本發(fā)明涉及藥物化學(xué)，具體涉及阿霉素抗腫瘤藥物，尤其涉及雙靶向激活的阿霉素衍生物及其制備和用途。
背景技術(shù)：
：鹽酸阿霉素(Doxorubicin，DOX)為已上市傳統(tǒng)化療藥物，其結(jié)構(gòu)式如下所示：鹽酸阿霉素的抗瘤譜較廣，對多種腫瘤細(xì)胞均有殺滅作用，適用于急性白血病(淋巴細(xì)胞性和粒細(xì)胞性)、惡性淋巴瘤、乳腺癌、支氣管肺癌(未分化小細(xì)胞性和非小細(xì)胞性)、卵巢癌、軟組織肉瘤、成骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、尤文肉瘤、腎母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膀胱癌、甲狀腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗癌、睪丸癌、胃癌、肝癌等。鹽酸阿霉素的作用機(jī)制主要是阿霉素分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。然而，這一蒽環(huán)類化合物因為具有嚴(yán)重的毒副作用，包括骨髓毒性，胃腸疾病，口腔炎，脫發(fā)，外滲，急性和累積性心臟毒性。因此，臨床上應(yīng)用時而鹽酸阿霉素的使用劑量受到限制。鹽酸阿霉素的主要限制是在每個療程后，大劑量鹽酸阿霉素導(dǎo)致骨髓和血液中單核細(xì)胞和血小板急劇減少。特別令人關(guān)切的是累積性心臟毒性能夠引發(fā)心肌充血性心力衰竭，是不可逆轉(zhuǎn)的。因此，需要將傳統(tǒng)鹽酸阿霉素或其衍生物改變?yōu)榉肿佣c(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素或其衍生物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明通過系列試驗證明了分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物具有抗腫瘤特異雙靶向激活特性。相對于阿霉素或其衍生物和單一靶向分子，抑制腫瘤的廣譜性和抑制的藥效具有很大的提高，更為關(guān)鍵的是藥物的化療毒性大大降低，并且出現(xiàn)了意想不到的治療轉(zhuǎn)移和放療及免疫治療的協(xié)同效果，具有非常好的應(yīng)用前景。迄今為止，尚未有專利和文獻(xiàn)報道本發(fā)明，因此，本發(fā)明提供了一種新穎的分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物用于治療人體腫瘤的有效方法，具有非常好的應(yīng)用前景和巨大的社會效益。具體而言，本發(fā)明提供具有下式I所示結(jié)構(gòu)的化合物：式中，X為極性和非極性不帶電荷的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸；Z為阿霉素、表阿霉素或吡喃阿霉素，其中，Z通過其氨基與式I中的乳糖-XANL部分相連。在一個具體實施例中，X為丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或甘氨酸。在一個具體實施例中，Z為阿霉素，所示式I化合物具有下式II結(jié)構(gòu)：式中，X為前述所定義的氨基酸殘基，優(yōu)選選自丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和甘氨酸。在一個具體實施例中，所示式II化合物選自：在一個具體實施方式中，式I化合物的結(jié)構(gòu)如下式III所示：式中，X的定義與式I中X的定義相同。在一個具體實施例中，式III中，X選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。在一個具體實施例中，式III化合物為如下的S7：Lacto-AANL-表阿霉素：在一個具體實施例中，式I化合物具有下式IV所示的結(jié)構(gòu)：式中，X的定義相同。在一個具體實施例中，式IV中，X選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。在一個具體實施例中，式IV化合物為如下的S8：Lacto-AANL-吡喃阿霉素：本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物組合物含有本發(fā)明式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。在一個具體實施例中，所述藥物組合物還含有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還提供一種藥盒，該藥盒含有本發(fā)明藥物組合物。本發(fā)明提供本發(fā)明式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療癌癥用的藥物中的用途。在一個具體實施例中，所述癌癥是實體癌。在一個具體實施例中，所述癌癥選自膀胱癌、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、食管癌、腎癌、肝癌、肺癌(例如支氣管肺癌，包括未分化小細(xì)胞性和非小細(xì)胞性)、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、血癌(例如慢性或急性白血病，包括淋巴細(xì)胞性和粒細(xì)胞性白血病)、惡性淋巴瘤、纖維素肉瘤、軟組織肉瘤、成骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、尤文肉瘤、腎母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、甲狀腺癌和頭頸部鱗癌。本發(fā)明還提供一種疾病治療方法，所述方法包括向需要治療的對象提供治療有效量的本發(fā)明式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或治療有效量的本發(fā)明藥物組合物。在一個具體實施例中，所述疾病是癌癥。在一個具體實施例中，所述癌癥選自膀胱癌、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、食管癌、腎癌、肝癌、肺癌(例如支氣管肺癌，包括未分化小 細(xì)胞性和非小細(xì)胞性)、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、血癌(例如慢性或急性白血病，包括淋巴細(xì)胞性和粒細(xì)胞性白血病)、惡性淋巴瘤、纖維素肉瘤、軟組織肉瘤、成骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、尤文肉瘤、腎癌、腎母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、甲狀腺癌和頭頸部鱗癌。附圖說明圖1顯示分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素的雙靶向分子受體在腫瘤細(xì)胞表面分布相同。熒光共聚焦顯微鏡檢測對應(yīng)抗體標(biāo)記的MDA-MB435腫瘤細(xì)胞，天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶(左1，綠色)，唾液酸糖蛋白受體(左2，紅色)，細(xì)胞核染色用DAPI(藍(lán)色)，兩圖合并共同分布為黃色(左3)。圖2顯示本發(fā)明S1，S2，S3，S4，S5和S6溶液在裸鼠中的藥效研究。圖3顯示：與Succinyl-AANL-DOX相比，S1靜脈注射后具有更多的腫瘤組織分布和滲透。具體實施方式本發(fā)明所述“分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素或其衍生物”是指本發(fā)明所述化合物通過雙靶向腫瘤表面特有的并共同分布的去唾液酸糖蛋白受體和天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶，而只在腫瘤微環(huán)境中聚集和專一性激活釋放藥物的活性成分。本發(fā)明提供的分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素或其衍生物，由于在阿霉素或其衍生物上結(jié)合了所述短肽側(cè)鏈，從而封閉了化合物毒性或活性，同時由于雙定點(diǎn)靶向于腫瘤部位激活阿霉素或其衍生物，單一定位不激活藥物，而提供了更為精確靶向治療腫瘤的方法，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物可以成為更為廣譜性抗腫瘤藥物，對腫瘤轉(zhuǎn)移治療具有特殊的療效，并且分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物于定點(diǎn)放療具有協(xié)同治療效果，并可通過殺傷腫瘤免疫抑制細(xì)胞而提高免疫治療的協(xié)同效果，因此可以制備成以前沒有的高效靶向可協(xié)同作用的抗腫瘤化療藥物。本發(fā)明阿霉素衍生物包括表阿霉素和吡喃阿霉素。本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)如式I所示，優(yōu)選式II、式III和式IV的化合物，更優(yōu) 選化合物S1－S8。本發(fā)明包括式I化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，其的例子包括無機(jī)和有機(jī)酸鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、扁桃酸鹽和草酸鹽；以及與堿例如鈉羥基、三(羥基甲基)胺基甲烷(TRIS，胺丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的無機(jī)和有機(jī)堿鹽。本發(fā)明的藥物組合物可含有本發(fā)明式I所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選含有式II、式III和式IV的化合物，更優(yōu)選含有化合物S1－S8。藥物組合物中還可含有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。載體或賦形劑可以是本領(lǐng)域周知的各種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，并依藥物劑型或施用方式不同而不同。在一具體實施例中，藥物組合物中含有溶媒、增溶劑/助溶劑、pH調(diào)節(jié)劑、凍干賦形劑和滲透壓調(diào)節(jié)劑中的一種或多種。適用于本發(fā)明的凍干賦形劑包括糖類(例如乳糖、麥芽糖、右旋糖酐、葡萄糖、果糖)、氨基酸(例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、甘露醇、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、氯化鈉和環(huán)糊精(例如羥丙基β環(huán)糊精、磺丁基β環(huán)糊精)中的一種或多種。適用于本發(fā)明的pH調(diào)節(jié)劑包括鹽酸、磷酸、硫酸、碳酸、硝酸、醋酸、枸櫞酸、DL-酒石酸、D-酒石酸、L-酒石酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、葡甲胺、馬來酸、乙二胺、三乙胺、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、馬來酸、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉中的一種或多種。適用于本發(fā)明的溶媒優(yōu)選為有機(jī)溶媒，包括乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、叔丁醇、甘油、吐溫、大豆油、羥丙基β環(huán)糊精溶液和磺丁基β環(huán)糊精溶液中的一種或多種。適用于本發(fā)明的滲透壓調(diào)節(jié)劑包括葡萄糖、氯化鈉、甘露醇和乳酸鈉中的一種或多種。適用于本發(fā)明的增溶劑/助溶劑包括吐溫80、吐溫60、波洛沙姆、羥丙基β環(huán)糊精、聚乙二醇(PEG)十二羥基硬脂酸鋰、磺丁基β環(huán)糊精、PVP、甘油和聚氧乙烯蓖麻油中的一種或多種。一般情況下，對哺乳動物每天口服給予本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的 鹽，藥量通常為約0.0025到50毫克/公斤體重，最好是約0.01到10毫克/公斤體重。如果同時施用一個已知的抗癌藥物或施與其它治療，其劑量應(yīng)可有效地實現(xiàn)其預(yù)期的目的。這些已知的抗癌藥物的最佳劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。單位口服劑量可以包括約0.01到50毫克，最好是約0.1到10毫克的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。單位劑量可給予一次或多次，每天為一劑或多劑，每劑含有約0.1到50毫克，合宜地約0.25到10毫克的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明化合物或藥物組合物可用于治療已知能用阿霉素或其衍生物(如表阿霉素和吡喃阿霉素)治療的各種疾病，尤其是各種癌癥，包括但不限于膀胱癌、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、食管癌、腎癌、肝癌、肺癌(例如支氣管肺癌，包括未分化小細(xì)胞性和非小細(xì)胞性)、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、血癌(例如慢性和急性白血病，包括淋巴細(xì)胞性和粒細(xì)胞性白血病)、惡性淋巴瘤、纖維素肉瘤、軟組織肉瘤、成骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、尤文肉瘤、腎癌、腎母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、甲狀腺癌和頭頸部鱗癌等。本發(fā)明的化合物或藥物組合物還可用于阻止腫瘤轉(zhuǎn)移，尤其是阻止腫瘤肺轉(zhuǎn)移。在一個實施例中，本發(fā)明的化合物或藥物組合物可用于阻止乳腺癌肺轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的化合物或藥物組合物還可用于與放療一同治療癌癥，尤其是例如乳腺癌。由于化療藥物損傷免疫系統(tǒng)，目前免疫抑制調(diào)節(jié)點(diǎn)的PD-1抗體等腫瘤免疫治療無法同期與紫杉醇等傳統(tǒng)化療藥物結(jié)合使用。腫瘤通過分泌的細(xì)胞因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫抑制并直接幫助腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(M2-MΦ型)區(qū)別于單核細(xì)胞和炎癥型巨噬細(xì)胞(M1型)確認(rèn)標(biāo)記就是豆莢蛋白酶的表達(dá)。本發(fā)明的化合物或藥物組合物只在腫瘤局部激活，避免了傳統(tǒng)化療藥物會損傷免疫系統(tǒng)的缺陷，研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物或藥物組合物不僅對機(jī)體的免疫系統(tǒng)沒有毒性作用，反而可以通過抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞而具有刺激免疫的 協(xié)同治療作用，能夠同免疫治療聯(lián)合使用，提高癌癥的治愈率。因此，本發(fā)明的化合物或藥物組合物還可以用于抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，因而具有刺激免疫的協(xié)同治療作用。因此，本發(fā)明化合物或藥物組合物能同免疫治療聯(lián)合使用，如Pd-1抗體和PdL2-HSA蛋白等免疫治療聯(lián)合使用，提高癌癥的治愈率。在一個具體實施例中，本發(fā)明的化合物或藥物組合物與免疫治療聯(lián)用治療肺癌。因此，本發(fā)明包括癌癥治療方法，包括給予需要的患者治療有效量的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或含有本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。本發(fā)明還包括阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括給予需要的患者治療有效量的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或含有本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。阻止腫瘤轉(zhuǎn)移包括但不限于阻止腫瘤肺轉(zhuǎn)移和/或骨轉(zhuǎn)移。TAM作為一種關(guān)鍵的炎性細(xì)胞在腫瘤相關(guān)炎癥中扮演極其重要的角色。在腫瘤微環(huán)境中，TAM通過影響腫瘤各方面的生物學(xué)特性來促進(jìn)腫瘤發(fā)展。它分泌一些分子(如EGF)來直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)血管新生，從而為癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，同時還能抑制獲得性免疫行使功能。因此，本發(fā)明還包括抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的方法，包括給予需要的患者治療有效量的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或含有本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。通過抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，可抑制腫瘤生長、抑制血管新生，并抑制癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)抗腫瘤免疫，從而實現(xiàn)癌癥的預(yù)防和/或治療。在一個具體實施例中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)豆莢蛋白酶，為M2-MΦ型。本發(fā)明上述方法可與本領(lǐng)域已知的放療或免疫療法聯(lián)用。因此，本發(fā)明還包括用于上述各種方法或用途的本發(fā)明化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽，或本發(fā)明藥物組合物。本發(fā)明也包括本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或本發(fā)明藥物組合物在制備治療或預(yù)防癌癥及癌癥轉(zhuǎn)移(尤其是上述癌癥轉(zhuǎn)移)用的藥物中的用途。本發(fā)明也包括本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或本發(fā)明藥物組合物在制備抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、抑制腫瘤生長、抑制血管新生、抑制癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移和/或促進(jìn)抗腫瘤免疫用的藥物中的用途。本發(fā)明還提供一種降低阿霉素或阿霉素衍生物毒副作用的方法，所述方法 包括將阿霉素或阿霉素衍生物經(jīng)由短肽與能與唾液酸糖蛋白受體結(jié)合的部分偶聯(lián)，形成偶聯(lián)物，其中，所述短肽能被天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶切割，從而允許所述抗癌藥從所述偶聯(lián)物中釋放出來。能與唾液酸糖蛋白受體結(jié)合的部分包括但不限于乳糖部分，例如本申請式I中與X連接的乳糖部分。適用的短肽包括XANL，其中X如前文所定義。通常，阿霉素或其衍生物通過其氨基與短肽的羧基縮合，形成肽鍵。本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)(1)分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素在腫瘤表面共同表達(dá)去唾液酸糖蛋白受體和天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶的位點(diǎn)處具有聚集，滯留的靶向效應(yīng)，具有分子定點(diǎn)靶向腫瘤的特性。(2)分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素通過分子定點(diǎn)靶向能夠刺激倍增激活效率，在腫瘤部位定點(diǎn)激活產(chǎn)生阿霉素。(3)在體外體內(nèi)代謝實驗中雙靶向激活的阿霉素在血液中并不激活，具有長期的血液穩(wěn)定性和對正常組織器官低毒的特性。(4)雙靶向激活的阿霉素的毒性相比單一靶向的阿霉素大大降低。(5)由于化學(xué)結(jié)構(gòu)間的構(gòu)效關(guān)系和極性改變，分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素相比單一靶向的阿霉素的激活效率更高，而連接其他毒物則不能激活。(6)分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素因為高效激活，直接能夠改變單一靶向適應(yīng)癥限制的情況，開發(fā)成為更為廣譜性抗腫瘤藥物。(7)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移時表達(dá)有更大量的被靶向雙分子，所以分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素對腫瘤轉(zhuǎn)移治療具有特殊的療效。(8)分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素用于定點(diǎn)放療合并治療時，放療會導(dǎo)致兩個靶分子共同表達(dá)增高，實驗發(fā)現(xiàn)具有對照化合物沒有的協(xié)同治療藥效。(9)化合物中的阿酶素結(jié)構(gòu)可替換為表阿酶素或吡喃阿霉素，并不影響藥物的激活效率和抗癌效果。(10)部分腫瘤免疫抑制細(xì)胞有表達(dá)的被靶向雙分子，分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素可通過殺傷腫瘤免疫抑制細(xì)胞而提高免疫治療效果，不同于傳統(tǒng)化療藥物會損傷整體免疫系統(tǒng)，解決免疫治療很難與化療藥物結(jié)合使用的弊端。應(yīng)理解，本發(fā)明“含有”、“包括”也包括“由……組成”、“由……構(gòu)成”。所有重量百分比或體積百分比之和應(yīng)等于100％。實施例中使用到的各種試劑和產(chǎn)品，除非另有說明，否則為市售產(chǎn)品；對于所涉及的方法，除非另有說明，否則按常規(guī)技術(shù)實施。下述實施例并非是對本發(fā)明范圍的限制。下面結(jié) 合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步地說明。實施例1本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素的雙靶向分子受體在腫瘤細(xì)胞表面分布相同(見圖1)。在MDA-MB231乳腺癌腫瘤細(xì)胞的免疫熒光染色中發(fā)現(xiàn)，唾液酸糖蛋白受體和天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶的位點(diǎn)分布相同。用熒光共聚焦顯微鏡檢測對應(yīng)抗體標(biāo)記的唾液酸糖蛋白受體與天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶，細(xì)胞核染色用DAPI。雙靶向分子受體共同分布存在，可以使藥物在靶向分子附近積累和滯留，提高藥物的局部濃度和激活效率。實施例2：化合物構(gòu)象效應(yīng)的篩選和對藥物激活的影響本發(fā)明提供的分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物，實驗思路來源于依靠我們特有的合成技術(shù)，通過大量的合成難以合成的復(fù)雜化合物，然后通過連接復(fù)雜化合物到阿霉素或其衍生物上，再通過腫瘤組織激活效率的大小進(jìn)行篩選，并依次篩選所得化合物在不同短肽，不同基團(tuán)，不同毒物對腫瘤的激活促經(jīng)作用。腫瘤組織特異性的激活位點(diǎn)是短肽，因為天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶的酶活中心位于球囊狀內(nèi)陷的底部，切割位點(diǎn)需要接近酶活中心，這時復(fù)雜化合物對切割位點(diǎn)是否有空間位阻變?yōu)榉浅Ｖ匾1～S8樣品化合物和部分對照化合物統(tǒng)一溶解，并用水稀釋10倍到1毫克/毫升。在本發(fā)明的實驗中，在37℃、2小時條件下在100微克酸化的人肝癌(HepG2)腫瘤組織勻漿(pH6.0)中加入1毫克/毫升的樣品化合物，腫瘤組織勻漿中的酶能夠?qū)е箩尫虐⒚顾?阿霉素衍生物，通過HPLC能夠檢測化合物的減少和阿霉素/阿霉素衍生物的增加而比較腫瘤組織對藥物的激活效率〔指被酶剪切而釋放出來的阿霉素占原化合物的比例〕。下表1顯示了激活效率。表1：S1～S8和部分對照化合物激活效率化合物激活效率(％)C1:AANL-DOX35.4C2:CH3-TANL-DOX37.9C3:peg-VANL-DOX31.4C4:Succinyl-AANL-DOX36.7C6:BOC-AANL-DOX29.3C7:Lacto-RANL-DOX1.1C8:Lacto-FANL-DOX4.7C9:Lacto-DANL-DOX5.8C10:Lacto-ASNL-DOX1.3C11:Lacto-AVNL-DOX2.4C12:Lacto-ATNL-DOX2.4S1:Lacto-AANL-DOX95.5S2:Lacto-TANL-DOX89.5S3:Lacto-VANL-DOX72.4S4:Lacto-LANL-DOX85.4S5:Lacto-IANL-DOX72.4S6:Lacto-GANL-DOX65.4S7:Lacto-AANL-表阿霉素92.8S8:Lacto-AANL-吡喃阿霉素90.7上述結(jié)果說明：本發(fā)明定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物不同基團(tuán)的連接對藥物在腫瘤組織激活具有不同的影響。C7～C9不被激活說明，短肽第一位置不能為芳香或帶電荷的氨基酸。C10～C12不被激活說明，短肽第二位置只能為丙氨酸。S1，S2，S3，S4，S5，S6在相同腫瘤類型中的激活倍增說明短肽第一位置可以為極性和非極性不帶電荷的氨基酸。S1，S2，S3，S4，S5，S6化合物的各基團(tuán)選擇是相對激活效率倍增的最佳搭配(表1)。S7和S8在相同腫瘤類型中的激活倍增說明阿酶素可以替換成表阿酶素或吡喃阿霉素，并不影響激活活性。通過篩選實驗的結(jié)果和與C1～C6對比，由此推測Lacto的連接不會帶來空間位阻，同時能夠增加切割位點(diǎn)的極性，增強(qiáng)化合物與酶切位點(diǎn)的相互作用，使更水溶性的蛋白酶更容易接近酶切位點(diǎn)，增加激活效率。實施例3：分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素比單點(diǎn)靶向具有特殊的組織分 布特性S1，S2，S3，S4，S5，S6化合物能夠靶向唾液酸糖蛋白受體與天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶，而本發(fā)明以前的研究中Succinyl-AANL-DOX沒有。由于DOX，Succinyl-AANL-DOX和S1，S2，S3，S4，S5，S6具有自發(fā)熒光，可用熒光顯微鏡檢測腫瘤組織中它們的分布情況。靜脈注射10umol/kg的Succinyl-AANL-DOX和S1，S2，S3，S4，S5，S6。12小時后檢測腫瘤組織切片的藥物分布圖像和腫瘤組織勻漿熒光強(qiáng)度。細(xì)胞核染色用DAPI。與Succinyl-AANL-DOX相比，S1靜脈注射后具有更多的腫瘤組織分布和滲透，說明S1分子定點(diǎn)靶向使它們比Succinyl-AANL-DOX具有很強(qiáng)的腫瘤部位的滯留效應(yīng)(見圖3)。實施例4：激活研究檢測分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物比單點(diǎn)靶向具有治療的廣譜性使用溶劑1(50％注射用水，45％～49％酒精，1％～5％吐溫80)統(tǒng)一溶解S1～S8(實施例11-12制得)，并用水稀釋10倍到1毫克/毫升。37℃下，將1毫克/毫升的樣品化合物加到100微克酸化的腫瘤組織勻漿(pH6.0)中。通過HPLC檢測化合物的減少和產(chǎn)物的增加。實驗結(jié)果如下表2所示。表2：不同腫瘤組織勻漿中的S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8的化合物激活效率(％)產(chǎn)生腫瘤的細(xì)胞S1S2S3S4S5S6S7S8人纖維肉瘤HT-108079.780.472.979.674.559.656.768.4人乳腺癌MDA-MB43597.396.495.497.894.487.867.475.4人卵巢癌SK-OV-393.489.684.368.883.348.857.473.5人結(jié)腸癌HT-2984.494.996.495.693.565.678.585.4人慢性白血病K56249.758.355.259.253.649.267.563.8人胰腺癌Panc-199.898.896.598.196.368.189.479.4人非小細(xì)胞肺癌A54991.494.486.488.687.368.694.578.6人前列腺癌PC-392.393.491.398.592.368.591.578.6人腎癌OS-RC-291.496.591.495.590.465.578.588.5人心臟無無無無無無無無唾液酸糖蛋白受體在各種腫瘤細(xì)胞都有表達(dá)，在肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞為高表達(dá)，由于藥物釋放的低效性，以前的單一靶向唾液酸糖蛋白受體的藥物通常只針對肝癌有一定效果，局限了藥物的廣譜性。而由于雙靶向分子受體共同分布特點(diǎn)以及酶分子可重復(fù)激活的特性，分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物有更為集中的靶向和更高的激活效果。實驗證明本發(fā)明分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素/阿霉素衍生物在不同腫瘤都有很好的激活效果，具有的治療的廣譜性。實施例5：本發(fā)明分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素具有更低的毒性試驗?zāi)康模和ㄟ^測定小鼠靜脈用藥MTD(最大耐受劑量)實驗，了解本發(fā)明阿霉素衍生物的急性毒性。試驗藥物：S1，S2，S3，S4，S5和S6注射液和對照藥物使用注射用水統(tǒng)一溶解，試驗時用生理鹽水稀釋到相應(yīng)劑量。動物：一級巴比賽(BALB/C)小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)，體重19-21g，全為雌性。方法和結(jié)果：受試BALB/C小鼠36只，體重19-21g，全為雌性，按體重隨機(jī)分為7組，每組10只。如表3所示，按表3中所示劑量分別一次性靜脈注射S1，S2，S3，S4，S5和S6。并進(jìn)行生理鹽水組、阿霉素組注射液(市售，北京悅康)的對照試驗，每個小鼠給藥體積0.2ml。連續(xù)觀察17天，每日觀察動物是否出現(xiàn)立毛樹立、糟亂無光澤、昏睡、彎腰駝背、過激反應(yīng)等，記錄體重和死亡情況。在第3、5、14天采血樣進(jìn)行全血球計數(shù)，在第14天解剖動物采取心臟、肝臟、腎臟、肺、脾臟、胰腺HE染色觀察。死亡率結(jié)果如下表3所示。表3：受試小鼠分別接受不同劑量的S1，S2，S3，S4，S5和S6注射液以及生理鹽水、阿霉素注射液的死亡率結(jié)果組別劑量(mg/kg)動物(只)死亡數(shù)(只)死亡(％)1生理鹽水0mg/kg10002S1125mg/kg10003S1150mg/kg10004S1175mg/kg10005S1200mg/kg102206S2125mg/kg10007S2150mg/kg10008S2175mg/kg10009S2200mg/kg1022010S3125mg/kg100011S3150mg/kg100012S3175mg/kg100013S3200mg/kg1033014S4125mg/kg100015S4150mg/kg100016S4175mg/kg100017S4200mg/kg1022018S5125mg/kg100019S5150mg/kg100020S5175mg/kg100021S5200mg/kg1011022S6125mg/kg100024S6150mg/kg100024S6175mg/kg100025S6200mg/kg1022026S7125mg/kg100027S7150mg/kg100028S7175mg/kg1011029S7200mg/kg1033030S8125mg/kg100031S8150mg/kg100032S8175mg/kg101133S8200mg/kg1033034阿霉素35mg/kg10440％35阿霉素40mg/kg10890％36Succinyl-AANL-DOX75mg/kg100037Succinyl-AANL-DOX100mg/kg1055％38Succinyl-AANL-DOX125mg/kg10880％39Succinyl-AANL-DOX150mg/kg1010100％結(jié)果顯示，注射本發(fā)明的S1、S2、S3、S4、S5和S6溶液的小鼠組，在175mg/kg劑量時，動物沒有出現(xiàn)立毛樹立、糟亂無光澤、昏睡、彎腰駝背、過激反應(yīng)和死亡情況。如表3所示S1和S2溶液的MTD值(最大耐受劑量)為175mg/kg，遠(yuǎn)大于阿霉素的MTD值25mg/kg和Succinyl-AANL-DOXMTD值75mg/kg，受試藥靜脈用藥最大耐受劑量是藥物毒性的重要參考指數(shù)，表明定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素S1，S2，S3，S4，S5和S6的毒性因為其靶向的聚集效應(yīng)使毒性比Succinyl-AANL-DOX更為降低。實施例6：本發(fā)明S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7和S8溶液在裸鼠中的藥效研究試驗?zāi)康模和ㄟ^小鼠的腫瘤治療模型，了解S1～S8化合物的抗腫瘤藥效。試驗藥物：S1～S8溶液(同實施例5樣品)；阿霉素注射液(市售，同上)；試驗時用生理鹽水稀釋到相應(yīng)濃度；對照組為生理鹽水。方法和結(jié)果：1.動物：裸鼠，6-8周齡，全為雌性，上海斯萊克實驗動物有限公司。2.產(chǎn)生腫瘤模型1)人肝癌HepG2(細(xì)胞)從美國模式培養(yǎng)物集存庫(Americantypeculturecollection，ATCC)購買，并根據(jù)ATCC提供的說明書進(jìn)行細(xì)胞的鑒定，細(xì)胞使用含有10％胎牛血清達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(簡稱，DMEM培養(yǎng)液)在37℃，5％的二氧化碳條件下培養(yǎng)。每3天傳代一次，細(xì)胞使用在15代以內(nèi)。2)腫瘤產(chǎn)生，將5×106HepG2細(xì)胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待腫瘤長至 少達(dá)100mm3左右時隨機(jī)分組，開始治療，以開始治療當(dāng)天為第一天。3)治療過程根據(jù)S1～S8臨床用藥使用IV注射，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8治療組、阿霉素治療組以及Succinyl-AANL-DOX治療組都使用1/3MTD的劑量，對照組使用生理鹽水，每周給藥一次，共4周。4)分組與結(jié)果測量如圖2所示。5)抑瘤率計算如表4。表4：S1～S8藥物、阿霉素及對照組對裸鼠治療腫瘤的效果組別動物(只)24天腫瘤平均大小(mm3)24天抑瘤率S1組100100％S2組100100％S3組100100％S4組100100％S5組100100％S6組100100％S7組100100％S8組100100％阿霉素治療組101572.18±895.5629.4％Succinyl-AANL-DOX10812.47±495.4669.3％對照組(生理鹽水)102227.81±1104.74_5)結(jié)果與討論：如表4所示，與等毒性的阿霉素藥物治療組，Succinyl-AANL-DOX治療組比較，S1、S2、S3、S4、S5和S6治療組能夠治愈腫瘤，說明藥物S1、S2、S3、S4、S5和S6具有更好的療效。S7和S8能夠治愈腫瘤說明阿酶素可以替換成表阿酶素或吡喃阿霉素，并不影響藥物的療效。實施例7：S1化合物在多腫瘤模型的藥效研究試驗?zāi)康模和ㄟ^小鼠的多腫瘤模型，了解S1的抗腫瘤藥物的廣譜性。治療藥物：S1溶液(同實施例5樣品)，試驗時用生理鹽水稀釋到相應(yīng)濃 度。方法和結(jié)果：1.動物：裸鼠，6-8周齡，全為雌性(上海斯萊克實驗動物有限公司)。2.產(chǎn)生腫瘤模型1)對應(yīng)的細(xì)胞從美國模式培養(yǎng)物集存庫(Americantypeculturecollection，ATCC)購買，并根據(jù)ATCC提供的說明書進(jìn)行細(xì)胞的鑒定，細(xì)胞使用含有10％胎牛血清達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(簡稱，DMEM培養(yǎng)液)在37℃，5％的二氧化碳條件下培養(yǎng)。每3天傳代一次，細(xì)胞使用在15代以內(nèi)。2)腫瘤產(chǎn)生，將5×106對應(yīng)細(xì)胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待腫瘤長至少達(dá)100mm3左右時隨機(jī)分組，開始治療，以開始治療當(dāng)天為第一天。3)治療過程使用1/3MTD的劑量，每周一次給藥，共3周。4)分組與結(jié)果測量如下表5所示。表5：S1在多腫瘤模型的治療效果組別腫瘤細(xì)胞抑瘤率(24天)人乳腺癌MDA-MB435100％人卵巢癌SK-OV-368.6％人結(jié)腸癌HT-2989.7％人慢性白血病K56247.9％人直腸癌HT108096.3％人胰腺癌Panc-1100％人非小細(xì)胞肺癌A54975.6％人肝癌HepG2100％人腎癌OS-RC-265.7％5)結(jié)果與討論：如表5所示，S1在多種腫瘤模型中具有良好的藥效，說明藥物不但可以肝癌，而且是一個廣譜性的腫瘤治療藥物。實施例8：S1～S8藥物在BALB/C小鼠的轉(zhuǎn)移模型中的藥效研究試驗?zāi)康模和ㄟ^BALB/C小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移治療模型，了解S1～S8藥物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥效。試驗藥物：S1～S8溶液(同實施例5樣品)；阿霉素注射液(市售，同上)；試驗時用生理鹽水稀釋到相應(yīng)濃度；對照組為生理鹽水。1.動物：一級巴比賽(BALB/C)小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)，6-8周齡，全為雌性。2.產(chǎn)生腫瘤模型1)4T1細(xì)胞從ATCC購買，并根據(jù)ATCC提供的說明書進(jìn)行細(xì)胞的鑒定，細(xì)胞使用含有10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液在37℃，5％的二氧化碳條件下培養(yǎng)。每3天傳代一次，細(xì)胞使用在15代以內(nèi)。2)腫瘤產(chǎn)生，將5×1064T1細(xì)胞皮下注射到裸鼠小鼠背部，待腫瘤長至少達(dá)100mm3左右時隨機(jī)分組，開始低劑量定位放射治療，每周1次，共3周。以開始治療當(dāng)天為第一天。3)治療過程根據(jù)S1～S8臨床用藥使用IV注射，S1～S8治療組、阿霉素治療組以及Succinyl-AANL-DOX治療組都使用1/3MTD的劑量，對照組使用生理鹽水，放療后的第4天給藥，共3周。4)分組與結(jié)果測量如表6所示。表6：S1～S8藥物、阿霉素治療組及對照組對于裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移抑制的效果組別動物數(shù)量轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)量抑制轉(zhuǎn)移率S1組100100％S2組100100％S3組102±098.7％S4組109±976.1％S5組1011±1192.4％S6組1042±971.2％S7組100100％S8組100100％阿霉素治療組10143±552.1％Succinyl-AANL-DOX治療組10115±2121.5％溶媒對照組10146.0±46—5)結(jié)果與討論：如表7所示，與阿霉素治療組對照組比較，在S1、S2、S3、S4、S5和S6組腹腔給藥后，在BALB/C小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制效果被大大提高，說明此類藥物具有良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥效。S7和S8能夠治愈腫瘤轉(zhuǎn)移說明阿酶素可以替換成表阿酶素或吡喃阿霉素，并不影響藥物的療效。實施例9：S1～S8藥物在BALB/C小鼠用于放射性治療中協(xié)同治療藥物的用途的藥效研究試驗?zāi)康模和ㄟ^BALB/C小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移治療模型，了解S1～S8藥物的用于放射性治療中協(xié)同治療藥物的用途的藥效。試驗藥物：S1～S8溶液(同實施例5樣品)；阿霉素注射液(市售，同上)；試驗時用生理鹽水稀釋到相應(yīng)濃度；對照組為生理鹽水。1.動物：一級巴比賽(BALB/C)小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)，6-8周齡，全為雌性。2.產(chǎn)生腫瘤模型1)4T1細(xì)胞從ATCC購買，并根據(jù)ATCC提供的說明書進(jìn)行細(xì)胞的鑒定，細(xì)胞使用含有10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液在37℃，5％的二氧化碳條件下培養(yǎng)。每3天傳代一次，細(xì)胞使用在15代以內(nèi)。2)腫瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生，將106個T1細(xì)胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待腫瘤長至1.5cm左右時隨機(jī)分組，手術(shù)去除皮下腫瘤，并開始用藥物治療，在第27天時麻醉后處死小鼠，取出整個肺，放入布安溶液(Bouin’ssolution)中染色，在解剖顯微鏡下統(tǒng)計轉(zhuǎn)移到肺部的腫瘤數(shù)量。3)治療過程：使用IV注射，S1、S2、S3、S4、S5和S6都使用1/6MTD的劑量，即12毫克/公斤劑量；阿霉素藥物治療組使用1/6MTD的劑量，即4毫克/公斤劑量；S7和S8使用12毫克/公斤的劑量；對照組使用生理鹽水；每三天一次給藥，共4次。4)放療組與非放療組腫瘤組織勻獎的western-blot檢測靶點(diǎn)表達(dá)相對強(qiáng)度 比較如下表7所示：表7組別腫瘤數(shù)量去唾液酸糖蛋白受體天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶放療組53462±16356324±1563非放療組51462±4671243±7835)分組與結(jié)果測量如表8所示。表8：S1～S8、阿霉素治療組及對照組對于中協(xié)同治療藥物的用途的藥效6)結(jié)果與討論：腫瘤定點(diǎn)放療導(dǎo)致去唾液酸糖蛋白受體表達(dá)增加，而天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶更是成倍增加，因此可能導(dǎo)致藥物的靶向激活效率大增。如表8所示，與對照組比較，在S1～S8組給藥后，極大提高了放療的協(xié)同治療效果，能夠治愈一般化療藥物和放療難以治愈的4T1實體瘤，而阿霉素和Succinyl-AANL-DOX無協(xié)同治療效果。實施例10：S1～S8化合物在D121腫瘤免疫模型的藥效研究1)D121肺癌腫瘤從美國模式培養(yǎng)物保藏所ATCC購買，細(xì)胞使用含有10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液在37℃，5％的二氧化碳條件下培養(yǎng)。每3天傳代一次，細(xì)胞使用在15代以內(nèi)。動物：C57小鼠，6-8周齡，全為雌性，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。2)腫瘤免疫，小鼠腹腔注射5x105經(jīng)過照射死亡的D121肺癌細(xì)胞(購自美國模式培養(yǎng)物保藏所)，免疫注射3次，每次間隔2周。在免疫結(jié)束后注射瘤細(xì)胞，然后再給藥，每周一次給藥，共4周。下表9中的免疫組就是用D121肺癌細(xì)胞免疫，而無D121死腫瘤細(xì)胞免疫組注射生理鹽水為對照。3)腫瘤產(chǎn)生：在免疫過程結(jié)束之后(4周后)，將106活的D121肺癌腫瘤細(xì)胞皮下注射到腫瘤免疫的C57小鼠背部，待腫瘤長至0.3～0.4cm左右時開始治療，記錄計小鼠腫瘤大小(mm3)，并與溶媒對照組相比計算抑瘤率。4)治療過程：使用IV注射，S1～S8都使用1/6MTD的劑量，每周一次。免疫抑制調(diào)節(jié)點(diǎn)蛋白PdL2-HSA(自產(chǎn))IV注射治療每周一次。共三周療程。5)腫瘤CD8+T細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞亞群)分析。腫瘤組織經(jīng)過勻漿，過濾分離出腫瘤中單個細(xì)胞，用緩沖液洗兩次，白細(xì)胞共同抗原CD45-PE和CD8-FITC標(biāo)記的抗體在室溫1小時結(jié)合，細(xì)胞用包含1％胎牛血清磷酸緩沖液 PBS洗兩次，然后用流式細(xì)胞儀分析白細(xì)胞共同抗原(CD45)陽性細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞抗原(CD8)陽性細(xì)胞的比例。6)分組與結(jié)果測量如下表9所示。表97)結(jié)果與討論：與對照組和無免疫治療組相比較，S1～S8在聯(lián)合治療中具有非常好的協(xié)同藥效，聯(lián)合治療具有良好的促進(jìn)免疫CD8+T上升的效果，導(dǎo)致CD8:CD45陽性細(xì)胞增殖。而Succinyl-AANL-DOX和LeuDOX不改變免疫治療的效果。實施例11：分子定點(diǎn)靶向和激活的短肽阿霉素合成路線S1的合成路線如下：1)Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe(I)的合成將N-芐氧羰基-L-丙氨酸(100g，0.45mol)溶于干燥的N，N-二甲基甲酰胺(3L)中，攪拌下加入1-羥基苯并三氮唑(72.6g，0.54mol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(103.3g，0.54mol)，攪拌反應(yīng)1小時后，冰浴至0℃下滴加L-丙氨酸甲酯(46.2g，0.45mol)和N，N-二異丙基乙基胺(173.8g，1.34mol)的N，N-二甲基甲酰胺(1L)溶液，滴加完畢后在室溫下攪拌10小時，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)品溶于二氯甲烷(2L)，依次用飽和氯化銨溶液、水和飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑后粗產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶后得到純品為白色固體I，即Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe(101g，收率：73.1％)。2)Cbz-L-Ala-L-Ala-OH(II)的合成將Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe(100g，0.34mol)溶于四氫呋喃(2L)和水(1L)的混合溶液中，冷卻至0℃下滴加1摩爾/升氫氧化鋰溶液(400mL)，攪拌反應(yīng)10小時，滴加濃鹽酸中和至PH<6，減壓蒸除四氫呋喃，剩余水相用二氯甲烷(1L×3)萃取，有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得到白色固體II，即Cbz-Ala-Ala-OH(88g，收率：92.2％)。3)Fmoc-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(III)的合成在三頸瓶中將L-亮氨酸叔丁酯(22.4g，0.1mol)，N-Fmoc-N’-三苯甲基天冬酰胺(59.6g，0.1mol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(1000mL)中，攪拌下加入1-羥基苯并三氮唑(14.85g，0.11mol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺 鹽酸鹽(23g，0..12mol)，冰浴至0℃下后，加入N，N-二異丙基乙基胺(25.8g，0.2mol)，攪拌10小時后，減壓蒸出溶劑，粗產(chǎn)品溶于氯仿(1000ml)，依次用飽和氯化銨溶液、飽和氯化鈉溶液及水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓蒸出溶劑得到的粗產(chǎn)品經(jīng)重結(jié)晶(按體積比計，二氯甲烷：乙酸乙酯＝1:1)純化后得到白色固體III，即Fmoc-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(42.4g，收率：55.4％)。4)L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(IV)的合成將Fmoc-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(7.65g，0.01mol)溶于二氯甲烷(100mL)和N，N-二甲基甲酰胺(100mL)的混合溶液中，加入哌啶(40ml)，室溫下攪拌5小時后，減壓蒸出溶劑，然后置于真空干燥箱高真空干燥除去少量的哌啶，得到IV，即L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu，為淡黃色固體，未經(jīng)純化直接用于下一步。5)Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(V)的合成將上步所得L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu粗產(chǎn)品溶于N，N-二甲基甲酰胺(200mL)中，加入Cbz-L-Ala-L-Ala-OH(2.94g，0.012mol)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(6.07g，0.016mol)，冰浴至0℃下后加入N，N-二異丙基乙基胺(2.6g，0.02mol)，室溫下攪拌過夜，減壓蒸除溶劑，殘余物溶于氯仿(100ml)，依次用飽和氯化銨溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾后，蒸除溶劑，所得粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析(按體積比計，二氯甲烷：甲醇＝50:1—20:1)后得到化合物V，即Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu為白色固體(3.1g，二步總收率：37.8％)。6)L-Ala-LAla-L-Asn(Trt)-Leu-OtBu(VI)的合成將Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(10g，12.2mmol)溶于甲醇(400mL)中，加入10％鈀炭(1g)，通入氫氣，常溫常壓下攪拌反應(yīng)4小時，過濾除去鈀炭，用甲醇洗滌，合并濾液和洗液，減壓蒸除溶劑得到VI，即L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu，為白色固體(7.6g，收率：91％)。7)Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(Ⅶ)的合成Lactobionicacid+L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu→Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBuVIVII將乳糖酸(2.0g，5.6mmol)溶于甲醇(100ml)中，升溫至回流，反應(yīng)24小時后，冷卻至室溫。將L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(1g，1.5mmol)溶解于甲醇(10ml)中，室溫滴加至乳糖酸的甲醇溶液中。滴加完畢后，升溫至55℃，反應(yīng)過夜。蒸干反應(yīng)液，粗品用反相制備純化，得到Ⅶ，即Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu，為白色固體(0.35g，收率24％)。8)Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH(VIII)的合成將化合物L(fēng)acto-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-OtBu(0.35g，0.34mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，室溫下攪拌1小時后，減壓蒸除溶劑，殘留物用甲基叔丁基醚洗滌三次，抽濾，干燥，得到白色固體VIII，即Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH(0.23g，收率：93％)9)Lacto-AANL-Doxorubicin(S1)的合成將Lacto-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH(2.3g，0.32mmol)和DIPEA(1.23g)用干燥的N，N-二甲基甲酰胺(10mL)溶解，冷卻至0℃下加入苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(1.8g)，攪拌半小時，加入多柔比星(即阿霉素)鹽酸鹽(1.72g)，避光下反應(yīng)溫度緩慢升高至室溫下攪拌3小時，反應(yīng)液用反相制備純化得到目標(biāo)產(chǎn)物S1，即Lacto-AANL-DOX，為紅色固體粉末(收率：55％)。S2，S3，S4，S5和S6的合成方法與S1類似，只是氨基酸連接時原料不同，如下表10所示，S7和S8的合成方法與S1類似，只是合成時使用的阿酶素分別替換為表阿酶素和吡喃阿霉素。將對應(yīng)的R1氨基酸和R2氨基酸溶于N，N-二甲基甲酰胺中，分別加入相同的縮合劑(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)反應(yīng)，于0℃-25℃反應(yīng)0.5-2h，再加入天門冬酰胺，于0℃-25℃反應(yīng)2-24h得到三肽。質(zhì)譜(MS)檢測結(jié)果確認(rèn)S1-S8化合物(n＝1)分子量依次如下表，與結(jié)構(gòu)計算預(yù)測的分子量相一致。表10實施例12：藥品處理本發(fā)明化合物S1～S8(實施例11制得)和對照化合物C1，C2，C3經(jīng)過冷凍干燥(-70℃)，在無菌室進(jìn)行分裝。在動物實驗前，S1～S8在無菌室中可用注射用水溶解，再用注射用水稀釋到所需濃度。S1，S2，S3，S4，S5、S6、S7和S8使用分析型HPLC(安捷倫1220，C8柱5μm，4.6mmIDx250mm，流動相為0～95％乙腈(ACN)測得純度在95％-99％。盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過上述優(yōu)選實施例作了詳細(xì)介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到上述的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求來限定。當(dāng)前第1頁1 2 3