本發(fā)明關(guān)于一種植物萃取組合物，尤指借由包含特定重量比例的姜黃萃取物與白藜蘆醇的植物萃取物；本發(fā)明更關(guān)于一種包含有前述組合物的醫(yī)藥品，尤指可用于預(yù)防和治療淡化皮膚顏色及黑色素沉淀的醫(yī)藥品；本發(fā)明更關(guān)于一種用途，尤指借由前述醫(yī)藥品用于預(yù)防和治療淡化皮膚顏色及黑色素沉淀的用途。

背景技術(shù)：

皮膚的顏色主要受到黑色素(melanin)含量的多寡而決定，正常而言皮膚中的黑色素可做為人體的自然保護(hù)屏障，黑色素的存在是有助于人類抵抗紫外線輻射、避免光致癌性(photocarcinogenesis)的風(fēng)險(xiǎn)；反之過(guò)量而形成黑色素的沉淀(pigmentation)則會(huì)造成許多的困擾，例如老人斑、雀斑、黑斑、肝斑等皮膚所不需要的色素沉淀，亦或傷口愈合過(guò)程所產(chǎn)生的色素沉淀。黑色素是由存在于表皮層的黑色素細(xì)胞(melanocytes)所生成，并藉由黑色素細(xì)胞的樹突狀構(gòu)造將所形成的黑色素體(melanosome)轉(zhuǎn)移到角質(zhì)細(xì)胞(keratinocytes)中。不同人種之間其黑色素細(xì)胞的數(shù)量差異不大，而主要影響膚色差異的因素也就是黑色素比例、存在于角質(zhì)細(xì)胞中黑色素體的多寡及其分布。

刺激黑色素生成的因素包含直接受到紫外線照射或經(jīng)由角質(zhì)細(xì)胞所分泌的黑色素細(xì)胞刺激激素(α-MSH)作用，進(jìn)而促進(jìn)酪胺酸酶的酵素反應(yīng)而產(chǎn)生黑色素。目前所熟知的黑色素生成機(jī)制是通過(guò)酪胺酸酶(tyrosinase)酵素的作用將酪胺酸(tyrosine)經(jīng)過(guò)多步驟的反應(yīng)轉(zhuǎn)換而成。整個(gè)反應(yīng)的過(guò)程中，每個(gè)步驟都需要酪胺酸酶的參與，首先酪胺酸酶會(huì)把細(xì)胞中的酪胺酸轉(zhuǎn)變成L─多巴(L-DOPA)，再接著將L-DOPA轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-多巴醌(L-dopaquinone)，并持續(xù)經(jīng)酪胺酸酶的作用形成個(gè)階段的中間產(chǎn)物，包含多巴色素(dopachrome)、5,6-二羥基吲哚(5,6-dihydroxyindole)及吲哚-5,6-醌(indole-5,6-quinone)，經(jīng)由一連串的反應(yīng)過(guò)程后最終產(chǎn)生黑色素(melanin)。因此，可將酪胺酸酶視為主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)人類黑 化反應(yīng)(melanization)以及黑色素生成的關(guān)鍵酵素，同時(shí)調(diào)節(jié)酪胺酸酶的活性亦是目前普遍被應(yīng)用在減少黑斑及促進(jìn)皮膚美白的主要研發(fā)方向。此外，皮膚因受傷發(fā)炎而造成的色素沉淀(post-inflammatory hyperpigmentation,PIH)則是另一項(xiàng)促使黑色素生成并轉(zhuǎn)移到角質(zhì)細(xì)胞的原因，一般而言PIH可分為表皮色素沉淀(epidermal PIH)與真皮色素沉淀(dermal PIH)兩類。當(dāng)在表皮層發(fā)生發(fā)炎反應(yīng)時(shí)，花生四烯酸(arachidonic acid)分別受到環(huán)氧酵素(cyclooxygenase)、脂肪氧化酵素(lipoxygenase)的作用而生成前列腺素(prostaglandins E2,PGE2)、白三烯素(leukotriene,LTC4)，而黑色素細(xì)胞受到此類的發(fā)炎因子刺激后，會(huì)促進(jìn)黑色素的大量生成并轉(zhuǎn)移到周邊的角質(zhì)細(xì)胞中。另一方面，當(dāng)位于表皮與真皮交界處的基底層(basal cell layer)受到發(fā)炎反應(yīng)的破壞時(shí)，大量的黑色素會(huì)受到真皮層的巨噬細(xì)胞所吞食(melanophages)，因而產(chǎn)生較深層的暗棕色或藍(lán)灰色沉淀。在生活中例如青春痘、水痘、帶狀泡疹、皮膚炎或任何因傷口而造成的皮膚發(fā)炎反應(yīng)，都可能會(huì)是造成PIH的產(chǎn)生原因。

目前被用于抑制黑色素生成或是淡化黑色素的美白成分，包含維生素C磷酸鎂鹽(magnesium ascorbyl phosphate)、維生素C磷酸鈉鹽(sodium ascorbyl phosphate)、維生素C醣苷(ascorbyl glucoside)、曲酸(kojic acid)、熊果素(arbutin)、鞣花酸(ellagic acid)、洋甘菊精(chamomile ET)、二丙基聯(lián)苯二醇(5,5'-dipropyl-biphenyl-2,2'-diol)、傳明酸(tranexamic acid)、甲氧基水楊酸鉀(potassium methoxysalicylate)以及對(duì)苯二酚(hydroquinone)等許多成份被提出可用以抑制黑色素形成或減少皮膚黑色素沈淀或淡化膚色。

維生素C的金屬鹽類與醣化衍生物都是藉由抗氧化的方式，在酪胺酸酶的反應(yīng)過(guò)程中將黑色素的中間產(chǎn)物L(fēng)-dopaquinone進(jìn)行還原，達(dá)到抑制黑色素生成的效果，維生素C本身安全性高且可以防止自由基的形成，但安定性不佳極易被氧化，因此，通過(guò)與金屬結(jié)合或醣化作用可以增加其穩(wěn)定性，這類成分包含維生素C磷酸鎂鹽、維生素C磷酸鈉鹽、維生素C醣苷。因?yàn)槔野匪崦甘且环N以二價(jià)銅離子為活性中心的氧化酵素，因此會(huì)與銅離子結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)構(gòu)也被開發(fā)用于抑制酪胺酸酵素，進(jìn)而阻斷黑色素生成，這類的代表物質(zhì)為曲酸。曲酸是藉由本身的結(jié)構(gòu)與酪胺酸酶的銅離子結(jié)合使其酵素活性降低，進(jìn)而影響酪胺酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-DOPA及L-dopaquinone的反應(yīng)過(guò)程。另外一類是競(jìng)爭(zhēng)取代酪胺酸酶的作用受質(zhì)，例如熊果素，這類物質(zhì)可以與酪胺酸競(jìng)爭(zhēng)，使酪胺酸酶的 作用受質(zhì)減少?；蛘呃脤?duì)苯二甲酚所產(chǎn)生的自由基直接黑色素細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，但不當(dāng)使用可能會(huì)造成皮膚刺激、皮膚炎、異常的色素沉淀及皮膚反黑等副作用，而對(duì)苯二甲酚也已被列為藥用成分在化妝品中不得添加，藥用的含量也不得超過(guò)5％。

各成分通過(guò)不同的機(jī)制達(dá)到美白的效果，也藉由不同的機(jī)制達(dá)到淡化膚色的目的，然而在美白的機(jī)制方面不外乎包含阻斷酪胺酸酶來(lái)減少黑色素的生成、阻斷黑色素體自黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角質(zhì)細(xì)胞、抑制酪胺酸酶的活性、促進(jìn)黑色素在角質(zhì)細(xì)胞的代謝或使用預(yù)防性的方式隔離紫外線。過(guò)去亦有使用各種成分，如維生素C、傳明酸、維生素B群等，以靜脈注射的方式企圖達(dá)到去斑或美白效果的治療手段，然而這樣的給藥方式及美白用途，并未在任何一個(gè)國(guó)家合法上市，且其美白效果并不明顯，也可能會(huì)有過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)。另外，若是其產(chǎn)品滅菌不完全或注射時(shí)消毒不完全，更會(huì)有極高的風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生靜脈炎、蜂窩性組織炎、敗血癥等嚴(yán)重的副作用。

雖然過(guò)去市場(chǎng)上對(duì)于美白相關(guān)的產(chǎn)品開發(fā)不曾間斷，但消費(fèi)者對(duì)于去斑及膚色淡化的需求始終不曾停止，且美白相關(guān)的技術(shù)或產(chǎn)品市場(chǎng)亦日漸增加，然而目前所使用的各式成份在淡化或去除黑色素上的效果卻仍有更上層樓的空間。因此尋找更安全并且具有抑制黑色素的活性成分更是目前廣大的醫(yī)學(xué)美容市場(chǎng)上引頸期盼且不可或缺的。

另外，過(guò)去在開發(fā)美白相關(guān)應(yīng)用的成分或產(chǎn)品時(shí)，大部分實(shí)驗(yàn)會(huì)先添加藥物后，再給予α-MSH刺激黑色素生成，然后去比較添加藥物組別的黑色素抑制效果；或是僅進(jìn)行體外試管反應(yīng)，直接將藥物和酪胺酸混合，再添加酪胺酸脢去比較其活性抑制的程度；這樣的作法因?yàn)榕c體內(nèi)實(shí)際產(chǎn)生黑色素的情況先后順序不同，因此即使實(shí)驗(yàn)效果不錯(cuò)，后續(xù)實(shí)際應(yīng)用于美白產(chǎn)品后的美白療效往往遠(yuǎn)不如預(yù)期。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于抑制酪胺酸酶并減少或預(yù)防黑色素生成的植物萃取組合物、其醫(yī)藥品及應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)并未有安全且具有抑制黑色素的活性成分以及現(xiàn)有技術(shù)的試驗(yàn)方法都為先給藥再刺激黑色素生成，而與體內(nèi)實(shí)際產(chǎn)生黑色素的情況先后順序不同的問(wèn)題。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提出一種用于抑制酪胺酸酶并減少或預(yù)防黑色素生成的植物萃取組合物，含有姜黃萃取物與白藜蘆醇，可用于抑制酪胺酸酶的酵素活性并減少或預(yù)防黑色素生成，其中姜黃萃取物與白藜蘆醇的重量比例為4:1至1:4。

較佳的，所述的姜黃萃取物與白藜蘆醇的重量比例為3：2。

依據(jù)本發(fā)明，「姜黃萃取物」于此處指包含姜黃素的萃取物，其中姜黃素占姜黃萃取物的濃度為85％至100％。

本發(fā)明更提供一種用于淡化皮膚顏色以及預(yù)防及減少黑色素沉淀的醫(yī)藥品，其中醫(yī)藥品包含前述用于抑制酪胺酸酶并減少或預(yù)防黑色素生成的有效劑量的植物萃取組合物以及其醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。

依據(jù)本發(fā)明，「有效劑量」是指在劑量上及對(duì)于所需要的時(shí)間而言對(duì)達(dá)成所要抑制酪胺酸酶活性及抑制黑色素生成有效的量；其如本發(fā)明所例示者，有效抑制酪胺酸酶活性及抑制黑色素生成劑量可通過(guò)抑制黑色素生成實(shí)驗(yàn)及抑制酪胺酸酶活性試驗(yàn)而得知。

依據(jù)本發(fā)明，所述的醫(yī)藥品可用現(xiàn)有技術(shù)水準(zhǔn)中已習(xí)知的方法，利用已知的賦形劑，如黏合劑、崩散劑、分散劑、充填劑、安定劑、稀釋劑及染劑加以制造。較佳的，所述的「醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑」包括生理上兼容人體的任意及所有溶劑、分散介質(zhì)、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延緩劑及其類似物。藥學(xué)上可接受的載劑的實(shí)例包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物的一或多種及其組合。在許多情況中，較佳的組合物包括等張劑，例如糖、諸如甘露醇、山梨糖醇的多元醇或氯化鈉。藥學(xué)上可接受的載劑可進(jìn)一步包含微量輔助物質(zhì)，諸如濕潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。

本發(fā)明所述的醫(yī)藥品可以多種形式存在，該等形式包括，但不限于液體、半固體及固體藥劑形式，其中液體溶液(例如可注射及可輸注溶液)包括分散液或懸浮液；固體藥劑包括，但不限于錠劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體及栓劑。較佳的形式取決于預(yù)期的投藥模式及治療應(yīng)用；較佳的，本發(fā)明所述的醫(yī)藥品的劑型是口服、輸注溶液或局部外用制劑形式。更佳的，本發(fā)明的醫(yī)藥品系被制造成適合于皮下注射劑或輸注溶液，且系以皮下注射或靜脈注射方式予以施用。更佳的，本發(fā)明的醫(yī)藥品被制造成適合于局部地施用于皮膚上的外用制劑 (external preparation)，其劑型包括，但不限于：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)以及油膏(salve)。

更佳的，本發(fā)明所述的醫(yī)藥品作為外部制劑時(shí)，可使用添加劑，其添加劑包括，但不限于水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳?xì)浠衔?hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強(qiáng)劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如微結(jié)晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調(diào)整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強(qiáng)劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進(jìn)劑(propellants)；添加劑的種類選用及用量是本領(lǐng)域熟悉技術(shù)人士的例行技術(shù)范疇內(nèi)。

本發(fā)明更提供一種前述植物萃取組合物在制備淡化皮膚顏色及預(yù)防和治療黑色素沉淀的醫(yī)藥品中的應(yīng)用。

并且，本發(fā)明更提供一種用于淡化皮膚顏色以及預(yù)防及治療黑色素沉淀的醫(yī)藥品在淡化皮膚顏色以及減少及治療黑色素沉淀中的應(yīng)用。

較佳的，其是將包含有植物萃取組合物的醫(yī)藥品以有效劑量施予受體局部部位，以使受體局部部位達(dá)到皮膚顏色淡化及減少黑色素沉淀的效果，所述的受體包括但不限于動(dòng)物或人類。

較佳的，所述的施予方式包括，但不限于口服施予、局部注射施予或外用涂抹。

較佳的，所述的將醫(yī)藥品以口服方式施予受體的有效劑量系介于受體每公斤1毫克(mg/KG)至50mg/KG。

較佳的，所述的將醫(yī)藥品以局部注射或靜脈注射給藥施予受體的有效劑量系介于0.01mg/KG至2mg/KG。

較佳的，所述的將醫(yī)藥品以外用涂抹方式施予受體的有效劑量的濃度系介于0.01％至10％。

本發(fā)明所述的植物萃取組合物經(jīng)媒劑調(diào)配后更可制成皮膚護(hù)理品或化妝品以供外用涂抹；較佳的，媒劑包括，但不限于乳液(例如水包油及油包水乳液)、乳霜(cream)、化妝水(lotion)、溶液(例如水性溶液或水－酒精溶液)、無(wú)水基劑(例如唇膏或粉劑)、泡沫體、凝膠、水凝霜、面膜片體、噴霧劑及膏劑。

本發(fā)明所述的植物萃取組合物及包含其植物萃取組合物的醫(yī)藥品可用于皮膚顏色淡化及黑色素沉淀的預(yù)防和治療，且包含，但不限于不期望的色素沉淀和異常的色素沉淀，例如老人斑、肝斑、雀斑、發(fā)炎或創(chuàng)傷所造成的過(guò)度色素沉淀、日曬后的色素沉淀等。且本發(fā)明所使用的植物萃取組合物成分安全性高，經(jīng)由實(shí)施例證明不會(huì)對(duì)細(xì)胞存活率產(chǎn)生影響，而本發(fā)明所述的植物萃取組合物即使在先使用α-MSH刺激黑色素生成后再給藥的狀況下，仍然能有效的降低黑色素的含量，在此模式下更可反映出皮膚已受到刺激而產(chǎn)生黑色素沉淀的皮膚狀況。本發(fā)明的植物萃取組合物包含有特定重量比例的姜黃萃取物與白藜蘆醇，即使在已誘導(dǎo)黑色素生成的情況下，仍可顯著抑制酪胺酸酶的酵素活性，以達(dá)成減少或預(yù)防黑色素生成的效果，因此，在使用本發(fā)明的植物萃取組合物后可以有效減少黑色素達(dá)到淡化膚色或去斑的效果。

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

附圖說(shuō)明

圖1是以熊果素(arbutin)、白藜蘆醇(resveratrol)、姜黃素(curcumin)以及本發(fā)明所述的組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7相較于控制組(DMEM)對(duì)于小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的細(xì)胞存活率分析柱狀圖。

圖2A是以熊果素、白藜蘆醇、姜黃素以及本發(fā)明所述的組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7相較于控制組(α-MSH)對(duì)于小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的黑色素生成量比較的柱狀圖；

圖2B是以熊果素、白藜蘆醇、姜黃素以及本發(fā)明所述的組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7對(duì)于小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的黑色素生成抑制率的柱狀圖。

圖3A是以熊果素、白藜蘆醇、姜黃素以及本發(fā)明所述的組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7相較于控制組(α-MSH)對(duì)于小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的酪胺酸酶活性比較的柱狀圖；

圖3B是以熊果素、白藜蘆醇、姜黃素以及本發(fā)明所述的組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7對(duì)于小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的酪胺酸酶活性抑制率的柱狀圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明將由下列的實(shí)施例做為進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明前面所揭示的內(nèi)容。本領(lǐng)域技術(shù)人員，可以做些許的改良與修飾，但不脫離本發(fā)明的范疇。

本發(fā)明所述的組合物的各成分的重量比例：

組合物AW-001-C2姜黃萃取物:白藜蘆醇＝4:1

組合物AW-001-C3姜黃萃取物:白藜蘆醇＝1:4

組合物AW-001-C5姜黃萃取物:白藜蘆醇:槲黃素＝2:0:3

組合物AW-001-C7姜黃萃取物:白藜蘆醇＝3:2

實(shí)施例1.細(xì)胞存活率測(cè)試

本實(shí)施例的目的為確認(rèn)植物萃取物及發(fā)明組合物添加后對(duì)細(xì)胞存活的影響。本實(shí)施例使用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10，試驗(yàn)組別共8組，分別為控制組(DMEM)、熊果素(arbutin)、白藜蘆醇(resveratrol)、姜黃素(curcumin)以及本發(fā)明所述的組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7，每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3重復(fù)，并以流式細(xì)胞儀進(jìn)行存活率分析。

將1x105顆細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞盤(6well plate)，培養(yǎng)24小時(shí)后分別添加濃度為250ppm熊果素、濃度為6ppm白藜蘆醇、濃度為8ppm姜黃素以及濃度分別為8ppm的組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7處理細(xì)胞48小時(shí)，再以Trypsin-EDTA將細(xì)胞收集下來(lái)并計(jì)數(shù)5x105顆細(xì)胞放入流式管(flow tube)中。離心去除上清液，并以PBS重復(fù)清洗兩次后藉由碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色，并以流式細(xì)胞儀收集10000顆細(xì)胞分析PI表現(xiàn)量。

圖1結(jié)果顯示經(jīng)上述各組處理小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10后并不會(huì)影響 B16-F10細(xì)胞的存活率，單一植物萃取物或本發(fā)明組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7的細(xì)胞存活率與控制組相比，在統(tǒng)計(jì)上皆無(wú)顯著差異。表示本發(fā)明組合物或單一植物萃取物皆不會(huì)造成黑色素細(xì)胞死亡。

實(shí)施例2.抑制黑色素生成實(shí)驗(yàn)(先誘導(dǎo)黑色素生成再給藥)

本實(shí)施例比較單一植物萃取物及本發(fā)明所述的植物萃取組合物對(duì)于抑制黑色素生成的能力，本實(shí)施例使用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10，試驗(yàn)組別共8組，分別為控制組(α-MSH)、熊果素、白藜蘆醇、姜黃素以及本發(fā)明組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7，每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3重復(fù)，量測(cè)各組的黑色素含量。

將2x105顆細(xì)胞接種于6well plate，培養(yǎng)24小時(shí)后加入每毫升10奈克(ng/ml)α-MSH作用30分鐘后，除控制組外，各組再分別添加濃度為250ppm熊果素、濃度為6ppm白藜蘆醇、濃度為8ppm姜黃素以及濃度分別為8ppm的AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7培養(yǎng)48小時(shí)，之后于20℃以120g離心5分鐘收取細(xì)胞，并將細(xì)胞回溶于濃度為1N氫氧化鈉(NaOH)(含10％DMSO)，均勻充分混合后將樣品至于加熱盤以80℃加熱1.5小時(shí)，待樣品冷卻后以多功能微孔盤分析儀(M2e Multimode Microplate Reader)于波長(zhǎng)475納米(nm)量測(cè)吸光值并計(jì)算黑色素的生成抑制率。

由圖2結(jié)果可觀察到黑色素含量在各試驗(yàn)組別中都受到抑制，單一植物萃取物對(duì)抑制黑色素雖有影響，但本發(fā)明組合物AW-001-C2或AW-001-C7對(duì)于黑色素生成的抑制效果可達(dá)到顯著優(yōu)于單一植物萃取物白藜蘆醇或姜黃素的抑制效果，且其抑制效果亦顯著優(yōu)于熊果素。在本發(fā)明組合物中，組合物AW-001-C2、AW-001-C3與AW-001-C7皆能有效的減少黑色素生成；相較于控制組，組合物AW-001-C2、AW-001-C3與AW-001-C7減少黑色素生成的比率分別為63.5％、24.2％及56.1％，其中組合物AW-001-C5對(duì)黑色素抑制并沒(méi)有影響，與控制組相比沒(méi)有差異，而控制組AW-001-C2及AW-001-C7對(duì)黑色素抑制的效果最佳，且其抑制效果優(yōu)于濃度為250ppm的熊果素。換算各組別對(duì)黑色素的抑制率后，可推算組合物AW-001-C2及AW-001-C7與常見的美白成分熊果素相比，在相同濃度時(shí)組合物AW-001-C2及AW-001-C7對(duì)黑色素的抑制率優(yōu)于熊果素76.2倍及68.7倍。

實(shí)施例3.抑制酪胺酸酶活性實(shí)驗(yàn)(先誘導(dǎo)黑色素生成再給藥)

本實(shí)施例藉由量測(cè)L-DOPA轉(zhuǎn)變成dopaquinone的量，加以評(píng)估并比較單一植物萃取物及不同的發(fā)明組合物抑制酪胺酸酶活性的能力。本實(shí)施例使用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10并分為8組，分別為控制組(α-MSH)、熊果素、白藜蘆醇、姜黃素以及本發(fā)明組合物AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5及AW-001-C7，量測(cè)各組的酪胺酸梅的酵素活性。

將2x105顆細(xì)胞接種于6well plate，培養(yǎng)24小時(shí)后加入10ng/mlα-MSH作用30分鐘后，除控制組外，各組再分別添加濃度為250ppm熊果素、濃度為6ppm白藜蘆醇、濃度為8ppm姜黃素以及濃度分別為8ppm AW-001-C2、AW-001-C3、AW-001-C5、AW-001-C7培養(yǎng)48小時(shí)，之后以Trypsin-EDTA將細(xì)胞收集下并以PBS清洗，并以含有1％Triton X-100和0.1毫莫耳濃度(mM)苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF)的0.1莫耳濃度(M)PBS(pH 7.0)萃取細(xì)胞中的酪胺酸酶蛋白，并加以定量，定量后取30微克(μg)與每毫升0.4毫克(mg/ml)的L-DOPA混合，以微孔盤分析儀于波長(zhǎng)405nm量測(cè)吸光值的變化，測(cè)定1小時(shí)每10分鐘記錄1次吸光值。

圖3結(jié)果顯示，于第60分鐘時(shí)的酪胺酸酶活性，與控制組相比，熊果素、白藜蘆醇或姜黃素及本發(fā)明組合物AW-001-C2、AW-001-C3與AW-001-C7皆有減少酪胺酸酶活性的效果；而相較之下本發(fā)明組合物抑制酪胺酸酶活性的能力更顯著優(yōu)于單一植物萃取物白藜蘆醇或姜黃素，亦顯著優(yōu)于熊果素；本發(fā)明組合物AW-001-C2、AW-001-C3與AW-001-C7相較于控制組，其抑制酵素活性的比率分別為42.2％、24.7％及39.1％，而其中組合物AW-001-C5對(duì)酪胺酸酶活性并沒(méi)有影響，與控制組相比沒(méi)有差異，而組合物AW-001-C2及AW-001-C7對(duì)酵素活性的抑制效果最佳。換算各組在相同濃度對(duì)于酪胺酸酶活性的抑制率后，可發(fā)現(xiàn)組合物AW-001-C2及AW-001-C7與常見的美白成分熊果素同劑量相比，AW-001-C2及AW-001-C7對(duì)于酪胺酸酶活性的抑制率優(yōu)于熊果素45.6倍及37.4倍，本結(jié)果也與實(shí)施例2所述的黑色素生成抑制試驗(yàn)中所觀察到的趨勢(shì)具一致性。

當(dāng)然，本發(fā)明還可有其它多種實(shí)施例，在不背離本發(fā)明精神及其實(shí)質(zhì)的情況下，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明作出各種相應(yīng)的改變和變形，但這些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。