本發(fā)明涉及連翹苷元的一種醫(yī)藥用途，具體涉及連翹苷元在制備治療自身免疫性肝炎藥物中的用途，屬于醫(yī)藥領域。
背景技術(shù)：
：自身免疫性肝炎是一種特異或非特異性自身抗原表達所引起的肝組織損傷，是一種病因不明的肝臟慢性炎癥性疾病。本病的臨床特點是肝功能損害、血漿免疫球蛋白增高、血循環(huán)中存在多種自身抗體等，但自身免疫性肝炎與其它肝臟病如原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)等自身免疫性肝病在臨床表現(xiàn)、生化、免疫及組織學變化等方面常常有交叉重疊，使得自身免疫性肝炎的臨床診斷和治療相當困難。1992年召開的國際自身免疫性肝炎會議，制定了有關(guān)AIH的診斷標準：①高丙種球蛋白血癥；②特異性自身抗體；③女性易患；④免疫抑制劑治療有效；⑤相關(guān)的背景是HLA-DR3或DR4；⑥除外嗜肝病毒感染引起的肝臟疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學一般常把免疫抑制劑作為AIH的首選治療藥物，臨床運用后能使AIH緩解，癥狀改善，肝功能恢復，并減輕肝臟組織學損害，延緩病情進展至肝硬化，預防嚴重肝病并發(fā)癥的發(fā)生，最終降低病死率。其中潑尼松(龍)單一治療或加用硫唑嘌呤聯(lián)合治療已被廣泛采用，并已公認為是AIH的標準治療[3]。但免疫抑制劑有較多的副作用，長期應用尤為明顯，所以，在治療過程中應注意定期復查，預防并發(fā)癥，以保證治療的順利進行。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫、降酶、退黃、防治肝纖維化方面有良好的作用，具有多層次、多靶點、多途徑的整體調(diào)控和綜合療效優(yōu)勢。在臨床實踐中對激素治療無效或不能耐受激素治療的AIH患者采用中醫(yī)藥治療，取得了較好的療效。連翹為我國傳統(tǒng)中草藥，其味苦，性涼主治膽汁擴散引起的目、身發(fā)黃，協(xié)日熱宿于五臟，腸刺痛，血協(xié)日性腹瀉等癥，現(xiàn)代植物化學研究顯示，其果實中含木脂體類化合物：連翹苷(forsythin，phillyriy)，連翹苷元(Phillygenin)，右旋松脂酚(pipores-inol)；黃酮類化合物：蕓香苷(rutin)；苯乙烷類衍生物：連翹酯苷(forsythoside)A、C、D、E，毛柳苷(salidroside)；乙基環(huán)己醇類衍生物：梾木苷(cornoside)，連翹環(huán)己醇(rengyol)，異連翹環(huán)己醇(sorengyol)，連翹環(huán)已醇氧化物(renyoxide)，連翹環(huán)己醇酮(rengydone)，連翹環(huán)己醇苷(rengyoside)A、B、C；三萜類化合物：白樺脂酸(betulinicacid)，齊墩果酸(oleanolicacid)，熊果酸(ursolicacid)。藥理學研究顯示，其具有多種藥理活性，其水煎劑具有顯著的抗肝損傷，抗炎解熱作用，鎮(zhèn)吐以及抗病原微生物作用，連翹苷及連翹苷元靜脈注射后還具有明顯的降壓作用。發(fā)表于2014年6月的《連翹酯苷A抗LPS介導大鼠類風濕性關(guān)節(jié)炎機制研究》一文中公開了連翹酯苷A可降低LPS刺激類風濕性關(guān)節(jié)炎組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、抑制炎癥因子IL-1β和IL-17蛋白翻譯，影響抗氧化酶及自由基含量，最終發(fā)揮抗炎功效。發(fā)表于2015年2月的《連翹苷元對大鼠免疫性肝纖維化的影響》證實了連翹苷元能夠顯著降低肝纖維化大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C和PCⅢ的量，減少肝臟質(zhì)量和肝臟系數(shù)，降低肝臟Hyp水平，減輕肝纖維化程度。專利申請201410210996公開了連翹苷元用于制備預防或治療肝損傷或肝衰竭藥物的用途，動物試驗顯示,其對于對乙酰氨基酚導致的肝損傷，對于抗腫瘤藥物順鉑導致的肝損傷，四氯化碳導致的急慢性肝損傷，D-氨基半乳糖導致的肝損傷，以及D-氨基半乳糖和脂多糖導致的肝衰竭均具有很好的治療效果。以上文獻表明，連翹苷元在抗炎和修復肝臟損傷等方面具有一定的效果，但由于自身免疫性肝炎和常規(guī)肝病相比，其發(fā)病多起因與免疫分子的紊亂，藥物治療多與與免疫抑制相關(guān)。技術(shù)實現(xiàn)要素：現(xiàn)有技術(shù)中雖然連翹苷元或連翹可以用于肝損傷或抗炎的治療，但自身免疫性肝炎不同于常規(guī)肝病，其主要與免疫系統(tǒng)紊亂相關(guān)，目前尚缺乏安全有效的治療手段，現(xiàn)有的免疫抑制劑雖然具有一定的治療效果，但其副作用較大，嚴重影響著疾病的治療效果和患者的用藥依從率。基于此，本發(fā)明旨在提供一種自身免疫性肝炎治療藥物，其以連翹苷元為主要活性成分，其用于自身免疫性肝炎的治療時具有療效確切，不良反應低的特點，動物實驗顯示，其能夠顯著升高白細胞介素2和γ-干擾素水平，并能顯著降低白細胞介素4和白細胞介素6的水平，適合制備成臨床自身免疫性肝炎治療藥物。本發(fā)明涉及連翹苷元的一種新的醫(yī)藥用途，即連翹苷元在制備治療自身免疫性肝炎藥物中的用途。連翹苷元Phillygenin，其分子式為：C21H24O6，其結(jié)構(gòu)式為：作為本發(fā)明的一種實施方式，連翹苷元能夠糾正自身免疫性肝炎患者的免疫細胞因子紊亂，具體地，其能夠顯著升高自身免疫性肝炎患者的白細胞介素2和γ-干擾素水平，并能顯著降低自身免疫性肝炎患者的白細胞介素4和白細胞介素6的水平。本發(fā)明藥效實施例9證明連翹苷元可以調(diào)節(jié)自身免疫性肝炎大鼠的細胞因子之間的紊亂，具體表現(xiàn)為能夠顯著升高白細胞介素2和γ-干擾素水平，并能顯著降低白細胞介素4和白細胞介素6的水平，從而從根源上治療自身免疫性肝炎。作為本發(fā)明的另一種實施方式，連翹苷元能夠降低自身免疫性肝炎患者的轉(zhuǎn)氨酶的含量和肝臟指數(shù)。本發(fā)明藥效實施例10證明連翹苷元可以降低自身免疫性肝炎大鼠的轉(zhuǎn)氨酶的含量和肝臟指數(shù)，從而對起到顯著的治療和預防效果，其藥物治療療效顯著優(yōu)于現(xiàn)有治療藥物潑尼松。由此可以看出，連翹苷元不僅可以針對自身免疫性肝炎的發(fā)病原因進行糾正，更能顯著降低患者的轉(zhuǎn)氨酶的含量和肝臟指數(shù)，從而對自身免疫性肝炎起到標本兼治的效果。本發(fā)明還提供適用于上述用途的包含連翹苷元的藥物制劑，所述包含連翹苷元的藥物制劑為其口服制劑或注射制劑，其中所述的口服制劑為其片劑、膠囊劑、或微乳，所述的注射制劑為其注射液，其由連翹苷元和藥用輔料組成，所述的藥物輔料可以為乙醇、丙二醇、PEG400、PEG600、吐溫80中的一種或多種。本發(fā)明所述的連翹苷元的藥物制劑中每一制劑單位中含有連翹苷元的含量為0.1mg-200mg，所述連翹苷元的注射制劑優(yōu)選為每一制劑單位含有連翹苷元5mg、10mg、20mg三個規(guī)格的注射劑。本發(fā)明所述的注射劑的給藥方式優(yōu)選為皮下注射給藥，注射部位可以為人體或動物體的任意皮膚部位，優(yōu)選為上臂、腹部、或腿部的皮膚下面。本發(fā)明所述的連翹苷元的藥物用途及其制劑，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下技術(shù)優(yōu)勢：1)本發(fā)明所述的連翹苷元用于自身免疫性肝炎治療時療效確切，不僅可以降低肝臟轉(zhuǎn)氨酶含量和肝臟指數(shù)，更能調(diào)節(jié)淋巴細胞細胞因子之間的失衡，降低對肝組織的損傷，起到標本兼治的效果。本發(fā)明藥效實施例9證明連翹苷元可以調(diào)節(jié)自身免疫性肝炎大鼠的細胞因子之間的紊亂，具體表現(xiàn)為能夠顯著升高白細胞介素2和γ-干擾素水平，并能顯著降低白細胞介素4和白細胞介素6的水平，從而從根源上治療自身免疫性肝炎。本發(fā)明藥效實施例10證明連翹苷元可以降低自身免疫性肝炎大鼠的轉(zhuǎn)氨酶的含量和肝臟指數(shù)，從而對起到顯著的治療和預防效果，其藥物治療療效顯著優(yōu)于現(xiàn)有治療藥物潑尼松。2)連翹苷元為從傳統(tǒng)中藥連翹中提取的天然藥物單體，不僅療效確切，而且毒副作用很低，可以顯著提高患者的用藥依從性和提高藥物的治療效果。3)連翹苷元用于預防或治療自身免疫性肝炎時價格低廉，質(zhì)量控制簡單方便，與現(xiàn)有的生物制劑相比成本低，可大幅度降低自身免疫性肝炎患者的治療費用。具體實施方式以下通過具體實施例進一步說明本發(fā)明的
發(fā)明內(nèi)容，但應該理解，本發(fā)明實施例并不以任何方式限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明基礎上作出的等同替代均落入本發(fā)明請求專利保護的范圍。實施例1連翹苷元注射液制備工藝：將處方量的丙二醇和乙醇混合均勻，加入連翹苷元，攪拌溶解，加入處方量的0.9％氯化鈉溶液，攪拌均勻，加入0.5％針用活性炭攪拌脫炭后分裝即得。實施例2連翹苷元注射液制備工藝：將處方量的PEG-400與乙醇混合，加入連翹苷元，攪拌溶解后加入0.9％氯化鈉溶液至10000ml，攪拌均勻，加入0.5％針用活性炭攪拌脫炭后分裝即得。實施例3連翹苷元注射液制備工藝：將處方量的乙醇和吐溫-80混合均勻，加入連翹苷元，攪拌溶解，加入注射用水至10000ml，攪拌均勻，加入0.5％針用活性炭攪拌脫炭后分裝即得。實施例4連翹苷元注射液制備工藝：取處方量的乙醇加入連翹苷元，攪拌溶解，加入注射用水至10000ml，攪拌均勻，加入0.5％針用活性炭攪拌脫炭后分裝即得。實施例5連翹苷元片劑制備工藝：將主藥及各輔料成分烘干、粉碎過篩預處理，將主藥與糖分、乳糖、羧甲基纖維素鈉混勻，以純水作為粘合劑將混勻的物料制備軟材，過20目篩制粒并于60度下干燥制備干顆粒，將硬脂酸鎂加入到上述干顆粒總混，壓片即得。實施例6連翹苷元膠囊劑制備工藝：按膠囊劑常規(guī)制備工藝制備而成。實施例7連翹苷元微乳制劑制備工藝：稱取處方量薄荷油、辛酸油酸乙酯、1，2-丙二醇、聚乙二醇3350，混合后攪拌均勻，然后加入連翹苷元溶解，也可以超聲波處理以加速溶解，得澄清濃縮液，即為連翹苷元微乳濃縮物。實施例8連翹苷元微乳制劑制備工藝：稱取處方量薄荷油、聚氧乙烯-23-月桂基醚、1，2-丙二醇，混合后攪拌均勻，然后加入連翹苷元溶解，也可以超聲波處理以加速溶解，得澄清濃縮液，即為連翹苷元微乳濃縮物。實施例9連翹苷元對自身免疫性肝炎大鼠的治療作用自身免疫性肝炎大鼠模型發(fā)生了顯著的免疫平衡失調(diào)，表現(xiàn)為CD4+細胞百分比增高，Th2細胞因子水平升高，Thl細胞因子水平降低及肝細胞特異性脂蛋白抗體水平升高，導致自身免疫性肝炎的產(chǎn)生。其中CD4+細胞在肝組織內(nèi)浸潤，釋放損傷可導致肝損傷，Thl和Th2細胞活性及其細胞因子平衡失調(diào)是導致自身免疫性組織損傷的主要原因之一，IL-6促進炎癥反應時急性期蛋白釋放也是導致肝組織損傷的原因。1.自身免疫性肝炎大鼠模型的制備：Wistar大鼠，雄性，3月齡。采用弗氏完全佐劑加肝細胞特異性脂蛋白2mg/只，于頸部、腋窩、腹股溝皮下及腹腔和肌肉多點注射，每點0.2mL，10d/次，連續(xù)注射2次后，改為肝細胞特異性脂蛋白1mg(不加弗氏完全佐劑)上述部位多點注射，1次/周，注射3次后改為1次/月，再注射3次，并于最后1次免疫后第3天，以肝細胞特異性脂蛋白2mg靜脈注射加強1次。于加強后第3天，隨機制取3只作肝組織病理學檢查，結(jié)果表明：經(jīng)肝細胞特異性脂蛋白免疫的動物肝細胞變性壞死較明顯，中度碎片狀壞死，出現(xiàn)橋接壞死，小葉內(nèi)有纖維間隔形成，提示自身免疫性肝炎模型制作成功。2、給藥與分組將造模成功的自身免疫性肝炎大鼠隨機分成以下6組，每組10只。各給藥組給藥情況如下所示：正常對照組：皮下注射等體積的溶劑；模型組：皮下注射等體積的溶劑；潑尼松組：灌胃給予5mg/kg的潑尼松；連翹苷元低劑量組：皮下注射本發(fā)明實施例1制備的藥物0.5mg/kg；連翹苷元中劑量組：皮下注射本發(fā)明實施例1制備的藥物1mg/kg；連翹苷元高劑量組：皮下注射本發(fā)明實施例1制備的藥物4mg/kg。所有給藥組每天給藥1次，連續(xù)給藥3周，于給藥結(jié)束時取血備用，測定大鼠外周血淋巴細胞培養(yǎng)上清中各細胞因子的含量。3、主要指標測定淋巴細胞培養(yǎng)及增殖：將動物用硫噴妥鈉麻醉，常規(guī)消毒，剝離胸腹部皮膚，打開胸腔和腹腔，心臟取血，離心10min，分離血漿-60℃保存?zhèn)錅y。收集細胞，3倍體積的培養(yǎng)基懸浮血細胞，將細胞懸液緩慢加在淋巴細胞分離液上層，500g離心20min，吸取淋巴細胞，Hank’S液洗滌3次，沉淀用培養(yǎng)液懸浮，計數(shù)，用含體積分數(shù)為0.15小牛血清和10％大鼠自身血漿的培養(yǎng)基調(diào)整細胞至1×1010L-1，接種于24孔培養(yǎng)板，37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2，原代培養(yǎng)4h，離心，棄上清液，沉淀用培養(yǎng)基懸浮，計數(shù)，調(diào)整細胞至1×109L-1，接種于24孔培養(yǎng)板。細胞因子的檢測方法及步驟：采用ELISA法，全自動酶免儀進行定量檢測。首先在使用前將試劑從冰箱取出，室溫平衡30min。將試劑搖勻，加100μL倍稀釋的標準品，樣本或標準的稀釋液于微孔，分別作為標準對照、樣本檢測或空白對照。每孔加入50μL稀釋的生物素標記檢測抗體，室溫3h，傾去所有孔中反應液，洗板3×3min。每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的親合素，室溫靜置30min，每孔加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液100μL，避光10～15min，顯色。每孔加入100μL1.8mol/L的硫酸終止反應，在450nm波長處檢測吸光度。4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計及結(jié)果分析統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以x±s表示，組間差異的比較采用t檢驗。表1連翹苷元對自身免疫性肝炎大鼠模型外周淋巴細胞因子水平的影響組別n白細胞介素2白細胞介素4白細胞介素6γ-干擾素正常對照組1275.14±7.4958.97±6.64259.46±24.18364.15±31.73模型組1243.15±5.16**86.49±7.95**435.16±37.84**227.48±20.64**潑尼松組1247.16±6.4282.29±6.35421.41±30.17245.17±25.42&連翹苷元高組1268.25±5.48&&##61.31±6.24&&##315.27±31.25&&##347.62±27.45&&##連翹苷元中組1258.16±5.06&#68.18±6.89&#374.19±37.18&&##279.49±25.39&&#連翹苷元低組1252.31±5.12&74.27±7.16&405.86±35.19&246.53±26.67&與正常對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，&P＜0.05，&&P＜0.01與潑尼松組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。由表1可以看出，模型組與正常組相比白細胞介素2和γ-干擾素水平顯著降低，白細胞介素4和白細胞介素6水平顯著升高。與模型組相比，潑尼松組可以改善白細胞介素水平和γ-干擾素水平，改變細胞因子之間的比例，但改變幅度不大，與模型組相比無統(tǒng)計學差異。與模型組相比，連翹苷元各劑量組可以顯著改善白細胞介素水平和γ-干擾素水平之間的比例失衡，具體表現(xiàn)在其可以顯著升高白細胞介素2和γ-干擾素水平(P＜0.05)，顯著降低白細胞介素4和白細胞介素6的水平(P＜0.05)。連翹苷元在改善白細胞介素水平和γ-干擾素水平之間的比例失衡方面呈現(xiàn)劑量依賴性，其中連翹苷元高組的各細胞因子水平與模型組相比具有極顯著性差異(P＜0.01)。實施例10連翹苷元對自身免疫性肝炎大鼠肝功能和肝臟指數(shù)的影響1自身免疫性肝炎模型的制備Wistar大鼠，雄性，3月齡。采用弗氏完全佐劑加肝細胞特異性脂蛋白2mg/只，于頸部、腋窩、腹股溝皮下及腹腔和肌肉多點注射，每點0.2mL，10d/次，連續(xù)注射2次后，改為肝細胞特異性脂蛋白1mg(不加弗氏完全佐劑)上述部位多點注射，1次/周，注射3次后改為1次/月，再注射3次，并于最后1次免疫后第3天，以肝細胞特異性脂蛋白2mg靜脈注射加強1次。于加強后第3天，隨機制取3只作肝組織病理學檢查，結(jié)果表明：經(jīng)肝細胞特異性脂蛋白免疫的動物肝細胞變性壞死較明顯，中度碎片狀壞死，出現(xiàn)橋接壞死，小葉內(nèi)有纖維間隔形成，提示自身免疫性肝炎模型制作成功。2分組與給藥模型大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分成正常組、模型組以及給藥組，具體分組情況見下表，每組10只。每天下午14：30時灌胃藥物，劑量如下：正常對照組：同體積的羧甲基纖維素鈉；模型對照組：同體積的羧甲基纖維素鈉；潑尼松組：灌胃給予5mg//kg/d潑尼松；連翹苷元低劑量組：灌胃給予按實施例6制備連翹苷元片劑0.1mg//kg/d；連翹苷元中劑量組：灌胃給予按實施例6制備連翹苷元片劑1mg//kg/d；連翹苷元高劑量組：灌胃給予按實施例6制備連翹苷元片劑10mg//kg/d。3檢測指標按上述給藥方式連續(xù)給藥14天，末次給藥后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，解剖，腹主靜脈取血測定生化指標，取肝臟進行稱重。3.1.肝功能試驗結(jié)果表明(詳見表2)，模型組大鼠血清ALT、AST含量與正常組相比大幅度升高，各給藥組的大鼠血清ALT、AST含量與模型組相比明顯下降，尤其是，連翹苷元各劑量組與模型組相比具有極顯著性差異，與潑尼松組相比有顯著性差異，這說明連翹苷元在對大鼠自身免疫性肝炎的預防或治療上優(yōu)于潑尼松組。表2連翹苷元對大鼠模型肝功能的影響組別ALT(U/L)AST(U/L)正常對照組31.63±5.9258.38±8.54模型對照組275.10±70.46437.24±79.21潑尼松組196.26±39.02*332.54±53.54*連翹苷元低劑量組78.33±16.25**#94.56±9.25**#連翹苷元中劑量組61.40±13.43**##81.20±7.15**##連翹苷元高劑量組57.14±15.28**##76.27±5.19**##與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01；與潑尼松組比較，#P＜0.05；與潑尼松組比較，##P＜0.013.2.肝指數(shù)試驗結(jié)果表明(詳見表3)，模型組大鼠肝指數(shù)與正常組相比有極顯著性差異，各給藥組的大鼠的肝指數(shù)與模型組相比有極顯著性差異，尤其是，連翹苷元各劑量組與潑尼松組相比有顯著性差異或極顯著性差異，這說明連翹苷元在對大鼠自身免疫性肝炎模型治療重在降低肝臟指數(shù)顯著優(yōu)于現(xiàn)有治療藥物潑尼松。表3連翹苷元對大鼠臟器指數(shù)的影響組別體重(g)肝濕重(g)肝指數(shù)(％)正常組421±2410.94±0.172.60±0.32模型組480±3822.14±0.344.62±0.68￥￥潑尼松組459±4218.56±0.254.04±0.42￥￥連翹苷元低劑量組464±3915.17±0.173.27±0.38￥**#連翹苷元中劑量組445±3113.26±0.212.98±0.24**##連翹苷元高劑量組459±4612.97±0.192.83±0.30**##與正常組比較，￥P＜0.05；與正常組比較，￥￥P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01；與潑尼松組比較，#P＜0.05；與潑尼松組比較，##P＜0.01。當前第1頁1 2 3