本發(fā)明涉及影像學(xué)診斷造影劑,尤其是一種腫瘤靶向核磁共振/熒光雙模態(tài)成像造影劑及其制備方法和在核磁共振成像和近紅外熒光成像中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在癌癥發(fā)生的早期，如果能迅速精確地檢測(cè)出病變器官或組織的生理形態(tài)學(xué)變化，并給出相應(yīng)的影像學(xué)信息，對(duì)癌癥的早期診斷具有非常重大的意義。造影劑就是這樣一類(lèi)物質(zhì)，通過(guò)注入到人體特定的組織或器官，使之與正常組織部位產(chǎn)生密度或其他差異，并將這些差異進(jìn)行顯影，從而提供關(guān)于疾病重要的臨床信息。

核磁共振成像(Magnetic Resonance imaging，MRI)是利用體液或組織中水分子或富氫小分子的氫核在外加磁場(chǎng)及特定射頻脈沖的作用下產(chǎn)生共振來(lái)成像的一種技術(shù)。臨床上，對(duì)體內(nèi)某一結(jié)構(gòu)或器官內(nèi)的異常病灶進(jìn)行磁共振成像掃描檢查時(shí)，為了增強(qiáng)異常病灶的顯影效果，提高測(cè)試儀器的對(duì)病變組織的分辨率，往往通過(guò)靜脈注射造影劑進(jìn)行增強(qiáng)掃描成像。目前常用的磁共振造影劑-釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)缺乏與腫瘤組織識(shí)別的特異性。因此，提高磁共振造影劑的腫瘤靶向能力，是增強(qiáng)核磁共振成像對(duì)比度的關(guān)鍵步驟。

近紅外熒光成像(Near-infrared fluorescence imaging)以其成像靈敏、快速等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域。其方法是將具有由近紅外波長(zhǎng)的激發(fā)光照射能發(fā)出熒光的造影劑進(jìn)行生物體成像，從而反應(yīng)病變組織的生理學(xué)變化。近紅外熒光造影劑的發(fā)射光位于近紅外波段(600-900nm)，有效避開(kāi)了內(nèi)體水、有氧及無(wú)氧血紅蛋白等主要組織的吸收波長(zhǎng)，具有良好的生物組織穿透能力，并且對(duì)組織無(wú)損傷。臨床常用的近紅外熒光造影劑為吲哚菁綠ICG，是目前唯一一個(gè)被FDA批準(zhǔn)認(rèn)證可用于人體的近紅外熒光染料，應(yīng)用于心輸出量、肝功能、眼底造影等方面的檢測(cè)。但吲哚菁綠體內(nèi)代謝速度快，光及熱穩(wěn)定性差，且無(wú)腫瘤特異性檢測(cè)，使其應(yīng)用受到限制。

隨著分子影像學(xué)方法的不斷發(fā)展，結(jié)合多種成像方式的雙模態(tài)或多模態(tài)分子探針受到人們的青睞，這類(lèi)探針可同時(shí)用于不同影像設(shè)備的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)多種顯像模式的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，對(duì)于復(fù)雜疾病可以提供更為全面的診斷學(xué)信息，其中基于核磁共振成像及近紅外成像的MRI/NIR雙模態(tài)探針同時(shí)具有MRI高空間分辨率、NIR高靈敏度且成像迅速的特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)診斷中具有非常重要的意義。

2003年美國(guó)馬薩諸塞州總醫(yī)院和哈佛醫(yī)學(xué)院分子成像中心研究人員首次將近紅外染料Cy5.5共價(jià)接枝到葡聚糖包裹Fe₂O₃磁性中心得到MRI/NIR雙模態(tài)探針Cy5.5-CLIO，并用于小鼠腦部膠質(zhì)瘤的適時(shí)定位監(jiān)測(cè)(Kircher.M.F.et al. CANCER RESEARCH.2003,63,8122–8125)。然而，該探針的水合粒徑為32nm，易聚集，且探針缺乏腫瘤靶向性。隨著MRI/NIR雙模態(tài)探針的不斷發(fā)展,具有MRI高弛豫率/熒光效率高、生物相容性好、安全低毒，可特異性靶向腫瘤的雙模態(tài)探針越來(lái)越成為研究的熱點(diǎn)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤靶向核磁共振/熒光雙模態(tài)成像造影劑及其制備方法和在核磁共振成像和近紅外熒光成像中的應(yīng)用，制備得到的造影劑具有較高的MRI弛豫率、NIR熒光效能以及腫瘤靶向識(shí)別能力，并且具有好的生物相容性和穩(wěn)定性。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種腫瘤靶向核磁共振/熒光雙模態(tài)成像造影劑，該造影劑由核磁共振雙親分子，近紅外熒光染料雙親分子及腫瘤靶向雙親分子通過(guò)自組裝形成，具體為在水溶液中超聲自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)。

所述造影劑為納米粒，粒徑范圍為20-40nm，組裝體的分子量范圍為500-1000Da，適合的pH值范圍為6-8。

所述的核磁共振成像雙親分子，結(jié)構(gòu)式如下，

是由順磁性物質(zhì)與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子進(jìn)行反應(yīng)所得的產(chǎn)物，所述核磁共振成像雙親分子的分子量范圍500-1000Da。

所述的近紅外熒光染料雙親分子，結(jié)構(gòu)式如下，

是由近紅外熒光染料與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子進(jìn)行反應(yīng)所得的產(chǎn)物，分子量范圍500-1000Da。

所述的腫瘤靶向雙親分子，結(jié)構(gòu)式如下，

為腫瘤特異性親和分子與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子進(jìn)行反應(yīng)所得的產(chǎn)物，分子量范圍500-1000Da。

核磁共振雙親分子：近紅外熒光染料雙親分子：腫瘤靶向雙親分子之間的摩爾比范圍為5:5:1-40:5:1，優(yōu)選摩爾比范圍為5:5:1-20:5:1，最佳摩爾比范圍5:5:1-10:5:1。

所述的核磁共振雙親分子是由順磁性物質(zhì)與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子進(jìn)行反應(yīng)所得的產(chǎn)物；所述的近紅外熒光染料雙親分子是由近紅外熒光染料與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子進(jìn)行反應(yīng)所得的產(chǎn)物；所述的腫瘤靶向雙親分子是腫瘤特異性親和分子與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子進(jìn)行反應(yīng)所得的產(chǎn)物。

所述的順磁性物質(zhì)是含有釓的造影劑；所述的近紅外熒光染料為菁染料(Cyanine)、含四吡咯基團(tuán)的近紅外熒光染料、咕噸類(lèi)熒光染料、方酸衍生物、噻嗪類(lèi)和嗯嗪類(lèi)近紅外熒光染料、二氟化硼-二吡咯甲烷熒光染料中的一種；所述的腫瘤特異性親和分子是葉酸,多肽,單克隆抗體中的一種。

所述的帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子是十六胺、雙十六胺、碳十八烷胺、磷脂、腦磷脂中的一種。

一種情況是：順磁性物質(zhì)為Gd-DOTA或Gd-DTPA；近紅外熒光染料為菁染料Cy系列熒光染料Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，腫瘤特異性親和分子為葉酸。

本發(fā)明所述的順磁性物質(zhì)、近紅外熒光染料、腫瘤特異性親和分子可以選擇市售購(gòu)買(mǎi)，根據(jù)需要自行制備或者在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，根據(jù)具體要求進(jìn)行選擇，以符合本發(fā)明所要制備造影劑的性能。

本發(fā)明所述造影劑的制備方法為：

步驟a)制備核磁共振雙親分子：順磁性物質(zhì)與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子反應(yīng)，得核磁共振雙親分子；

步驟b)制備近紅外熒光染料雙親分子：取近紅外熒光染料與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子反應(yīng)，產(chǎn)物通過(guò)柱層析純化，真空干燥得近紅外熒光染料雙親分子；

步驟c)制備腫瘤靶向雙親分子：腫瘤特異性親和分子與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子反應(yīng)，真空干燥得腫瘤靶向雙親分子；

步驟d)制備腫瘤靶向核磁共振及近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑：將核磁共振雙親分子、近紅外熒光染料雙親分子腫瘤靶向雙親分子在有機(jī)溶劑中混合后充分?jǐn)嚢?，旋蒸除去有機(jī)溶劑，加入超純水，超聲,既得腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑。

具體的制備方法為:

步驟a)制備核磁共振雙親分子：順磁性物質(zhì)與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子，在室溫堿性條件下反應(yīng)，真空干燥得核磁共振雙親分子，所述堿為三乙胺或N，N-二異丙基乙胺(DIPEA),堿的加入量為順磁性物質(zhì)摩爾量的3-10倍；

步驟b)制備近紅外熒光染料雙親分子：取近紅外熒光染料與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子溶于有機(jī)溶劑中，在堿性條件下,氮?dú)獗Ｗo(hù)60-90℃回流，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)柱層析純化，真空干燥得近紅外熒光染料雙親分子，所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺(DMF)或甲苯；所述堿為三乙胺或N，N-二異丙基乙胺(DIPEA),堿的加入量為近紅外染料摩爾量的3-10倍；

步驟c)制備腫瘤靶向雙親分子：腫瘤特異性親和分子中的羧基與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下生成N-羥基琥珀酰亞胺羧酸酯，將帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子加入到上述活性酯中，室溫堿性條件下反應(yīng)，乙醚或石油醚沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得腫瘤靶向雙親分子；所述堿為三乙胺或N，N-二異丙基乙胺(DIPEA),堿的加入量為腫瘤特異性親和分子摩爾量的3-10倍；

步驟d)制備腫瘤靶向核磁共振及近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑：分別取核磁共振雙親分子與近紅外熒光染料雙親分子溶于甲醇或丙酮中，取腫瘤靶向雙親分子溶于四氫呋喃(THF)或丙酮中，將三種溶液混合之后充分?jǐn)嚢?，旋蒸除去有機(jī)溶劑，然后加入超純水，超聲,既得腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑。

本發(fā)明提供一種制備方法，但并不限制于此方法的保護(hù)范圍，具體為：

步驟a)制備核磁共振雙親分子：DOTA或DTPA溶于有機(jī)溶劑中，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，生成N-羥基琥珀酰亞胺羧酸酯，將帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子加入到上述活性酯中，同時(shí)加入三乙胺或N，N-二異丙基乙胺(DIPEA),室溫條件下反應(yīng)，抽濾，石油醚或乙醚洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得到沉淀；三氟乙酸(TFA)作用下脫去順磁性物質(zhì)中羧基保護(hù)基，水溶液中加熱條件下，與水合醋酸釓或氯化釓螯合后，真空干燥得核磁共振雙親分子；

步驟b)制備近紅外熒光染料雙親分子：取近紅外熒光染料與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子溶于二甲基甲酰胺(DMF)或甲苯溶劑中，同時(shí)加入三乙胺或N，N-二異丙基乙胺(DIPEA),氮?dú)獗Ｗo(hù)下60-90℃回流，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)柱層析純化，真空干燥得近紅外熒光染料雙親分子；

步驟c)制備腫瘤靶向雙親分子：腫瘤特異性親和分子中的羧基與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下生成N-羥基琥珀酰亞胺羧酸酯，將帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子加入到上述活性酯中，同時(shí)加入三乙胺或N，N-二異丙基乙胺(DIPEA),室溫條件下反應(yīng)，乙醚或石油醚沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得腫瘤靶向雙親分子；

步驟d)制備腫瘤靶向核磁共振及近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑：分別取核 磁共振雙親分子與近紅外熒光染料雙親分子溶于甲醇或丙酮中，取腫瘤靶向雙親分子溶于四氫呋喃(THF)或丙酮中，將三種溶液混合之后充分?jǐn)嚢瑁舫ビ袡C(jī)溶劑，然后加入超純水，超聲,既得腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑。

其中，步驟a)中室溫條件下反應(yīng)時(shí)間為8-12h，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷或乙腈；步驟b)中氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流8-12h；步驟c)中室溫條件下反應(yīng)24-48h，步驟d)中，超聲時(shí)間范圍20-40min。

在本發(fā)明造影劑的制備過(guò)程中：順磁性物質(zhì)與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子的摩爾比范圍為1:1-1:5；紅外熒光染料與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子的摩爾比范圍為1:5-1:10；腫瘤特異性親和分子與帶有氨基或羧基的單鏈或雙鏈分子摩爾比范圍為1:1-3:1。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：

本發(fā)明腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑，由核磁共振雙親分子、近紅外熒光雙親分子和腫瘤靶向雙親分子在水溶液中超聲自組裝形成的囊泡形納米結(jié)構(gòu)，通過(guò)該方法得到的雙模態(tài)探針粒徑分布均一且有較好的穩(wěn)定性。近紅外熒光染料的應(yīng)用大大提高了雙模態(tài)探針的熒光性能，同時(shí)腫瘤靶向雙親分子與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的親和力，可以有效實(shí)現(xiàn)靶向顯影。

此外，腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑可用在腫瘤切除術(shù)中集術(shù)前磁共振診斷，術(shù)中熒光引導(dǎo)切除及術(shù)后核磁共振療效評(píng)價(jià)等多重功能于一體，其能夠在生理pH條件下穩(wěn)定存在，并能特異性蓄積靶向腫瘤部位，顯著增強(qiáng)腫瘤病灶部位的MRI信號(hào)強(qiáng)度和近紅外熒光信號(hào)強(qiáng)度，提高核磁共振成像及近紅外熒光成像掃描的特異性及敏感性，有望作為造影劑用于腫瘤切除手術(shù)術(shù)中熒光引導(dǎo)及術(shù)后核磁共振監(jiān)測(cè)。

該腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑具有高的弛豫率、優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，較低的毒副作用，較高的量子產(chǎn)率以及較好的光穩(wěn)定性等特點(diǎn)，可以有效應(yīng)用于活細(xì)胞和活體的磁共振成像和熒光成像。

附圖說(shuō)明

圖1為腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑的透射電鏡結(jié)果圖；

圖2為腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑的粒徑分布圖；

圖3為腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑的水合粒徑及粒徑穩(wěn)定性結(jié)果圖；

圖4為腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑的核磁共振成像結(jié)果圖；

圖5為腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑的弛豫率結(jié)果圖；

圖6為腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑的吸收和發(fā)射光譜圖；

圖7為腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑在異位膠質(zhì)瘤裸 鼠模型體內(nèi)核磁共振成像結(jié)果圖；

圖8為腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑在異位膠質(zhì)瘤裸鼠模型體內(nèi)近紅外熒光成像結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，其中的原料為實(shí)驗(yàn)室制備，但并不影響本發(fā)明對(duì)權(quán)利要求所要保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

腫瘤靶向核磁共振及近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑制備：

(1)制備核磁共振雙親分子：取1.0026g三叔丁基1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)溶于二氯甲烷(DCM)，與0.2448g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在1.8087g二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下室溫活化2h，然后加入0.5065g十六胺，室溫條件下攪拌反應(yīng)12h，抽濾后用大量乙醚沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得乳白色粉末；再加入到三氟乙酸(TFA)與DCM的混合液中，攪拌反應(yīng)2h，旋蒸除去反應(yīng)溶劑，用石油醚清洗反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得白色油狀物；將白色油狀物在水中復(fù)溶，同時(shí)加入0.3481g水合醋酸釓，調(diào)溶液pH至5-6，90℃反應(yīng)2h，真空干燥得核磁共振雙親分子。

(2)制備近紅外熒光染料雙親分子：取16.75g三氯氧磷與2.499g環(huán)己酮溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和DCM的混合液中，80℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流3h，反應(yīng)產(chǎn)物在水中重結(jié)晶，真空干燥得中間產(chǎn)物1；取2.225g 2,3,3-三甲基吲哚與1.875g碘丙酸溶于甲苯中，100℃氮?dú)饣亓?h，乙醚、丙酮混合液萃取反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得中間產(chǎn)物2；取中間產(chǎn)物1(0.532g)和2(2.204g)溶于甲苯和DMF混合溶劑，160℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流10h，反應(yīng)產(chǎn)物在乙醚和水相中萃取，真空干燥得墨綠色固體近紅外染料Cy7，取0.7011g Cy7與2.333g十六胺溶于DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下70℃回流10h，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)柱層析純化，真空干燥得近紅外熒光染料雙親分子。

(3)制備腫瘤靶向雙親分子：取1.0034g葉酸溶于二甲基亞砜(DMSO)中，葉酸與0.2970g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在2.2343g二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下活化12h，向葉酸活性酯中加入含有0.5094g十六胺的乙酸乙酯溶液，室溫下避光攪拌反應(yīng)24h，乙醚沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得腫瘤靶向雙親分子。

(4)制備腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑：分別取核磁共振雙親分子與近紅外熒光染料雙親分子溶于甲醇中，取腫瘤靶向雙親分子溶于四氫呋喃(THF)中，將三種溶液混合之后充分?jǐn)嚢瑁舫ビ袡C(jī)溶劑，然后加入超純水，超聲40min即得腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑。其中，所用三種基元摩爾比為核磁共振雙親分子：近紅外熒光雙親分子：腫瘤靶向雙親分子＝5:5:1。

實(shí)施例2

腫瘤靶向核磁共振及近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑制備：

(1)制備核磁共振雙親分子：取1.0026g三叔丁基1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二 烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)溶于二氯甲烷(DCM)，與0.2448g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在1.8087g二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下室溫活化2h，然后加入0.5660g碳十八烷胺，室溫條件下攪拌反應(yīng)12h，抽濾后用大量乙醚沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥；再加入到三氟乙酸(TFA)與DCM的混合液中，攪拌反應(yīng)2h，旋蒸除去反應(yīng)溶劑，用石油醚清洗反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得白色油狀物；將白色油狀物在水中復(fù)溶，同時(shí)加入水合醋酸釓，調(diào)溶液pH至5-6，90℃反應(yīng)2h，真空干燥得核磁共振雙親分子。

(2)制備近紅外熒光染料雙親分子：取實(shí)施例1中制備的Cy7 0.5g與1.886g碳十八烷胺溶于DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下70℃回流10h，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)柱層析純化，真空干燥得近紅外熒光染料雙親分子。

(3)制備腫瘤靶向雙親分子：取1g葉酸溶于二甲基亞砜DMSO中，葉酸與0.2970g N-羥基琥珀酰亞胺NHS在2.2343g二環(huán)己基碳二亞胺DCC作用下活化12h，向葉酸活性酯中加入含有0.5660g碳十八烷胺的乙酸乙酯溶液，室溫下避光攪拌反應(yīng)24h，乙醚沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得腫瘤靶向雙親分子。

(4)制備腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑：分別取核磁共振雙親分子與近紅外熒光染料雙親分子溶于甲醇中，取腫瘤靶向雙親分子溶于四氫呋喃THF中，將三種溶液混合之后充分?jǐn)嚢?，旋蒸除去有機(jī)溶劑，然后加入超純水，超聲40min即得腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑。其中，所用三種基元摩爾比為核磁共振雙親分子：近紅外熒光雙親分子：腫瘤靶向雙親分子＝5:5:1。

實(shí)施例3

腫瘤靶向核磁共振及近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑制備：

(1)制備核磁共振雙親分子：取1.0026g三叔丁基1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)溶于二氯甲烷(DCM)，與0.2448g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在1.8087g二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下室溫活化2h，然后加入1.571g磷脂，室溫條件下攪拌反應(yīng)12h，抽濾后用大量乙醚沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥；再加入到三氟乙酸(TFA)與DCM的混合液中，攪拌反應(yīng)2h，旋蒸除去反應(yīng)溶劑，用石油醚清洗反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得白色油狀物；將白色油狀物在水中復(fù)溶，同時(shí)加入水合醋酸釓，調(diào)溶液pH至5-6，90℃反應(yīng)2h，真空干燥得核磁共振雙親分子。

(2)制備近紅外熒光染料雙親分子：取實(shí)施例1中制備的Cy7 0.5g與5.150g磷脂溶于DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下70℃回流10h，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)柱層析純化，真空干燥得近紅外熒光染料雙親分子。

(3)制備腫瘤靶向雙親分子：取1g葉酸溶于二甲基亞砜DMSO中，葉酸與0.2970g N-羥基琥珀酰亞胺NHS在2.2343g二環(huán)己基碳二亞胺DCC作用下活化12h，向葉酸活性酯中加入含有1.571g磷脂的乙酸乙酯溶液，室溫下避光攪拌反應(yīng)24h，乙醚沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，真空干燥得腫瘤靶向雙親分子。

(4)制備腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑：分別取核磁 共振雙親分子與近紅外熒光染料雙親分子溶于甲醇中，取腫瘤靶向雙親分子溶于四氫呋喃THF中，將三種溶液混合之后充分?jǐn)嚢?，旋蒸除去有機(jī)溶劑，然后加入超純水，超聲40min即得腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑。其中，所用三種基元摩爾比為核磁共振雙親分子：近紅外熒光雙親分子：腫瘤靶向雙親分子＝5:5:1。

實(shí)施例4

非靶向核磁共振及近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑制備

分別取實(shí)施例1中制備的核磁共振雙親分子與近紅外熒光染料雙親分子溶于甲醇中，將兩種溶液混合之后充分?jǐn)嚢?，旋蒸除去有機(jī)溶劑，然后加入超純水，超聲40min既得核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑，用于對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。其中，所用來(lái)那個(gè)中基元摩爾比為核磁共振雙親分子：近紅外熒光雙親分子＝1:1。

實(shí)施例5

造影劑的形貌與粒徑分布表征：

實(shí)施例1制備的造影劑利用透射電鏡表征其形貌和粒徑分布。將樣品溶液滴加至銅網(wǎng)上，磷鎢酸負(fù)染5-10min，在透射電子顯微鏡(JEM-2100日本電子株式會(huì)社)下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2，顯示本發(fā)明造影劑為球形，分散均一，粒徑為25±5nm。

實(shí)施例6

造影劑的水合粒徑測(cè)定：

將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的造影劑利用激光粒度儀對(duì)其水合粒徑進(jìn)行測(cè)定。將樣品溶液稀釋后于激光粒度儀(Beckman-CoulterLS-100Q，美國(guó))下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3，顯示本發(fā)明造影劑的水合粒徑為80±10nm，用于對(duì)照的實(shí)施例2制備的造影劑水合粒徑為80±5nm，粒徑分布較窄。

實(shí)施例7

造影劑的穩(wěn)定性測(cè)定：

將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的造影劑利用激光粒度儀對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。將樣品溶液用生理鹽水稀釋后于室溫下靜置不同的時(shí)間，然后利用激光粒度儀(Beckman-CoulterLS-100Q，美國(guó))測(cè)定其水合粒徑來(lái)判斷其穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)圖3，顯示造影劑在生理鹽水中穩(wěn)定性良好，沒(méi)有發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象。

實(shí)施例8

造影劑的核磁共振成像：

將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的造影劑利用核磁共振掃描儀對(duì)其核磁共振成像能力進(jìn)行測(cè)定。將樣品用水稀釋成不同濃度，放入1.5ml EP管中，利用小動(dòng)物核磁共振成像系統(tǒng)(MiniMR-Rat蘇州)測(cè)定不同濃度造影劑的成像能力。結(jié)果見(jiàn)圖4，圖4為腫瘤靶向核磁共振和近紅外熒光雙模態(tài)成像造影劑的核磁共振成像結(jié)果圖,途中第一排為實(shí)施例1制備的造影劑,第二排為實(shí)施例2制備的對(duì)照組造影劑，顯示實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組造影劑均具有良好的核磁共振成像能力, 隨著造影劑濃度增加,核磁共振信號(hào)顯著增強(qiáng)；

顯示兩種造影劑均有良好的成像能力，隨著造影劑濃度的增加，可以使核磁共振信號(hào)值顯著增加。

實(shí)施例9

造影劑的弛豫率測(cè)定：

將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的造影劑利用核磁共振掃描儀對(duì)其弛豫率進(jìn)行測(cè)定。將樣品用水稀釋成不同濃度，放入1.5mlEP管中，利用小動(dòng)物核磁共振成像系統(tǒng)(MiniMR-Rat蘇州)測(cè)定不同濃度造影劑T1弛豫時(shí)間，然后計(jì)算造影劑的弛豫率(r1)。結(jié)果見(jiàn)圖5，圖中直線(xiàn)1為實(shí)施例1制備的造影劑,直線(xiàn)2為實(shí)施例2制備的對(duì)照組造影劑，顯示兩種造影劑的弛豫率分別為11.87mM-1s-1和9.27mM^-1s^-1。

實(shí)施例10

造影劑的吸收譜與熒光發(fā)射光譜測(cè)定：

將實(shí)施例1制備的造影劑利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津2550，日本)測(cè)定其吸收光譜，利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(MK50101-EX，CRI，USA)測(cè)定其發(fā)射光譜。結(jié)果見(jiàn)圖6，圖中曲線(xiàn)1為本造影劑的吸收光譜,曲線(xiàn)2為本造影劑的發(fā)射光譜，顯示本造影劑的最大吸收及最大發(fā)射位置,該造影劑斯托克斯位移達(dá)到140nm，具有良好的近紅外成像性能、熒光性能。

實(shí)施例11

造影劑在膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移裸鼠模型體內(nèi)磁共振成像能力測(cè)定：

將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的造影劑利用小動(dòng)物核磁共振成像系統(tǒng)(MiniMR-Rat蘇州)對(duì)其在異位膠質(zhì)瘤裸鼠模型體內(nèi)的核磁共振成像進(jìn)行測(cè)定。所用裸鼠為雌性BALB/c-nu小鼠(大連醫(yī)科大學(xué)提供，體重20-25g)。在裸鼠的右后背部皮下注入2×106個(gè)細(xì)胞，約10天后瘤直徑達(dá)到5mm×5mm用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。裸鼠腫瘤模型8只，隨機(jī)分為2組，一組為實(shí)驗(yàn)組，尾靜脈注射經(jīng)生理鹽水稀釋的本發(fā)明造影劑，按照0.05mmol[Gd]/kg體重注射；一組為對(duì)照組，尾靜脈注射經(jīng)生理鹽水稀釋的實(shí)施例2制備的造影劑，按照0.05mmol[Gd]/kg體重注射。分別在注射前和注射后3、10、24、48、72、96、120及144小時(shí)進(jìn)行核磁共振掃描成像。結(jié)果見(jiàn)圖7，其中,第一行為本造影劑注射異位膠質(zhì)瘤裸鼠模型小鼠體內(nèi)核磁共振成像結(jié)果圖，顯示注射前及注射后的1到6天時(shí)間內(nèi)腫瘤區(qū)域核磁共振信號(hào)隨時(shí)間變化明顯；第二行為實(shí)施例2制備的對(duì)照組造影劑注射異位膠質(zhì)瘤裸鼠模型小鼠體內(nèi)核磁共振成像結(jié)果圖顯示注射前及注射后的1到6天時(shí)間內(nèi)腫瘤區(qū)域核磁共振信號(hào)隨時(shí)間有變化,但變化不如實(shí)驗(yàn)組明顯。

實(shí)施例12

造影劑在膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移裸鼠模型體內(nèi)近紅外熒光成像能力測(cè)定：

將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的造影劑利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(MK50101-EX，CRI，USA)對(duì)其在異位膠質(zhì)瘤裸鼠模型體內(nèi)的熒光成像能力進(jìn)行測(cè)定。實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組與實(shí)施例9中保持一致。結(jié)果見(jiàn)圖8，其中,第一行為本造影劑注射異位膠質(zhì)瘤裸鼠模型小鼠體內(nèi)近紅外熒光成像結(jié)果圖,顯示注射前及注射后的1到6天時(shí)間內(nèi)腫瘤區(qū)域近紅外熒光信號(hào)隨時(shí)間變化明顯，腫瘤邊界清晰可見(jiàn)；第二行為實(shí)施例2制備的對(duì)照組造影劑注射異位膠質(zhì)瘤裸鼠模型小鼠體內(nèi)近紅外熒光成像結(jié)果圖,顯示注射前及注射后的1到6天時(shí)間內(nèi)腫瘤區(qū)域近紅外熒光信號(hào)隨時(shí)間有變化,但變化不如實(shí)驗(yàn)組明顯。

以上所述實(shí)施例并不限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。