本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀，本發(fā)明還涉及干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀的制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

靶向治療以其特異性殺滅腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)成為了一種極具臨床應(yīng)用前景的腫瘤治療手段。它是以細(xì)胞受體、關(guān)鍵基因和調(diào)控分子為靶點(diǎn)，利用具有一定特異性的載體，將治療藥物或其他活性物質(zhì)選擇性地運(yùn)送到靶點(diǎn)，不影響正常細(xì)胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減少毒副作用的一種治療方案。近年來(lái)，人們運(yùn)用抗體、多肽、核酸適配體等生物分子對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的識(shí)別構(gòu)建了種類(lèi)繁多的生物分子靶向策略，通常是通過(guò)全身給藥的方式，經(jīng)血液循環(huán)輸送，運(yùn)用靶向分子對(duì)腫瘤的選擇性，以提高藥物在腫瘤部位的富集濃度。一系列生物分子靶向藥物相繼開(kāi)發(fā)出來(lái)，有的逐漸應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。

然而，目前使用的靶向治療策略存在諸多問(wèn)題，初步的臨床研究結(jié)果仍不理想，并未取得突出的療效。以腦膠質(zhì)瘤為例，主要有以下幾方面問(wèn)題：?jiǎn)我坏陌邢蛩幬镫y以滿(mǎn)足腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞高度異質(zhì)性而將其殺滅；靶向分子自身存在親和力較低和特異性不高等問(wèn)題；在靜脈給藥的輸送過(guò)程中靶向藥物易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲；以及由于血腦屏障和血腦膠質(zhì)瘤屏障的存在使物質(zhì)不能有效進(jìn)入腦膠質(zhì)瘤等因素，這使得靶向藥物無(wú)法完全滿(mǎn)足靶向治療的要求。因此，針對(duì)這些問(wèn)題，設(shè)計(jì)和研制新型靶 向治療方法成為當(dāng)務(wù)之急。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀，以解決上述問(wèn)題。

本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀，其特征在于，包括：磁力刀、以及神經(jīng)干細(xì)胞；所述磁力刀位于所述神經(jīng)干細(xì)胞的內(nèi)部；其中，所述磁力刀包括，納米盤(pán)本體，由鐵鎳合金制成；金層，分別位于所述納米盤(pán)本體的兩側(cè)，所述納米盤(pán)本體為正方形，其邊長(zhǎng)為2微米。

優(yōu)選的，本發(fā)明的磁力刀，還可以具有這樣的特征：其中，所述納米盤(pán)和所述鍍金層的總厚度為44-96納米。

優(yōu)選的，本發(fā)明的磁力刀，還可以具有這樣的特征：其中，所述金層的厚度是2-8nm。

優(yōu)選的，本發(fā)明的磁力刀，還可以具有這樣的特征：其中，所述納米盤(pán)本體的厚度是40-80nm。

本發(fā)明還提供一種制備干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、在硅片上旋涂光刻膠；

步驟二、將掩膜板放置在前烘過(guò)的光刻膠上層，使用紫外光照射，然后使用有機(jī)溶劑溶解和去除未暴露在此外光下的光刻膠；

步驟三、利用磁控濺射法沉積一層2nm-8nm的金，形成金層，然后沉積一層40-80nm的鐵鎳合金，最后沉積另一層2nm-8nm的金，形成另一個(gè)金層，從而形成中間一層為鐵鎳合金，兩面具有金層的磁力刀；

步驟四、在丙酮中進(jìn)行剝離操作，將磁力刀從所述硅片上剝離；

步驟五、將磁力刀與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)，使神經(jīng)干細(xì)胞吞噬磁力刀，從而使磁力刀進(jìn)入神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)，形成干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀。

優(yōu)選的，本發(fā)明的制備干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀的方法，還可以具有這樣的特征：其中，所述磁力刀與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，磁力刀的添加量為10-100顆粒/細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、將權(quán)利要求1中所述的磁力刀與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)，形成干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀；

步驟二、將干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀對(duì)腦腫瘤部分進(jìn)行原位注射；

步驟三、靜置24-72小時(shí)后，檢測(cè)磁力刀的分布范圍；

步驟四、向腫瘤部位施加旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)。

優(yōu)選的，本發(fā)明的干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀的使用方法，還可以具有這樣的特征：其中，所述旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)具有20赫茲的旋轉(zhuǎn)頻率和1特斯拉的強(qiáng)度。

本發(fā)明還提供上述的干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀在制備殺死腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的試劑中的應(yīng)用。

發(fā)明的有益效果

根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀，由于采用神經(jīng)干細(xì)胞作為靶向載體，因此本發(fā)明的磁力刀對(duì)腦腫瘤的趨向性更強(qiáng)。

另外，干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀，具有良好的組織整合性。結(jié)構(gòu)上易于宿主細(xì)胞整合，不會(huì)損傷正常組織。

第三，干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀，具有極低免疫源性。神經(jīng)干細(xì)胞不表達(dá)成熟細(xì)胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識(shí)別，有利于其存活。

第四，與多肽和抗體介入等常規(guī)的靶向策略相比，神經(jīng)干細(xì)胞載體具有主動(dòng)定向腦腫瘤和遠(yuǎn)距離遷移的能力等其它載體無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。

與傳統(tǒng)的放射療法和化學(xué)療法相比，這種磁性藥物介入的機(jī)械力治療手段有以下優(yōu)點(diǎn)：1.細(xì)胞對(duì)機(jī)械力敏感度高，易被破壞，避免了藥物對(duì)異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞作用的局限性；2.磁場(chǎng)對(duì)生物體有良好穿透性且對(duì)正常的生物組織的傷害極小，可重復(fù)治療；3.通過(guò)磁場(chǎng)定位作用局部物理靶向治療腦腫瘤，時(shí)間和空間上可控；4.磁性藥物可作為造影劑用于核磁共振成像來(lái)定位治療腦腫瘤。這種物理治療既能單獨(dú)應(yīng)用，也可與化療和影像等手段結(jié)合使用，具有廣泛的應(yīng)用前景。如何使磁性藥物靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞是磁誘導(dǎo)機(jī)械力治療腦腫瘤的關(guān)鍵問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1是制備磁力刀的示意圖；

圖2是電鏡下磁力刀的形態(tài)；

圖3是磁力刀從干細(xì)胞中釋放的情況；

圖4是劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖；

圖5是熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果；

圖6是在動(dòng)物體中干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式：

磁力刀的制備：

以Ni80Fe20合金為原料，通過(guò)光學(xué)平板刻法制備邊長(zhǎng)為2微米的鈉米盤(pán)本體。Ni80Fe20合金中鐵的含量為20％，鎳的含量為80％。制作步驟如圖1所示，

步驟一、在硅片12上旋涂光刻膠11。

步驟二、將掩膜板放置在前烘過(guò)的光刻膠11上層，使用紫外光照射，然后使用有機(jī)溶劑溶解和去除未暴露在此外光下的光刻膠。掩膜板上漏光區(qū)域應(yīng)與磁力刀的形狀相符，在本實(shí)施方式中，磁力刀為邊長(zhǎng)2微米的正方形，因此膜板上的漏光區(qū)域也為邊長(zhǎng)2微米的正方形。

步驟三、利用磁控濺射法沉積一層5nm的金，然后沉積一層60nm的鐵鎳合金作為納米盤(pán)本體，最后沉積另一層5nm的金，從而形成中間一層為鐵鎳合金，兩面具有金層的磁力刀13。磁力刀13為邊長(zhǎng)2微米的正方形。

步驟四、在丙酮中進(jìn)行剝離操作，將磁力刀13從硅片上剝離。

制備完成后，為確認(rèn)磁力刀的尺寸處于所需的范圍內(nèi)，運(yùn)用掃描透射電鏡確定材料的尺寸。如圖2所示，為電鏡下磁力刀的形態(tài)。

在其它的實(shí)施方式中，金層的厚度可以在2-8nm的范圍內(nèi)進(jìn)行選擇。鐵鎳合金層的厚度可以在40-80nm的范圍內(nèi)進(jìn)行選擇。

磁力刀與神經(jīng)干細(xì)胞的結(jié)合：

使用DMEM培養(yǎng)液對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)液中加2％的青霉素和鏈霉素作為抗生素(Cellgro,Mediatech,Inc.,Manassas,VA,USA)，以及10的胎牛血清。培養(yǎng)時(shí)間大于等于2小時(shí)后，磁力刀100％進(jìn)入神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明所使用的人神經(jīng)干細(xì)胞購(gòu)自Millipore(Temecula,CA)，

磁力刀的釋放：

如圖3所示，向神經(jīng)干細(xì)胞施加旋轉(zhuǎn)交變磁場(chǎng)后，磁力刀從神經(jīng)干細(xì)胞中釋放出來(lái)。磁場(chǎng)的條件控制在20赫茲的旋轉(zhuǎn)頻率和1特斯拉的強(qiáng) 度下。旋轉(zhuǎn)交變磁場(chǎng)使用環(huán)形電磁鐵進(jìn)行施加。通過(guò)磁場(chǎng)調(diào)控“磁力刀”在干細(xì)胞內(nèi)的機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)，產(chǎn)生機(jī)械力作用于干細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞的凋亡，從而釋放“磁力刀”。

神經(jīng)干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng)：

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了神經(jīng)干細(xì)胞介導(dǎo)的“磁力刀”可對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng)。

如圖4所示，劃痕實(shí)驗(yàn)分兩組進(jìn)行，對(duì)照組采用正常的人神經(jīng)干細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白的U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，兩種細(xì)胞分別置于劃痕的兩邊。實(shí)驗(yàn)組采用已融合磁力刀的人神經(jīng)干細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白的U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞兩種細(xì)胞也分別置于劃痕的兩邊。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的劃痕寬度相同。培養(yǎng)9小時(shí)后進(jìn)行觀(guān)察。如圖4中右側(cè)的圖像所示，9小時(shí)后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的神經(jīng)干細(xì)胞均向U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞方向進(jìn)行了遷移?？梢?jiàn)，在融合了磁力刀后，神經(jīng)干細(xì)胞仍然具有向U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞方向進(jìn)行定向遷移的行為。

運(yùn)用熒光素酶檢測(cè)(Luciferase assay)方法,證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞介導(dǎo)的“磁力刀”可在磁場(chǎng)作用下抑制腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。

熒光素酶檢測(cè)的過(guò)程如下：

(1)U87-GFP-Luc細(xì)胞與已經(jīng)裝載了磁力刀的神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)，然后每天在磁場(chǎng)下處理30分鐘，持續(xù)3天。

(2)共培養(yǎng)96小時(shí)后，細(xì)胞使用被動(dòng)裂解液(Promega Corp,Madison,WI)進(jìn)行裂解，然后在-80℃下放置1小時(shí)，然后置于室溫下直到溶解。

(3)向96孔板的每孔中加入5μL溶解產(chǎn)物，然后加入50μL熒光素酶底物，然后使用GloMax 20/20光度計(jì)(Promega Corp,Madison,WI)檢測(cè)發(fā)光情況。

結(jié)果如圖5所示，可見(jiàn)在使用干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀的處理后，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活率大幅下降。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀對(duì)腦膠質(zhì)瘤的靶向作用。

步驟一、建立腦膠質(zhì)瘤裸鼠模型：將2×10⁵個(gè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87懸浮在2.5μLPBS緩沖液中，運(yùn)用腦立體定位儀，經(jīng)顱骨缺口，用微量注射器將腫瘤細(xì)胞注射入裸鼠右側(cè)大腦尾狀核部，待7天后分組待用。U87細(xì)胞中已預(yù)先轉(zhuǎn)入熒火蟲(chóng)熒光素酶基因。

步驟二、將干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀原位注射至腫瘤部位。過(guò)72小時(shí)，取出腦部組織，研究磁力刀在腦腫瘤中的分布。干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀的用量為2×10⁵個(gè)，使用時(shí)懸浮在2.5μL PBS緩沖液中。

另外，單純使用磁力力刀對(duì)另一組腦膠質(zhì)瘤裸鼠模型的腫瘤部位進(jìn)行原位注射，作為對(duì)照組。

如圖6所示，單純使用磁力刀的一組，磁力刀僅分布于注射位置的原處。而使用神經(jīng)干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀一組，磁力刀分布與腫瘤細(xì)胞分布范圍一致?？梢?jiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向定位的效果。

干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀對(duì)腦膠質(zhì)瘤的殺傷作用：

在上述的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀對(duì)腦膠質(zhì)瘤的靶向作用實(shí)驗(yàn)中，還留有2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)以考查干細(xì)胞介導(dǎo)的磁力刀 對(duì)腦膠質(zhì)瘤的殺傷作用。

其中一組為對(duì)照組，不進(jìn)行旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)的處理，另一組為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行每日一次的旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)處理，磁場(chǎng)的參數(shù)為20Hz轉(zhuǎn)動(dòng)頻率、1特斯拉的強(qiáng)度，作用時(shí)間1h。連續(xù)處理7日。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞植入后21天，進(jìn)行成像，以檢測(cè)腫瘤情況。由于U87細(xì)胞表達(dá)熒火蟲(chóng)熒光素酶，因此成像時(shí)，腹腔注射D-熒光素，劑量：4.5毫克/動(dòng)物，將D-熒光素溶于150μL生理鹽水中進(jìn)行給藥。大腦內(nèi)的熒光素酶活性的空間分布使用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞在腦部區(qū)域存在的面積顯著縮小甚至消失。后續(xù)的生存期實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存期明顯延長(zhǎng)，至少為對(duì)照組小鼠的一倍以上。