本發(fā)明屬醫(yī)藥
技術領域：
：，涉及白細胞介素(il-22)抗體新的藥用用途，具體涉及白細胞介素(il-22)抗體用于制備治療子宮腺肌癥的藥物中的用途。經體外實驗和體內動物試驗發(fā)現，所述il-22中和性抗體可有效抑制子宮腺肌癥病灶血管生成和內膜增殖，進一步可用于制備治療子宮腺肌癥的藥物。
背景技術：
：：據統(tǒng)計報道，子宮腺肌病(adenomyosis，ad)是一種常見的婦科疾病，在育齡期婦女中的發(fā)病率約為8-27％，該疾患多發(fā)生于30-50歲婦女，其中，約15％同時合并子宮內膜異位癥，約半數合并子宮肌瘤。近年來，ad的發(fā)病率有上升和年輕化的趨勢。ad的定義是子宮內膜腺體和間質侵入子宮肌層形成彌漫或局限性的病變；實踐顯示，ad雖為良性病變，但卻有增生、種植浸潤及復發(fā)等惡性行為，致使其成為難治之癥。臨床實踐顯示，患者多呈現漸進性加重痛經和慢性盆腔痛，繼發(fā)性不孕或原發(fā)性不孕以致嚴重影響罹患該病的廣大女性的身心健康和生活質量，乃至整個家庭和社會的和諧。國內外的研究認為其病因可能與子宮缺乏黏膜下層有關，子宮黏膜下層缺乏可能引起子宮內膜基底層細胞增殖、侵襲至子宮肌層，并伴有周圍肌層細胞代償性增大從而形成了病灶，然而，迄今，對于ad的發(fā)病機制仍有太多的未解之謎。藥物和手術治療仍是目前主要的治療措施，但是單純病灶切除后疼痛緩解率低，復發(fā)率高。血管生成，從現有的血管網絡新生毛細血管的形成是營養(yǎng)物質和氧氣從現有的血管向遠處輸送的關鍵。血管生成屬生理過程(例如，胚胎發(fā)育和傷口愈合)以及病理過程(例如，心肌缺血、糖尿病視網膜病變、腫瘤的生長和轉移)的重要組成部分；新生血管已被認為是ad的主要病理特征，有研究發(fā)現ad患者子宮內膜和肌層的血管生成活性顯著升高；此外，宮腔鏡檢查發(fā)現近50％的ad患者內膜有異常血管生成。因此，研究者認為，血管生成在子宮內膜組織異位植入和隨后增殖生長過程中發(fā)揮著重要的作用。另研究顯示，在眾多的促血管因子中，vegf(血管內皮生長因子)是最有力的血管生長因子，它通過和血管內皮細胞的特異性受體結合，具有強大的促內皮增殖和促血管生長作用，其主要生物學功能有：通過活化磷脂酶c和刺激第二信使的形成直接促進血管內皮c的有絲分裂，在核酸和蛋白水平誘導纖溶酶原的降解，參與細胞外蛋白水解和基膜的降解，有利于血管內皮細胞的遷移和增生；增強血管通透性，促進包括纖維蛋白原在內的血漿蛋白的滲出，形成纖維素網絡，為血管芽延伸生長提供良好基質；大量研究已經證實ad異位內膜及在位內膜組織中vegf表達均明顯高于正常內膜。積累的證據表明，ad患者異位內膜可產生的多種細胞因子，在ad的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，如白細胞介素(il)-6，il-8，ccl2(也被稱為單核細胞趨化蛋白-1)和il-22。il-22是il-10細胞因子家族的成員，它參與抗微生物防御、保護和修復組織損傷及急性期反應，其受體由il-22r1和il-10r2兩個亞基組成，廣泛表達于各種器官和細胞類型。本發(fā)明人既往研究已經發(fā)現ad患者病灶間質細胞高表達il-22及其受體，可以自分泌的方式促進子宮內膜間質細胞(endometrialstromalcells,escs)的活力和生長。還有研究顯示，il-22刺激esc產生促血管因子il-6、vegf和il-8，這些促血管因子在血管生成中發(fā)揮重要作用，并有助于子宮腺肌病發(fā)病和進展。鑒于現有技術的現狀，本申情的發(fā)明人擬通過拮抗il-22可能具有抑制ad內膜esc的促血管生成能力，進而抑制ad的發(fā)病和進展的研究實驗，進一步評估拮抗il-22(如il-22中和性抗體)在治療ad中的潛在價值，進而提供白細胞介素(il-22)抗體在制備子宮腺肌癥(ad)藥物中新的用途。技術實現要素：本發(fā)明的目的是針對現有技術的缺陷，提供白細胞介素(il-22)抗體在制備子宮腺肌癥(ad)藥物中新的用途。本發(fā)明通過拮抗il-22可能具有抑制ad內膜esc的促血管生成能力，進而抑制ad的發(fā)病和進展的研究實驗，進一步評估拮抗il-22(如il-22中和性抗體)在治療ad中的潛在價值，并制備治療ad的藥物。本發(fā)明經體外實驗和體內動物試驗結果顯示，il-22中和性抗體能有效抑制子宮腺肌癥病灶血管生成和內膜增殖，表明il-22中和性抗體對子宮腺肌癥具有顯著的治療作用，可進一步用于制備治療子宮腺肌癥的藥物。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現：首選通過體外實驗建立ad內膜esc與huvecs(人臍靜脈內皮細胞系)的體外共培養(yǎng)體系，在培養(yǎng)體系中加入或不加入抗人il-22中和性抗體(5ug/ml，r&d公司)后，結果顯示，il-22中和性抗體明顯抑制esc對huvecs細胞活力和活化(cd105)的促進效應(如圖2所示，。此外，il-22中和性抗體顯著抑制esc培養(yǎng)上清對huvecs的血管形成的促進作用(如圖3和圖4所示)；進一步，本發(fā)明構建ad小鼠模型(如圖5所示)，腹腔注射抗鼠il-22中和性抗體(5ug/ml，r&d公司)，結果顯示，相對于對照組，il-22抗體注射組小鼠子宮重量明顯降低(table)、ad病灶血管密度明顯下降、且病灶內膜ki-67(增殖相關抗原)陽性水平明顯降低(如圖6所示)。本發(fā)明提供了il-22抗體用于制備治療子宮腺肌癥藥物的中用途，經體外實驗和動物實驗證實，il-22中和性抗體顯著抑制ad內膜血管形成和內膜增殖，可進一步用于制備治療子宮腺肌癥的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點在于，公開了一種通過拮抗細胞因子il-22的生物學作用，進而發(fā)揮抗ad內膜血管生成和esc增殖生長能力，為臨床實踐提供了ad的新的干預方案和新的治療藥物法。附圖說明圖1是il-22受體在ad異位病灶中表達，其中，箭頭所指是血管內皮細胞；originalmagnification:×400.。圖2是il-22抗體明顯抑制esc對huvecs細胞活力和活化的促進效應，其中，α-il-22：抗人il-22中和性抗體，esc：與子宮內膜間質細胞間接共培養(yǎng)組，esc+α-il-22：與子宮內膜間質細胞間接共培養(yǎng)+抗人il-22中和性抗體，*p<0.05,**p<0.01and***p<0.001。圖3是il-22抗體顯著抑制esc培養(yǎng)上清對huvecs的促血管生成能力，其中，tubeformation:成管指數(5個隨機視野下平均成管數量)，以對照組為1，各組成管指數＝1*實驗組平均成管數量/對照組平均成管數量，sesc：子宮內膜間質細胞培養(yǎng)上期處理組，esc+α-il-22：子宮內膜間質細胞培養(yǎng)上清+抗人il-22中和性抗體處理組，rhvegf：重組人vegf細胞因子處理組(陽性對照)。圖4是il-22抗體顯著抑制huvecs對esc細胞活力的促進作用，其中，ctrl-h：與huvecs間接共培養(yǎng)組，co-h：與經esc共培養(yǎng)后的huvecs間接共培養(yǎng)組，co+α-il-22-h：與經esc共培養(yǎng)并經抗人il-22中和性抗體刺激后的huvecs間接共培養(yǎng)組，esc+α-il-22：子宮內膜間質細胞培養(yǎng)上清+抗人il-22中和性抗體處理組，###p<0.001；$p<0.05and$$$p<0.001。圖5是免疫組織鑒定ad小鼠模型，其中，a：對照組小鼠，b：ad模型組，g：腺上皮細胞，s：內膜基質細胞，m：肌纖維細胞，箭頭所指：異位病灶。圖6是免疫組化染色證實il-22抗體明顯降低ad病灶血管密度和內膜增殖，a：對照ad小鼠組，b：ad小鼠+腹腔注射抗小鼠il-22中和性抗體(5ug/ml)組，箭頭：病灶紅色實心三角：病灶血管棕色染色：ki-67(核增殖抗原)，血管密度指數(theindexofvasculardensity)(5個隨機視野下平均血管數量)，以對照組為1，各組血管密度指數＝1*實驗組平均血管數量/對照組平均血管數量；leicaqwin圖像軟件系統(tǒng)分析ki-67+區(qū)域面積，以對照組為100，各組病灶ki-67+區(qū)域面積＝100*實驗組病灶平均ki-67+區(qū)域面積/對照組病灶平均ki-67+區(qū)域面積。具體實施方式實施例1體外實驗1)il-22受體在ad異位病灶中表達首先通過免疫組化(免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司)染色發(fā)現ad病灶內膜高表達和血管內皮中等程度表達il-22受體，il-22r1和il-10r2(il-22受體均購自r&d公司)(如圖1所示)；2)il-22抗體明顯抑制esc對huvecs細胞活力和活化的促進效應收集ad患者的內膜組織，通過iv膠原酶(sigma)消化并原代分離培養(yǎng)esc。建立esc和huvecs的間接共培養(yǎng)(transwell小室，corning),在共培養(yǎng)體系中加入或者不加入il-22中和性抗體(r&d公司)，并培養(yǎng)48小時。cck8(東仁化學公司)實驗顯示esc明顯促進huvecs細胞活力(如圖2a所示)和活化(cd105表達升高，如圖2b-2c所示)，但是il-22中和性抗體可明顯抑制這些效應；3)il-22抗體顯著抑制esc培養(yǎng)上清對huvecs的促血管生成能力收集esc培養(yǎng)72小時上清，利用matrigel成管實驗檢測esc培養(yǎng)上清及其il-22中和性抗體對huvecs成管的調節(jié)作用，如圖3所示，rhvegf(陽性對照)明顯促進血管形成，相對于對照組，esc培養(yǎng)上清顯著促進huvecs的血管形成，但是培養(yǎng)體系中加入il-22中和性抗體將明顯抑制這一作用，提示利用il-22抗體阻斷il-22信號可明顯抑制esc培養(yǎng)上清對huvecs的促血管生成效應，4)il-22抗體顯著抑制huvecs對esc細胞活力的促進作用收集與esc共培養(yǎng)或者同時加入il-22中和性抗體刺激48小時后的huvecs，將其與新鮮esc再進行間接共培養(yǎng)48小時，以未共培養(yǎng)處理的huvecs為對照，隨后流式檢測esc中增殖相關抗原ki-67和pcna的表達，如圖4所示，與未經共培養(yǎng)的huvecs相比，經esc共培養(yǎng)后的huvecs進一步上調esc中ki-67和pcna的表達，然后il-22抗體預刺激可抑制這一效應，提示il-22通過抑制esc和huvecs間交互對話，進而抑制huvecs對esc增殖的促進作用；本發(fā)明的體外實驗結果顯示il-22抗體明顯抑制內膜esc對血管內皮細胞活力、活化和血管生成的促進效應，并抑制esc增殖。實施例2構建ad小鼠模型健康新生雌性icr小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)，在出生后2-5日，口服給藥tamoxifen(他莫昔芬2.7umol/kg，溶于花生油/卵磷脂/濃縮牛奶混合液，體積比：2:0.2:3；復旦復華有限公司，上海)，給藥體積是5ul/g；對照組予以溶媒(花生油/卵磷脂/濃縮牛奶混合液)處理；90天后蘇木素染色檢測，結果顯示，ad小鼠肌層見內膜組織浸潤(如圖5b所示，箭頭所示異位病灶)，表明ad小鼠模型建立成功，對照組未見該現象(如圖5a所示)。實施例3動物實驗1)il-22中和性抗體處理組ad小鼠子宮重量降低建模成功后ad小鼠(90天)，繼續(xù)予以tamoxifen處理，實驗組腹腔注射給于抗鼠il-22中和性抗體(5ug/ml,總體積15ul/g)，每7天加強一次，共4次后，對照組給于生理鹽水處理，約d120，常規(guī)處理小鼠，并稱重小鼠子宮的重量，結果顯示，il-22抗體處理組ad小鼠子宮重量明顯降低，表明il-22抗體顯著縮小ad小鼠子宮大小如表1所示；表1：各組小鼠體重組別鼠齡(天)子宮重量(mg)對照ad組120±5221.98±7.03ad+α-il-22組120±5233.73±7.08*mean±sd；n＝6；*p<0.052)il-22中和性抗體處理組ad小鼠子宮血管密度和內膜增殖水平降低同上法處理ad小鼠，d120檢測兩組小鼠的血管密度和內膜增殖水平，如圖6所示，免疫組化染色顯示il-22抗體可明顯降低ad病灶的血管密度(如圖6a-c所示)；此外，采用leicaqwin圖像軟件系統(tǒng)分析各組ki-67陽性區(qū)域顯示，il-22抗體顯著下調病灶內膜ki-67水平(如圖6a，6b，6d所示)，表明il-22顯著抑制ad小鼠病灶血管生成和病灶生長；動物實驗結果證實，所述的il-22中和性抗體顯著抑制ad病灶血管密度和內膜增殖。本發(fā)明的體外和體內試驗結果證實，所述的il-22中和性抗體能明顯抑制ad病灶血管形成和內膜增殖生長，表明，所述的il-22中和性抗體具有的抗ad治療機制。當前第1頁12當前第1頁12