儀在562nm測定BSA標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品溶液的吸光度值。

2.1.6、作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蛋白樣品中的蛋白濃度，分裝凍存。

2.2、Western Blot實驗步驟

2.2.1、制膠：安裝垂直電泳板，先后灌注分離膠和濃縮膠，分離膠和濃縮膠配方如表1所示：

表1

其中，以上各成分中，Tris-HCl(Tris(hydroxymethyl)aminomethaneTris-HCl)為三(羥甲基)氨基甲烷；SDS(sodium dodecyl sulfate,sodium salt)是十二烷基硫酸鈉；TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)是N,N,N',N'-四甲基乙二胺。

2.2.2、樣品處理：取蛋白樣品20μg(根據(jù)測出的蛋白濃度計算上樣量)，與1/4上樣量的5×上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘。

2.2.3、上樣：將樣品和蛋白預(yù)染Marker(6μl)依次加入上樣孔，每孔上樣體積均應(yīng)相同，空孔以1×上樣緩沖液補(bǔ)齊體積。

2.2.4、電泳：在濃縮膠以穩(wěn)壓80V進(jìn)行電泳，30-45分鐘，進(jìn)入分離膠后保持恒壓120V，1小時，直到溴酚蘭染料前沿至膠底。

2.2.5、電轉(zhuǎn)：將凝膠移入電轉(zhuǎn)槽，使其處于陰極，PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)處于陽極，凝膠和PVDF膜的兩側(cè)分別是濾紙及海綿，夾緊之后注入電轉(zhuǎn)緩沖液，在冰上以200mA電轉(zhuǎn)2小時。

2.2.6、根據(jù)蛋白預(yù)染Marker觀察電轉(zhuǎn)是否完全。

2.2.7、封閉：將PVDF膜轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度5％脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時。

2.2.8、以1:1000的比例，一抗孵育PVDF膜，4℃孵育過夜或室溫3-4小時。

2.2.9、以1:2000的比例，二抗孵育PVDF膜：以TBST洗滌緩沖液洗膜，10分鐘×3次；然后加入二抗孵育，室溫1.5小時。

2.2.10、化學(xué)發(fā)光：以TBST洗滌緩沖液洗PVDF膜，10分鐘×3次；將ECL化學(xué)發(fā)光劑的A液、B液混合，滴加于PVDF膜上孵育1分鐘，然后用保鮮膜裹好，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光或明場曝光。

結(jié)果如圖4a、4b、4c和4d所示，可見，與陰性對照軟骨細(xì)胞相比，本發(fā)明實施例提供實驗軟骨細(xì)胞中由于轉(zhuǎn)染了抑制circRNA-CER基因表達(dá)的siRNA分子，該siRNA分子能夠抑制MMP13的表達(dá)，并使其含量降低(參見圖4a和4c)，同時促進(jìn)COL2的表達(dá)，并使其含量升高(參見圖4b和4d)，同時這進(jìn)一步說明了本發(fā)明實施例提供的具有如下序列的siRNA分子(其正義鏈為(5'-3')5‘CCCACGCUCCUACAAUGUU dTdT 3‘；其反義鏈為(3'-5')3‘dTdT GGGUGCGAGGAUGUUACAA 5‘)能夠有效用于預(yù)防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎，即能用于制備預(yù)防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。